专利名称：一种定量检测血液中肿瘤相关抗原125的磁性免疫层析试纸条及制备方法
技术领域：
本发明属于医学检验领域，特别是涉及一种定量检测血液中肿瘤相关抗原125的 磁性免疫层析试纸条及制备方法。
背景技术：
肿瘤相关抗原125(CA125)，分子量可达220000 1000000之间，糖基含量仅占总 蛋白质量的24%。 CA125是由鼠抗人乳头状囊性卵巢上皮细胞系0C125制备而成。血清 CA125水平升高是肿瘤存在与复发的可靠指标。80 90%的卵巢上皮癌中CA125可明显升 高，子宫内膜癌、透明细胞癌、输卵管癌及未分化卵巢癌患者中CA125含量也可明显升高； 粘液性卵巢癌患者的阳性率则较低，CA125在卵巢包块良恶性的鉴别上特别有价值，敏感度 为78% 、特异性95% 、阳性预测价值82% 、阴性预测价值91 % 。 CA125和CEA联合测定，计 算两者比值，可提高卵巢癌检出的敏感性和特异性。非卵巢癌类的恶性肿瘤，如胰腺、肝、 胃、肠、子宫和乳腺癌症患者中CA-125的阳性率可分别高达73%、70%、53%、27%、22%和 20% 。然而CA-125血清浓度轻微上升还可见于1 %健康妇女，3 6%的良性卵巢疾患或非 肿瘤患者，包括孕期起始3个月、行经期、子宫内膜异位、子宫纤维变性、子宫肌瘤、良性卵 巢瘤、急性输卵管炎、急性胰腺炎、肝病、胸腹膜和心包感染等，应注意排除。但需要指出的 是以血清CA125水平升高来诊断复发的敏感性低于特异性，即血清CA125升高在很大程度 上提示复发，但正常的CA125既不表明无肿瘤存在也不表明无肿瘤进展。
目前的血液中CA125的诊断技术主要包括放射免疫分析(RIA)，酶联免疫分析 (ELISA)、化学发光免疫分析(CLIA)、时间分辨荧光免疫分析、胶体金免疫层析等方法，但这 些方法都有各自的特点及不足放射免疫是临床比较常用的方法，优点是结果比较准确，线 性范围较宽，缺点是操作繁琐，耗时长，且放射性标记物会对操作者产生危害，并且会产生 环境污染，目前已经逐渐被其他方法所替代。ELISA和化学发光以及时间分辨荧光法原理类 似，只是因为最终的检测系统有所区别而在灵敏度方面有差异，目前已经实现自动化、大批 量、定量检测，但是存在方法间结果差异大，线性范围较窄等缺点，同时，自动化检测目前由 国外大厂商所垄断，仪器设备昂贵，并且不适合单人份和较小批量检测用，大大限制了它们 在基层医院、诊所的应用。近年来出现了胶体金免疫层析法来检测CA125，快速，便捷，单人 份操作，但是缺点是只能实现半定量，只能指示一个大概范围，无法实现精确定量，异常标 本需要使用其他方法复核检测，增加了被测试者的就医成本，在市场推广方面有较大难度， 很难广泛使用。 磁性免疫层析(Mgnetic ImmunoChromatographic Test，MICT)是近年来出现的一 种单人份快速定量检测技术。是以超顺磁性颗粒(superPMPs)代替传统的标记物(胶体金， 乳胶颗粒等)来进行免疫层析，通过检测结合在超顺磁性纳米微粒上的生化物质来提供对 生物样品的定量检测数据。通过检测测量磁场强度来表达标记在样品区域的量，采用标记 的免疫复合物-磁场强度的标准曲线，从而达到定量的目的。该技术与传统技术相比具有
4下述优势1)分析灵敏度比各类目测快速诊断法灵敏10-100倍；2)分析速度可在15秒 内测量到多达6个分析位点的数据；3)线形范围在4个数量级浓度范围内呈线性；4)所用 磁性检测仪器采用固相元件，微型化设计自成一体，独立运行，体积小，操作简便；5)超顺 磁性纳米微粒由聚合物包被，不会随时间而衰变；独立的快速诊断色谱卡(MAR Cassette) 可直接插入MAR检测仪，为目前许多快速临床诊断试剂的整合提供了广泛的开发空间；而 且还避免了操作过程中人员或仪器可能发生的交叉污染，提高了分析和过程的安全性。该 技术继承了传统免疫层析法(胶体金，乳胶颗粒等)简便快速，单人份操作的优点，又弥补 了传统免疫层析技术灵敏度低，只能定性，不能定量的缺点，代表了当今即时检验(Point of Care Test，P0CT)技术发展的方向和潮流， 一经问世，发展迅速，目前已经成为替代传统 免疫层析技术的首选。 将异硫氰酸荧光素(FITC)引入磁性免疫层析中，在极大地提高了检测方法的灵 敏度的同时，又提供了一种极好的通用技术平台，在规模化生产中减少了标记步骤，减少了 可变因素。
