丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体指一种丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎由丙肝病毒（HCV)引起，分布极广，容易演变为慢性肝炎、肝硬化和肝 癌。
[0003] 现有技术中公开了一种丙型肝炎病毒吸附剂及其制备方法与应用，该方法采用丙 型肝炎病毒亲和的DNA单链配基与微球相连，通过DNA单链配基特异性结合丙型肝炎病毒 包膜蛋白，从而达到清除血液中丙型肝炎病毒的目的。
[0004] 目前制备该类型吸附剂所常用的微球是琼脂糖微球、聚乙烯醇微球、壳聚糖微球 等，与微球相连的配基有DNA单链，蛋白等。在制作微球时，有的微球会需要先用酸、碱预处 理，然后采用试剂活化微球表面，有的直接则是直接活化；然后再加入交联剂或者偶联剂连 接微球和配基，交联剂（偶联剂）上的功能基团如羟基和配基上的氨基发生反应，使配基结 合在微球上。但是这些吸附剂在使用中，随着时间推移，会有不同程度的配基脱落发生，而 且容易受到温度、水流等环境影响，可能是由于配基与交联剂之间的结合发生了逆向反应 而脱落，当配基脱落后血液中，可能引起免疫反应，具有一定的安全风险。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中制备的丙型肝炎病毒吸附剂上配基容易脱落 的缺陷，提供一种操作简单、能大幅度提高配基结合牢固度的丙型肝炎病毒吸附剂的制备 方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明所设计的丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，包括以下步 骤：
[0007] 1)准备与丙型肝炎病毒亲和的配基，及作为载体的微球；
[0008] 2)活化微球表面基团；
[0009] 3)利用交联剂使所述配基结合在微球上，得到病毒吸附微球；
[0010] 4)在溶液环境下，向病毒吸附微球中添加氨基酸，氨基酸添加重量与配基的重量 比大于2. 5 :1000,待氨基酸结合到病毒吸附微球上后，洗去多余的氨基酸，得到丙型肝炎 病毒吸附剂。
[0011] 优选地，所述氨基酸选自赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮 氨酸、缬氨酸、组氨酸、甘氨酸中一种或几种的混合。小分子性质稳定的氨基酸均可以采用， 实验结果显示混合的氨基酸效果优于单一的氨基酸，特别是大小不均等的氨基酸组合对配 基的固定效果较好。
[0012] 优选地，所述配基为单链脱氧核糖核酸配基，所述微球为玻璃微球，所述氨基酸为 组氨酸：甘氨酸：赖氨酸=1:0. 7:3. 5的混合物。
[0013] 优选地，所述步骤4)中，向病毒吸附微球中添加氨基酸后，使氨基酸结合到病毒 吸附微球上的条件为，于25~40°C的环境中，静置含有病毒吸附微球与氨基酸的溶液30分 钟以上。适宜的温度可以促进氨基酸结合到微球上去。
[0014] 优选地，所述步骤4)中，洗去多余的氨基酸所采用的洗涤液为PBS。
[0015] 本发明原理：微球经过处理活化后其上基团暴露通过交联剂与配基相连，但是该 连接受多种因素影响，加入的氨基酸起到了封闭裸露基团的作用，对未参加反应的微球及 交联剂上裸露的基团进行共价结合的过程，可能也影响了配基上的功能基团与交联剂的结 合部位，加固了配基与交联剂之间的结合，使配基不容易从微球上脱落。理论上，氨基酸封 闭对多种配基都有效，而在实验中发现，对单链DNA分子的固定效果比体积较大的抗体蛋 白效果好。
[0016] 本发明的有益效果：通过采用氨基酸处理已连接了配基的病毒吸附微球，使其上 的配基结合更牢固，降低了丙型肝炎病毒吸附剂脱落的几率和速率，提高了丙型肝炎病毒 吸附剂在应用时的安全性。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解 释而本发明并不局限于以下实施例。
[0018] 实施例1
[0019] 丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
[0020] 1)制备与丙型肝炎亲和的单链脱氧核糖核酸配基及作为载体的玻璃微球；
[0021] ①配基的序列为：
[0022] 5 ' -gggatccccgCGCCCTAGGATACTGCGTAACTGGGAGTCGCTTCCTCGATCTAATAAGGAGTAAGC CGAGCCTGACAAGGGATATCACTCAGCATAATCTTAAGGCGaacgcgtctg-3'
[0023] 上述配基如何制备为已公开的现有技术，本申请中不做赘述。
[0024] ②玻璃微球表面预处理：用65 %浓硝酸煮洗平均直径85 μ m玻璃微球10分钟，再 用蒸馏水洗（去离子水洗3次，蒸馏水洗2次，每次2分钟），放入37°C烘箱烘干。
