专利名称：用双指示线免疫层析半定量诊断癌胚抗原的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种用双指示线免疫层析半定量诊断癌胚抗原的方法。
背景技术：
恶性肿瘤已成为危害人类健康的主要疾病，其中消化系统恶性肿瘤的发病高居首位。据国内有关临床调查显示，近年来大肠癌、结肠癌、肝癌和胰腺癌等消化系统恶性肿瘤在人群中发病率有所上升，消化系统恶性肿瘤约占所有肿瘤发病的60 70%，位居第一， 在死亡率“排行榜”上也是“名列前茅”，且呈年轻化趋势，因此开展消化系统肿瘤诊断治疗研究的重要性不言而喻。这表明，未来我国对于高质量的消化系统肿瘤诊断产品，尤其是 CEA诊断产品的需求将越来越大。大肠癌组织可产生一种糖蛋白，作为抗原引起患者的免疫反应。此种抗原称为癌胚抗原(carcinoembryonic antigen CEA)，可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌。在成年人胃肠道中也有少量合成，但不进入血液系统而是通过胃肠道排出，因此，在正常成年人血清中只有微量的癌胚抗原，浓度小于5ng/mL。在胃肠道肿瘤时，血清中的癌胚抗原会明显升高，如果血清中的癌胚抗原超过每升血20μ g，提示有胃肠道肿瘤。但是其他的恶性肿瘤如肺癌、胰腺癌、乳腺癌以及一些良性疾病如非特异性结肠炎、胶原性疾病、心血管疾病等也会升高。癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计，是一个较好的肿瘤标志物。临床上对CEA的检测常作为结肠癌、胃癌、直肠癌、食道癌等早期辅助诊断及癌症术后有无复发的检测指标。良性肿瘤，炎症和退行性疾病，如结肠息肉，溃疡性结肠炎，胰腺炎和酒精性肝硬变病人CEA也有部分升高，但远远低于恶性肿瘤，一般小于20ng/mL，CEA超过20ng/mL时往往提示有消化道肿瘤。所以测定CEA可以作为良性与恶性肿瘤的鉴别诊断依据。一些肿瘤如早期胃癌70%以上无明显症状，给早期诊断带来了困难，一旦临床上出现了明显症状，往往已属于病变的晚期。因此，早期发现并及时就诊成为提高治愈率的焦点问题，而目前，对于消化系统肿瘤的早期检测集中于癌胚抗原CEA这一特异性蛋白。较高的CEA水平意味着癌症也许会存在，这时就需要进行活检来确认诊断。目前，临床上常用的 CEA检测的方法为ELISA，CLIA等方法。上述方法费时、费力、不利于普及而且费用昂贵。开发简单、快速的癌胚抗原诊断方法具有十分重要的经济价值和社会意义。免疫胶体金技术是20世纪70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，现在已成功用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断制剂的制造等领域。目前金标记技术常与膜载体配合，形成特定的免疫检测方式，如免疫渗滤试验和免疫层析试验等。免疫层析试纸条就是此技术用于体外快速诊断的一个重要发展方向， 是在现代单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的新型检测技术。近年来该技术发展迅速，已经在临床诊断特别是床边检测(POCT)中得到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。利用胶体金的检测方 法测定血清中CEA作为结肠癌、胃癌、直肠癌、食道癌等早期辅助诊断及癌症术后有无复发的检测指标，已被开发，其检测下限为5ng/mL。但是对于临床上单独使用5ng/mL这一标准不能直接、快速区分良性与恶性肿瘤，所以开发能够检测CEA 5 20ng/mL这一 CEA诊断灰区的半定量胶体金试纸也是十分必要的。目前国内外均无相关的试纸条出售。
发明内容