发明内容
本发明的目的即是将磁性免疫层析技术和异硫氰酸荧光素(FITC)系统联合应用 在CA125定量检测试纸条中，将抗荧光素抗体共价偶联于超顺磁颗粒上，将FITC-CA125抗 体与之混合之后作为检测流动相，将另一株配对的CA125抗体包被于硝酸纤维素膜上作为 捕获固相，按照常规免疫层析法的原理进行标本的检测，结合简便易行的磁性检测仪进行 检测，在实现高灵敏度检测的同时既可以避免前述几种检测方法的种种弊端，又综合了前 述几种方法的优势可以单人份检测，也可以批量检测，并且可以即时给出定量结果，测量 仪器简单可靠，操作简便，方便实用。 为达到上述的目的，本发明的技术方案如下一种定量检测血液中CA125的磁性 免疫层析试纸条，该试纸条是在底板上依次相互交错2mm地粘贴上包被膜、结合了 CA125抗 体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫、然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成的试纸条，包被 膜上预包被有CA125抗体检测线T和质控线C。 其中所述的样品垫是经过样品垫处理液预处理的纤维素膜，所述的样品垫处理液 是含有1 % _5 %酪蛋白(Casein)和0. 1 % _1 %的聚乙烯醇(PVA)以及0. 01-0. 2 %吐温 20 (Tween-20)的0. 02M pH7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲液(PBS)。 上述定量检测血液中CA125的磁性免疫层析试纸条制备方法包括以下步骤
A、FITC-抗体的制备将CA125抗体对0. 02M pH7. 0_7. 6的PBS 4"透析过夜，调 整浓度为2mg/ml，将FITC使用二甲基甲酰胺溶解，终浓度为50mmol，以5 : 1的分子比例 向抗体溶液中加入所需量的FITC溶液，室温反应1小时，对0. 02M， pH7. 0_7. 6的PBS 4°C 透析过夜，加入等体积甘油后_201:保存备用。 B、磁颗粒的制备选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺(EDC)共价 偶联的方式将抗荧光素抗体标记到磁颗粒上，将标记好的FITC-抗体以1 : 2-1 : 5的分 子比例(摩尔比)与偶联抗荧光素抗体的磁颗粒混合，确保偶联抗荧光素抗体的磁颗粒过 C、将制备好的磁颗粒使用定量喷液装置以25 iU/cm-50 iU/cm的量喷涂于磁颗粒垫上； D、包被膜的制备使用包被缓冲液分别将抗CA125包被抗体以及FITC-BSA稀释到 0. 5-2mg/ml浓度，使用定量喷液装置分别将二者以0. 5_1. 0cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜 上，晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35度烘干8小时，加入干燥剂封存备用；
E、样品垫的处理将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出 25-35t:烘干8小时； F、试纸条的组装在透明塑料底板上依次相互交错2mm地贴上包被膜、磁颗粒垫、样 品垫、吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜得到试纸板，根据要求宽度切割即得到试纸条。
