专利名称：血清丙型肝炎抗原(HCV Ag)定量ELISA检测技术的制作方法
技术领域：
体外生物医学诊断技术(定量ELISA技术)二、背景技术ELISA集中了抗原抗体反应的特异性和酶促反应的放大作用，理想的底物显示信号使其结果的判读更为客观、简单和快捷。本研究克隆、表达、纯化了HCV C、NS3、NS5抗原，免疫BALB/c小鼠，制备三种相应的单克隆抗体(McAb)，作为包被抗体及酶标抗体，用供血者血清、健康人群血清、HCV感染患者血清、其它肝炎或自身免疫患者血清、我国SDA HCV标准品、市售的其它公司的HCV标准品等检测了该试剂盒的特异性、敏感性及重复性，研制出符合国家标准的HCV Ag定量检测试剂盒，并以国际上公认的HCV RNA NASBA定量检测试剂盒作为对照，确定HCV Ag检测的最低浓度、HCV Ag定量与HCVRNA拷贝数间的关系，为HCV病情程度判断、疗效评价提供一个简便、价廉的检测手段。其关键技术为获得高度特异性、高亲和力的抗-HCVMcAb，用三种不同的McAb作为包被抗体及酶标抗体，确定最佳的ELISA工作条件，制备了高特异度、高敏感度、重复性好、定量准确的HCV Ag检测试剂盒。
发明内容
该技术选用抗-HCV C、NS3、NS5抗原McAb作为包被及酶标抗体，检测了各种HCV标准血清及临床血清，结果该试剂盒的特异性及敏感性为99.5％，重复性CV值＜10％，HCV Ag检测的最低含量为0.3pg/ml、1pg HCV Ag对应1800拷贝的HCV RNA。
具体实施例方式
HCV Ag ELISA定量检测的主要技术方案1.包被各取等量的纯化抗-HCV C、NS3、NS5 McAb混合后，用包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6)稀释后，按1.0μg抗体/100μl/孔包被酶标板，4℃包被12h。
2.封闭用3％BSA+0.05％Tween-20封闭14h。
3.加待测血清待测血清100μl(各种HCV血清标准品、HCV感染不同阶段的血清、其它肝炎及自身免疫疾病血清、治疗前后的系列血清等)用50μl裂解液预处理后，取100μl加入酶标孔，37℃1h。用已知浓度的HCV抗原倍比稀释(用正常人血清稀释)后作为阳性对照(最低稀释至0.1pg/ml)，以确定最低的检测浓度，绘制标准曲线。所有血清同时用抗-HCV EIA3进行抗-HCV抗体的检测。为确定HCV Ag水平与HCV RNA滴度间的关系，采用了NASBA定量检测试剂盒作为对照同时进行HCV RNA的定量，同时绘制HCV Ag吸光度值(A值)与HCV RNA拷贝数间(IU/ml)的对数曲线。
4.加酶标抗体抗-C、NS3、NS5 McAb用辣根过氧化物酶(HRP)标记，作为酶标二抗，100μl/孔，37℃1h。具体标记方法参照Wilson和Nakane的过碘酸钠氧化法42mg HRP溶于10.5ml ddH2O(浓度为4mg/ml)，取2.1ml 0.1mol/L NaIO4加入HRP溶液，室温轻搅避光放置20min，4℃对1mmol/L醋酸缓冲液(pH4.4)透析过夜，加入0.21ml0.2mol/L碳酸缓冲液(pH 9.5)调HRP-醛基溶液pH至9.2，立即加入10.5ml 8mg/ml的McAb(10mol/L碳酸缓冲液稀释，pH 9.5)，室温搅拌2h，加入1.05ml 4mg/ml NaBH4水溶液，4℃放置2h，电磁搅拌下逐滴加入等体积100％饱和硫酸铵溶液，4℃搅拌1h，静置30min，3000r/min离心20min，50％饱和硫酸铵溶液洗涤沉淀物2次，加入10.5ml PBS溶解沉淀物，4℃对PBS透析至萘氏试剂检测阴性，加入BSA至10mg/ml，分装，-70℃保存。
5.加底物显色以TMB作为底物，100μl/孔，37℃ 5min。
6.终止用2mol/L H2SO4终止显色反应，50μl/孔。
7.测定A450nm值在酶标仪上测定A450nm值。
8.判定结果根据被检血清(P)及阴性对照(N)的A450nm值，如P/N≥2.1，则确定为阳性。
9.HCV cAg标准品最低检测浓度及最大线性范围的确定根据阳性判定标准，首先确定HCV Ag最低检出浓度，根据HCV cAg不同浓度与吸光度值的线性关系确定检测最大线性范围，绘制吸光度值与HCV RNA拷贝数间的关系，确定1pg/ml HCV Ag对应多少拷贝或IU/ml的HCV RNA。
权利要求
血清丙型肝炎抗原(HCV Ag)定量ELISA检测技术是体外诊断生物试剂的一部分。该技术方案为选用抗-HCV C、NS3、NS5抗原McAb作为包被及酶标抗体，检测各种HCV标准血清及临床血清，确定该试剂盒的特异性及敏感性为99.5％，重复性CV值＜10％，HCV Ag检测的最低含量为0.3pg/ml、1pgHCV Ag对应1800拷贝的HCV RNA。要求权利保护1用抗-HCV C、NS3、NS5McAb作为包被抗体及酶标抗体制备血清HCV Ag ELISA检测试剂盒的技术要求保护；
2其它类似用抗-HCV C、NS3、NS5McAb组合制备的血清HCVAg ELISA检测试剂盒的方法也要求保护。
全文摘要
丙型肝炎血清抗原(HCV Ag)定量ELISA检测技术是体外生物诊断生的一部分。该技术选用抗－HCV C、NS3、NS5抗原McAb作为包被及酶标抗体，通过检测各种HCV标准血清及临床血清，确定该试剂盒的各种检测指标特异性99.5％、敏感性99.5％、重复性CV值＜10％、HCV Ag检测的最低含量为0.3pg/ml、1pg HCV Ag对应1800拷贝的HCVRNA。HCV Ag定量ELISA技术原理是双抗体夹心法酶免疫显色技术，先用三种HCV特异性抗体进行包被，与HCV血清中的HCV Ag抗原特异性反应，形成HCV Ag/Ab复合物，再与抗HCV特异性抗体反应，通过底物显色后来确定抗原的含量。同时用NASBA法测定血清HCV RNA的拷贝数，确定HCV Ag含量与HCV RNA的线性关系，为HCV感染的大规模筛查、早期诊断、疗效判定等提供良好的技术支持。
文档编号G01N33/535GK1502991SQ0215460
公开日2004年6月9日 申请日期2002年11月27日 优先权日2002年11月27日
发明者王虹, 王 虹 申请人:王虹, 王 虹