本发明的目的开发简单、快速的癌胚抗原诊断方法具有十分重要的经济价值和社会价值。本实验采用胶体金免疫层析法，建立快速检测CEA的方法。并且能够半定量检测5ng/mL 20ng/mL这一 CEA灰区范围。本发明是通过以下技术方案实现的采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗CEA单克隆抗体1并均勻涂布于胶金垫上，作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上，两个不同浓度的CEA单克隆抗体2固定于两个检测线(即T线)，羊抗鼠二抗固定于质控线(即 C线)。依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装，剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据T线、C线显色与否来判断阴阳性结果。本发明方法包括如下步骤一、胶体金溶液配制1.配制氯金酸溶液；2.配制2%柠檬酸三钠溶液；3.将0. 02%的氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入2%的柠檬酸三钠2mL ；4.溶液由浅蓝色，深蓝，再加热出现酒红色，继续煮沸IOmin ；停止加热，继续搅拌至室温。二、胶体金标记物的制备1.取两个1. 5mL试管，分别加入ImL胶体金溶液；2.加入适量硼砂缓冲液把pH调整为8. 8 ；3.加入20μ g/mL CEA单克隆抗体1，使其达到最小蛋白浓度，混勻，振荡30min ；
4.加入 20 μ L 的 10 % BSA,混勻，振荡 30min ；5. 12000rpm离心5min，轻轻吸除上清；6.用ImL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；7.重复5.步操作；8.重复6.步操作；9.重复5.步操作；10.用fix buffer配制在540nm处OD (光密度)值为0. 5 1. 0的胶体金免疫复合物；11.玻璃纤维素膜点样，形成胶金垫，真空冻干3小时。三、在硝酸纤维素膜上划线
1. Tl线用浓度为0. 2mg/mL的CEA单克隆抗体2划线，用于检出5ng/mL的CEA ；2. T2线用浓度为0. lmg/mL的CEA单克隆抗体2划线，用于检出20ng/mL的CEA ；3. C线用3. 5mg/mL羊抗鼠多克隆抗体划线；4.将硝酸纤维素膜置于40°C烘箱干燥3天。四、胶体金试纸条的组装1.将样品垫、胶金垫、NC膜和吸收垫4部分按顺序组装(见附图1)；2.将其组装好后用剪刀剪成4mm/条后进行检测。五、检测试纸平放，将样品加到检测条的样本垫上，由于毛细效应，液体的层析方向向前， 与固定在τ线、C线上的物质发生结合被截留而显色。5min后，根据T线、C线的显色情况判定阴阳性结果。C线与靠近C线的检测带出现红色为样本中CEA水平大于5ng/mL(见附图2)，C线与两条检测带都出现红色为样本中CEA水平大于20ng/mL(见附图3)，只有C线出现红色的为阴性(见附图4)，T线和C线均不显色则试纸条无效。本发明检测对象单一且针对性强，准确率高。检测速度快，所需时间短，只需5min， 不需经培训的专业人员就可使用本发明方法来检测，满足医院、门诊等部门快速、准确地诊断消化系统肿瘤的要求，并且便于基层推广和运用。
图1为本发明实施例试纸条的图示图2为本发明实施例试纸条的阳性结果(CEA水平大于5ng/mL)图3为本发明实施例试纸条的阳性结果(CEA水平大于20ng/mL)图4为本发明实施例试纸条的阴性结果
具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实例先用2%的柠檬酸三钠溶液制备20nm的金水，并标记CEA单克隆抗体1，按金标单克隆抗体、CEA单克隆抗体2、羊抗鼠多克隆抗体喷金标垫、检测线(T线)、质控线(C 线)，然后组装成试纸条，置37°C烘箱烘干并裁成4mm/条，室温干燥保存备用。实施例1.准备CEA单克隆抗体1和2。并清洗实验所需的玻璃器皿。2.胶体金的制备先将0. 02 %氯金酸溶液溶液加热煮沸，迅速加入2 %的柠檬酸三钠2mL ；溶液颜色由浅蓝色变为深蓝，继续加热出现酒红色，继续煮沸IOmin ；出现透明的酒红色，停止加热，继续搅拌至室温。这样就制备了 20nm的胶体金溶液。然后用电镜镜检， 确保制备的金颗粒尽量使其大小一致、均勻，颗粒直径在20nm左右，否则重新制作。