进一步，上述的步骤B包括以下三步 1)偶联抗荧光素抗体的磁颗粒的制备使用含有O. 1XTween-20的50mM， pH7. 0-7. 6的PBS洗涤磁颗粒，加入EDC和抗荧光素抗体使抗荧光素抗体与磁颗粒的分子 比例为5 : 1(摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0. 5XBSA的0. 02M，pH7. 0-7. 6的PBS 室温封闭30分钟，用上述PBS洗涤磁颗粒，使用含有1% PVP，1% Casein, 0. 5% Tween-20， 5%蔗糖的50mM(pH8. 2_9. 0)硼酸保存缓冲液复溶磁颗粒，fC保存备用；
2)FITC-CA125抗体的制备将CA125抗体对0. 02M， pH7. 0-7. 6的PBS 4"透析过 夜，调整浓度为2mg/ml，将FITC使用二甲基甲酰胺(DMF)溶解，终浓度为50mM，以5 : 1的 分子比例向抗体溶液中加入所需量的FITC溶液，室温反应1小时，对0. 02M， pH7. 0_7. 6的 PBS 4t:透析过夜，加入等体积甘油后-2(TC保存备用； 3)FITC_抗体与偶联抗荧光素抗体的磁颗粒的混合，以0. 5 ii 1/mg磁颗粒的量向
偶联抗荧光素抗体的磁颗粒溶液中加入FITC-CA125抗体，充分混匀后使用保存缓冲液以
1:5-1: 20的比例(体积比)将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用。 进一步，上述的步骤C中，磁颗粒的喷涂方法是将制备好的磁颗粒使用定量喷膜
装置以50iU/cm的量均匀喷涂于玻璃纤维上，冷冻干燥后加入干燥剂封存备用。 进一步，上述的步骤D中，包被膜的制备方法是用包被缓冲液(0. 02M pH 7. 2的
磷酸缓冲液)将CA125抗体稀释为0. 5mg/ml，FITC-BSA稀释为lmg/ml，使用定量喷膜装置
以liU/cm的量将二者以0. 6cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭
液(含有0. 5% BSA的0. 02M PBS，pH7. 0_7. 6)中浸泡10分钟后于25-35。C烘干8小时，加
入干燥剂封存备用。 与现有快速检测试纸条相比较，本发明具有以下优点 1)通过对试纸条的改进，首次将磁性免疫层析技术引入CA125的检测中，结合磁
性检测仪，实现了 CA125的单人份宽范围定量检测，为临床使用提供了极大便利。 2)通过引入异硫氰酸荧光素系统，使得试纸条的制备过程大大简化，适合大规模生产。 本发明操作简便，适合大规模生产，检测所需的便携式设备也已经上市，因此能广 泛用于医院、血站、防疫站、体检等大批量使用单位以及一些采血现场、农村和基层诊所等 小批量或单人份使用的单位使用。对于卵巢癌的定量诊断有着积极的意义。
图1为本发明磁性免疫层析法定量检测血液中CA125的试纸条结构示意图
为进一步说明本发明磁性免疫层析法定量检测血液中CA125的试纸条及制备方 法，特举以下的实施例进行说明，该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
具体实施例方式
本发明所述的定量检测血液中CA125的磁性免疫层析试纸条如图1所示，该试纸 条是在底板1)上依次相互交错2mm地粘贴上包被膜2)、结合了 CA125抗体的磁颗粒垫3)、 样品垫4)、吸水垫5)，然后在上层覆盖透明塑料密封膜6)组装而成的试纸条，包被膜2)上 预包被有CA125抗体检测线T和质控线C。 在具体实施例中，所采用CA125配对抗体为单克隆抗体技术制备的单抗。利用 双抗体夹心检测CA125抗原的原理检测标本，当待测标本中含有CA125抗原时，抗原会先 和磁颗粒上偶联的抗体结合，随着层析作用的进行，结合物向前移动到达CA125抗体包被 线T处，抗原会再次和包被抗体结合形成双抗体夹心复合物而聚集在T线处，另外，未结合 FITC-抗体的抗荧光素抗体标记磁颗粒会继续前行，到达指控线C时，FITC-BSA会与抗荧 光素抗体结合从而在C线处同样出现磁颗粒聚集。