[0025] 2)活化玻璃微球表面基团：取双蒸水、丙酮（分析纯）、硅烷化偶联剂（γ -氨基丙 基三乙氧基硅烷（APTES)按体积比15:280:6的比例配制成APTES活化溶液，再将玻璃微球 浸入其中2小时；用丙酮洗涤玻片5次（5min/次），再将微球表面烘干。
[0026] 3)将单链脱氧核糖核酸配基纯化后通过化学交联的方法连接到上玻璃微球上：
[0027] ①把活化的微球放入0· 2wt % TOC (重铬酸吡啶）溶液，置于烘箱中2小时（维持 温度37°C );从roc中取出微球，先用甲醇洗涤5次（5min/次），再用丙酮洗涤2次，最后 用双蒸水洗涤一次，晾干；
[0028] ②将单链脱氧核糖核酸配基于100°C加热5min，迅速冰浴90秒，随后与微球混合 以微球体积（mL):单链DNA重量比（mg)为1 :20的比例混合，得到结合了配基的病毒吸附 微球溶液。
[0029] 4)向病毒吸附微球溶液中添加甘氨酸，甘氨酸添加重量与配基的重量比为1 : 100,于恒温37°C水浴箱上静置30分钟，再于恒温37°C水浴箱上微震荡下PBS(0.0 lM pH 8. 0)洗3次，洗去多余的氨基酸，得到丙型肝炎病毒吸附剂1，然后室温晾干、备用。
[0030] 实施例2
[0031] 丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
[0032] 1)制备与丙型肝炎亲和的单链脱氧核糖核酸配基及作为载体的玻璃微球；
[0033] ①配基的序列为：
[0034] 5，-gggatccccgCGCCCTAGGATACTGCGTAACTGGGAGTCGCTTCCTCGATCTAATAAGGAGTAAGC CGAGCCTGACAAGGGATATCACTCAGCATAATCTTAAGGCGaacgcgtctg-3'
[0035] 上述配基如何制备为已公开的现有技术，本申请中不做赘述。
[0036] ②玻璃微球表面预处理：用65 %浓硝酸煮洗平均直径85 μ m玻璃微球10分钟，再 用蒸馏水洗（去离子水洗3次，蒸馏水洗2次，每次2分钟），放入37°C烘箱烘干。
[0037] 2)活化玻璃微球表面基团：取双蒸水、丙酮（分析纯）、硅烷化偶联剂（γ -氨基丙 基三乙氧基硅烷（APTES)按体积比15:280:6的比例配制成APTES活化溶液，再将玻璃微球 浸入其中2小时；用丙酮洗涤玻片5次（5min/次），再将微球表面烘干。
[0038] 3)将单链脱氧核糖核酸配基纯化后通过化学交联的方法连接到上玻璃微球上：
[0039] ①把活化的微球放入0· 2wt % roc (重铬酸吡啶）溶液，置于烘箱中2小时（维持 温度37°C );从roc中取出微球，先用甲醇洗涤5次（5min/次），再用丙酮洗涤2次，最后 用双蒸水洗涤一次，晾干；
[0040] ②将单链脱氧核糖核酸配基于100°C加热5min，迅速冰浴90秒，随后与微球混合 以微球体积（mL):单链DNA重量比（mg)为1 :20的比例混合，得到结合了配基的病毒吸附 微球溶液。
[0041] 4)向病毒吸附微球溶液中添加氨基酸混合物，混合物为组氨酸：赖氨酸=1:1， 氨基酸与配基的重量比为=1:200,于恒温30°C水浴箱上静置1小时，再用PBS (0.0 lM pH 8. 0)洗3次，洗去多余的氨基酸，得到丙型肝炎病毒吸附剂2,然后室温晾干、备用。
[0042] 实施例3
[0043] 丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
[0044] 1)制备与丙型肝炎亲和的单链脱氧核糖核酸配基及作为载体的玻璃微球；
[0045] ①配基的序列为：
[0046] 5，-gggatccccgCGCCCTAGGATACTGCGTAACTGGGAGTCGCTTCCTCGATCTAATAAGGAGTAAGC CGAGCCTGACAAGGGATATCACTCAGCATAATCTTAAGGCGaacgcgtctg-3'
[0047] 上述配基如何制备为已公开的现有技术，本申请中不做赘述。
[0048] ②玻璃微球表面预处理：用65 %浓硝酸煮洗平均直径85 μ m玻璃微球10分钟，再 用蒸馏水洗（去离子水洗3次，蒸馏水洗2次，每次2分钟），放入37°C烘箱烘干。
[0049] 2)活化玻璃微球表面基团：取双蒸水、丙酮（分析纯）、硅烷化偶联剂（γ -氨基丙 基三乙氧基硅烷（APTES)按体积比15:280:6的比例配制成APTES活化溶液，再将玻璃微球 浸入其中2小时；用丙酮洗涤玻片5次（5min/次），再将微球表面烘干。
[0050] 3)将单链脱氧核糖核酸配基纯化后通过化学交联的方法连接到上玻璃微球上： [0051 ] ①把活化的微球放入0. 2wt % roc (重铬酸吡啶）溶液，置于烘箱中2小时（维持 温度37°C );从roc中取出微球，先用甲醇洗涤5次（5min/次），再用丙酮洗涤2次，最后 用双蒸水洗涤一次，晾干；
[0052] ②将单链脱氧核糖核酸配基于100°C加热5min，迅速冰浴90秒，随后与微球混合 以微球体积