3.胶体金标记物的制备取两个1. 5mL试管，分别加入ImL胶体金溶液；向其中加入适量硼砂缓冲液把pH 调整为8.8 ；加入20yg/mL CEA单克隆抗体1，使其达到最小蛋白浓度，混勻，于振荡仪上快速振荡30min ；加入20 μ L的10% BSA,混勻，振荡30min ；于离心机中12000rpm,离心5min， 轻轻吸除上清；用ImL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；于离心机中12000rpm， 离心5min，轻轻吸除上清；用ImL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；于离心机中12000rpm，离心5min，轻轻吸除上清；用fix buffer配制在540nm处OD (光密度)值为 0. 5 1. 0的胶体金免疫复合物；在玻璃纤维素膜上点样，形成胶金垫，真空冻干3小时。4.胶体金试纸条的组装分别将0. 2mg/mL和0. lmg/mL的CEA单克隆抗体2划在硝酸纤维素膜的检测线(T 线)上，将3.5mg/mL羊抗鼠多克隆抗体划在质控线(C线)上。然后将硝酸纤维素膜置于烘箱中40°C干燥3天。然后将各个部分按附图1组装成试纸条。5.胶体金试纸条的使用及结果判读检测前，先提取被检者的血清样本。然后把试纸条试纸平放，将样品加到检测条的样本垫上，由于毛细效应，液体的层析方向向前，与固定在τ线、C线上的物质发生结合被截留而显色。5min后，根据T线、C 线的显色情况判定阴阳性结果。C线与靠近C线的检测带出现红色为样本中CEA水平大于 5ng/mL(见附图2)，C线与两条检测带都出现红色为样本中CEA水平大于20ng/mL(见附图 3)，只有C线出现红色的为阴性(见附图4)，T线和C线均不显色则试纸条无效。实施例可直接检测样品中的CEA，使用方法不需要专业培训，操作方便、快速，5min 即可获得结果，可达到快速、简便、及时地检测CEA的目的。
权利要求
1.一种用双指示线免疫层析半定量诊断癌胚抗原的方法，其特征在于，采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗CEA单克隆抗体1并均勻涂布于胶体金垫上，作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上，两个不同浓度的CEA单克隆抗体2固定于两个检测线(即T线)， 羊抗鼠二抗固定于质控线(即C线)。依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装，剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据T线、C线显色与否来判断阴阳性结果。
2.根据权利要求1所述的一种用双指示线免疫层析半定量诊断癌胚抗原的方法，其特征在于，抗体划线浓度为Tl线用浓度为0. 2mg/mL的CEA单克隆抗体2划线，用于检出5ng/mL的CEA ； T2线用浓度为0. lmg/mL的CEA单克隆抗体2划线，用于检出20ng/mL的CEA ； C线用3. 5mg/mL羊抗鼠多克隆载体划线； 将硝酸纤维素膜置于40°C烘箱干燥3天。
3.根据权利要求1所述的一种用双指示线免疫层析半定量诊断癌胚抗原的方法，其特征在于，运用不同浓度的抗体溶液在相同的基质上划线，以胶体金方法检测多个不同浓度水平物质的方法。
全文摘要
本发明公开了一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种用双指示线免疫层析半定量诊断癌胚抗原的方法。癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计，是一个较好的肿瘤标志物。临床上对CEA的检测常作为结肠癌、胃癌、直肠癌、食道癌等早期辅助诊断及癌症术后有无复发的检测指标。目前，临床上常用的CEA检测的方法为ELISA，CLIA等方法。上述方法费时、费力、不利于普及而且费用昂贵。免疫胶体金技术近年来发展迅速，得到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。本发明采用胶体金免疫层析法，建立快速检测CEA的方法，并且能够半定量检测5ng/mL～20ng/mL这一CEA灰区范围，测定CEA可以作为良性与恶性肿瘤的鉴别诊断依据。
文档编号G01N33/577GK102221612SQ20111015444
公开日2011年10月19日 申请日期2011年6月10日 优先权日2011年6月10日
发明者刘寅, 岳晓燕, 张有青, 王晶, 罗云萍, 霍五奎, 马雪明 申请人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司