整个反应在30分钟内进行完全， 一般反 应十五分钟后即可进行上机读卡，T线以及C线都会产生相应的磁性信号值，磁性免疫层析 检测仪会根据检测卡上的二维码信息将实际测值代入预设的标准曲线即可得出确定量的 结果。整个读卡、识别二维码、将实测值代入预设标准曲线得出定量值的过程已经完全程序 化，磁性检测仪会直接给出定量结果。 本发明所述的定量检测血液中CA125的磁性免疫层析试纸条的制备方法见以下 实例 实施例1 定量检测血液中CA125的磁性免疫层析试纸条及试纸盒的制备方法
本实施例的试纸条及试纸盒的制备方法包括以下步骤 A、抗体制备选用商品化的的CA125配对抗体，对20mM， pH7. 2(pH7. 0-7. 6均适 用)的PBS 4t:透析过夜备用。 B、包被膜的制备 包被缓冲液的配制0. 02M pH 7. 2的磷酸缓冲液(PB)为包被缓冲液，0. 22 y m微
孔滤膜过滤除菌后置4t:保存备用，有效期两周。 封闭液的配制含0. 5% BSA的0. 02M， pH7. 2 (pH7. 0_7. 6均适用)的磷酸盐缓冲 液(PBS) ，0. 22 ii m微孔滤膜过滤除菌后置于4t:保存备用，有效期一周。
包被膜的制备用包被缓冲液(0. 02M PB，pH7. 2(pH7. 0-7. 6均适用))将CA125抗 体稀释为0. 5mg/ml，FITC-BSA稀释为lmg/ml，使用定量喷膜装置以1 y 1/cm的量将二者以 0. 6cm的间隔均匀喷印于3. 5cm宽度硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液(含有 0. 5% BSA的0. 02M PBS， pH7. 2 (pH7. 0_7. 6均适用))中浸泡10分钟后于25-35度烘干8
小时，加入干燥剂封存备用。
C、磁颗粒的制备 PBS缓冲液的配制用双蒸水和磷酸二氢钠及磷酸氢二钠配制pH值为 7. 4 (pH7. 0-7. 6均适用)，浓度为50mM的PBS，加入Tween-20至终浓度为0. 1 % ， 0. 22 y m微
孔滤膜过滤除菌后4t:保存备用，有效期两周。
硼酸保存缓冲液的配制用双蒸水，硼酸和硼砂配制pH为8. 5(pH8. 2_9. 0均适 用)，终浓度为50mM的硼酸缓冲液，加入PVP， Casine， Tween-20，蔗糖，终浓度分别为1%， 1 % ， 0. 5 % ， 5 % ， 0. 22 ii m微孔滤膜过滤除菌后fC保存备用，有效期一周。
偶联抗荧光素抗体的磁颗粒的制备使用含有0. 1 % Tween-20的50mM， pH7. 4 (pH7. 0-7. 6均适用)PBS洗涤磁颗粒，加入EDC和NHS使二者终浓度均为20mmol，室 温反应1小时，充分洗涤磁颗粒后，加入抗荧光素抗体使抗荧光素抗体与磁颗粒的分子比 例为5 : 1 (摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0. 5% BSA的0. 02M， pH7. 2 (pH7. 0_7. 6均 适用)的PBS室温封闭30分钟，使用含有0. 1% Tween-20的50mM，pH7. 4 (pH7. 0-7. 6均适 用)的PBS洗涤磁颗粒，使用含有1% PVP， 1% Casein, 0. 5% Tween-20， 5%蔗糖的50mMpH 8. 5 (pH8. 2-9. 0均适用)硼酸保存缓冲液，复溶磁颗粒，fC保存备用。
FITC-CA125抗体的制备方法是将CA125抗体对0. 02M， pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均 适用)的PBS 4t:透析过夜，调整浓度为2mg/ml，将FITC使用DMF溶解，终浓度为50mM， 以5 : 1的分子比例向抗体溶液中加入所需量的FITC溶液，室温反应1小时，对0.02M， pH7.2(pH7.0-7.6均适用)的PBS 4"透析过夜，加入等体积甘油后-2(TC保存备用。
FITC-抗体与偶联抗荧光素抗体的磁颗粒的混合，以0. 5iU/mg的量向偶联抗荧 光素抗体的磁颗粒溶液中加入FITC-CA125抗体，充分混匀后使用保存缓冲液以1 : 5的比 例将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用。
D、磁颗粒的喷涂与冻干 使用BioDot喷膜仪的专用喷头将处理好的磁颗粒以50 y 1/cm的量均匀喷涂于 0. 8cm宽度玻璃纤维垫上，过夜冷冻干燥，加入干燥剂封存备用，
E、样品垫的处理 将1. 8cm宽度样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35。C烘干 8小时。 样品垫处理液是含有1% -5% Casein和O. 1% _1 %的PVA以及O. 01-0. 2% Tween-20的0. 02M， pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均适用)的PBS溶液。
F、试纸条的组装及切割 下述所有操作都必须在湿度小于20%，温度20-25t:的房间内进行。试纸板的组装使用BioDot LM5000型组装仪按照要求将3. 5cm包被膜，2. 5cm吸
水纸，O. 8cm磁颗粒垫，1. 8cm样品垫组装于9. 8cm宽度透明塑料底板上，覆盖上层透明塑料
盖板，组装成试纸板。 试纸条的裁切使用BioDot CM4000型切条机将组装好的试纸板切成0. 5cm宽的 成品试纸条。 G、试纸卡的组装 将本发明所述的切割好的单人份试纸条置于塑料底卡上的卡槽内，盖上上盖，使 用压卡机将上下两片塑料卡压紧，确保整个试纸条处于绷紧状态。加入干燥剂室温封存备 用。 H、确定该批次的二维码信息
品名CA125定量磁性检测卡 批次试纸卡的组装日期，格式为年/月/日，XXXX/XX/XX
判读标准的确定取CA125标准抗原原料，以国家标准品为参照标准进行标定，用 标准品稀释液稀释成400U/mL， 200U/mL， 100U/mL， 50U/mL， 15U/ml，每个标准点作10个测 试，按照统计学方法确定每个标准点与磁性测量值的关系并建立方程使之拟合成线性，此 方程和标准曲线即可使磁性检测仪得以确定标本测量值。标准品稀释液配方20mmo1 PBS， pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均适用)，0. 5% BSA，O. 01%
NaN3。 1、二维码的打印粘贴 将上述二维码信息输入二维码打印机内并打印，将二维码粘贴于试纸卡的特定位 置，使用二维码粘贴位置检测器随机抽检2%确保二维码粘贴无误。
J、成品包装 将贴好二维码的单人份试纸卡与一包干燥剂密封于铝箔袋内，100人份为一个包 装置于一个包装盒内，一盒一份说明书和1瓶10ml装层析缓冲液即制成试纸盒，该试纸盒 于室温避光保存，保质期为18个月。 层析缓冲液配方为1% Tween-20，0. 5% Triton X_100， 1 % NP_40，0. 05% NaN3， 20mmolPBS， pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均适用)。
实施例2 除了偶联抗荧光素抗体的磁颗粒的制备的步骤中抗荧光素抗体使抗荧光素抗体 与磁颗粒的比例为l : 2，其它步骤同实施例1，
实施例3 除了偶联抗荧光素抗体的磁颗粒的制备的步骤中抗荧光素抗体使抗荧光素抗体 与磁颗粒的比例为l : IO，其它步骤同实施例1。
实施例4 除了 FITC-抗体与偶联抗荧光素抗体的磁颗粒的混合步骤中充分混匀后使用保 存缓冲液以l : 5的比例将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用，其它步骤同实施例1。
实施例5 除了 FITC-抗体与偶联抗荧光素抗体的磁颗粒的混合步骤中充分混匀后使用保 存缓冲液以l : 20的比例将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用，其它步骤同实施例1。
实施例6 本发明的检测卡的使用方法
1、加样 从包装盒中取出单人份的检测卡，撕开铝箔带包装，将试纸卡置于平整桌面上，用 微量移液器取50 1样本血清加入卡上的加样孔内，再加入50 1层析缓冲液，等待反应进 行15分钟。 2、测量及结果输出 将检测卡插入磁性免疫层析检测仪的插卡口 ，运行仪器，仪器会自行读取卡的二
维码信息，进行测量并即时打印测量结果，阴阳性结果会在打印结果中显示。 实施例7本发明的试纸条的方法学鉴定 按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试纸条进行检定，
(1)试纸条灵敏度实验
以SO校准品进行10次重复测定，其平均值加上两倍标准差带入曲线方程所得的 浓度值为试纸条的灵敏度，其灵敏度为2. 6U/mL。
(2)试纸条特异性实验 与其类似物作交叉反应实验，交叉反应率< 0. 01 % 。
(3)试纸条精密性实验
批内变异 取低、中、高三份质控血清样品分别进行IO孔平行实验，计算测定值的平均值(？) 和标准差(s)。按公式CV二s/iX100X计算变异系数，批内变异系数CV分别为6.3X， 4. 9%，4. 1%。
批间变异 选择5份不同浓度的血清样品对每份血清进行3次重复测定，计算其批间变异系 数(CV% )，批间变异CV在7. 21 9. 5%之间。
(4)试纸条稳定性实验 试纸条保存条件为18-26°C ，经过18个月的测定试纸条的各项指标均满足要求， 考虑到运输和使用过程中对试纸条的影响，我们进行37°C 7天的加速实验，实验结果表明 试纸条的各项指标完全符合要求。 说明"定量检测血液中CA125的磁性免疫层析试纸条及试剂盒"的灵敏度、特异 性、精密性和稳定性是完全合格的。
10
权利要求
一种定量检测血液中肿瘤相关抗原125(CA125)的磁性免疫层析试纸条，其特征在于该试纸条是在底板上依次相互交错2mm地粘贴包被膜、结合了CA125抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫、然后在上层覆盖透明塑料密封膜而组装成的试纸条，包被膜上预包被有CA125抗体的检测线T和质控线C。
2. 根据权利要求1的定量检测血液中CA125的磁性免疫层析试纸条，其特征在于所 述的样品垫是经过样品垫处理液预处理的纤维素膜，所述的样品垫处理液是含有1% _5% 酪蛋白和0. 1% _1%的聚乙烯醇以及0. 01-0. 2%吐温-20的O. 02M， pH7. 0-7. 6的磷酸盐 缓冲液。
3. 根据权利要求1的定量检测血液中CA125的磁性免疫层析试纸条制备方法，其特征 在于包括以下步骤A、 异硫氰酸荧光素(FITC)抗体的制备选用FITC进行CA125抗体的标记；B、 磁颗粒的制备选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺共价偶联的方 式将抗荧光素抗体标记到磁颗粒上，将标记好的FITC-抗体以1 : 2-1 : 5的分子比例(摩 尔比)与偶联抗荧光素抗体的磁颗粒混合，确保偶联抗荧光素抗体的磁颗粒过量；C、 将制备好的磁颗粒使用定量喷液装置以25 iU/cm-50 iU/cm的量喷涂于磁颗粒垫上；D、 包被膜的制备使用0. 02mM， pH7. 0_7. 6的PBS，分别将抗CA125包被抗体以及 FITC-牛血清白蛋白稀释到0. 5-2mg/ml浓度，使用定量喷液装置分别将二者以0. 5_1. Ocm 的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35t:烘干8小时，加 入干燥剂封存备用；E、 样品垫的处理将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35t:烘 干8小时；F、 试纸条的组装在透明塑料底板上依次相互交错2mm贴上包被膜，磁颗粒垫，样品 垫，吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜得到试纸板，根据要求宽度切割即得到试纸 条。
4. 根据权利要求3所述的磁性免疫层析法定量检测血液中CA125的试纸条的制备方 法，其特征在于所述的步骤A如下将CA125抗体对0. 02M pH7. 0-7. 6的PBS 4。C透析过夜，调整浓度为2mg/ml，将FITC 使用二甲基甲酰胺溶解，终浓度为50mmol，以5 : 1的分子比例向抗体溶液中加入所需量 的FITC溶液，室温反应1小时，对0. 02M，pH7. 0_7. 6的PBS 4"透析过夜，加入等体积甘油 后-2(TC保存备用。
5. 根据权利要求3所述的磁性免疫层析法定量检测血液中CA125的试纸条的制备方 法，其特征在于所述的步骤B包括以下两步1)偶联抗荧光素抗体的磁颗粒的制备使用含有O. 1 % Tween-20的50rnmo1， pH7. 0-7. 6的PBS洗涤磁颗粒，加入碳二亚胺和琥珀酰亚胺使二者终浓度均为20mmo1，室 温反应1小时，充分洗涤磁颗粒后加入抗荧光素抗体使抗荧光素抗体与磁颗粒的分子比为 5 : 1(摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0. 5XBSA的0. 02M，pH7. 0-7. 6的PBS室温封 闭30分钟，洗涤磁颗粒，使用含有1 % PVP， 1 % Case in ， 0. 5% Tween-20， 5%蔗糖的50,1， pH8. 2-9. 0的硼酸保存缓冲液，复溶磁颗粒，4t:保存备用；2)FITC-抗体与偶联抗荧光素抗体的磁颗粒的混合，以0.5iU/mg磁颗粒的量向偶 联抗荧光素抗体的磁颗粒溶液中加入FITC-CA125抗体，充分混匀后使用保存缓冲液以 1:5-1: 20的比例(体积比)将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用。
6. 根据权利要求3所述磁性免疫层析法定量检测血液中CA125的试纸条的制备方法， 其特征在于所述的步骤C中，磁颗粒的喷涂方法是将制备好的磁颗粒使用定量喷膜装置 以50iU/cm的量均匀喷涂于玻璃纤维上，冷冻干燥后加入干燥剂封存备用。
7. 根据权利要求3所述磁性免疫层析法定量检测血液中CA125的试纸条的制备方法， 其特征在于所述的步骤D中，包被膜的制备方法是用包被缓冲液将CA125抗体稀释为 0. 5mg/ml， FITC-BSA稀释为lmg/ml，使用定量喷膜装置以1 y 1/cm的量将二者以0. 6cm的 间隔喷印于硝酸纤维素膜上，室温晾干30分钟后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35t:烘干 8小时，加入干燥剂封存备用。
全文摘要
本发明涉及一种定量检测血液中肿瘤相关抗原125的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条是在底板上依次相互交错2mm粘贴上包被膜、结合了肿瘤相关抗原125抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成的试纸条，包被膜上预包被有肿瘤相关抗原125抗体检测线和质控线，本发明将磁性免疫层析技术和异硫氰酸荧光素系统引入到肿瘤相关抗原125的定量检测中，大大提高了检测灵敏度，并且可以准确的给出定量结果，操作简便，诊断快速。
文档编号G01N33/552GK101762699SQ20091008764
公开日2010年6月30日 申请日期2009年6月24日 优先权日2009年6月24日
发明者于尚永, 唐宝军, 应希堂, 李强, 胡国茂, 郑金来 申请人:北京科美东雅生物技术有限公司