用于检测丙型肝炎病毒的核心抗原片段及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于检测丙型肝炎病毒的核心抗原片段及其应用。使用雅培Architect HCV核心抗原定量试剂盒检测不同HCV基因型血清样本的抗原水平，比较检测不同基因型的灵敏度，分析影响检测灵敏度的特定基因型的样本，寻找到影响试剂盒检测灵敏度的核心抗原的多态性位点，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。该核心抗原多态性位点的氨基酸片段可作为HCV核心抗原检测的分子标记用于检测丙型肝炎病毒3b基因型，且该分子标记的存在能够指示现有的抗原定量检测试剂盒在检测丙型肝炎病毒3b基因型样本时灵敏度降低，有助于核心抗原检测的规范化与标准化，可用于制备检测HCV 3b基因型的试剂盒。
【专利说明】用于检测丙型肝炎病毒的核心抗原片段及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒检测领域，特别是涉及用于检测丙型肝炎病毒的核心抗原片段及 其应用。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV)持续感染导致的慢性丙型肝炎（chronic h印atitis C，CHC) -直是全球性的公共卫生问题。CHC发病隐匿，容易被患者忽视，可导致 肝硬化甚至肝细胞肝癌和肝功能衰竭，对人类的健康构成严重威胁。因此，HCV感染的筛查 和早期治疗显得尤为重要。我国常见的丙型肝炎基因型主要有lb，2a，3a，3b和6a基因型。
[0003] 抗HCV检测是应用最广的HCV感染筛查试验，操作简便、耗时短、成本低，但其缺 点是窗口期较长，不能判别是活动性感染还是病毒已被清除，不适用于免疫缺陷人群；HCV RNA是病毒感染的直接证据，HCV RNA定量检测也是CHC患者抗病毒治疗过程中疗效监测的 关键指标，但其缺点在于：操作复杂，耗时长，需要使用特定仪器设备、在特定的实验室空间 进行操作，易产生交叉污染和气溶胶污染，不适于小型实验室开展。相比抗HCV和RNA检测， HCV核心抗原检测集合了上述两种检测的优点，即操作简便，耗时短，易于实现自动化，检测 精密度高，被污染的可能性大大降低，同时，作为一个病毒复制的直接标志物，当免疫功能 受损或缺陷的群体如艾滋病患者、长期接受透析的肾病患者、器官移植患者或先天性免疫 功能缺陷患者筛查HCV感染时，不宜选择抗-HCV检测，可选择核心抗原检测。也有研究提 示，干扰素联合利巴韦林治疗CHC早期监测HCV抗原水平可用于预测SVR。
[0004] 虽然HCV核心抗原检测有诸多优势，但血清中HCV抗原含量很低，因此对检测技术 的要求很高。近几年随着化学发光法等免疫学检测技术的发展和成熟，灵敏、定量且适合自 动化检测的HCV抗原检测试剂已经研发成功，国际主流的雅培公司Architect HCV Ag试剂 盒采用cll-9和cll-14两种单克隆抗体作为检测抗体，对应的表位分别为HCV核心抗原氨 基酸 21-40 片段（DVKFPGGGQIVGGVYLLPRR)和核心抗原氨基酸 41-50 片段（GPRLGVRATR)。 雅培Architect HCV Ag检测试剂盒，可用于早期诊断HCV感染，也可用于监测CHC抗病毒治 疗中的病毒学应答，已广泛应用于HCV诊断与治疗领域，是目前国际上使用最广泛的HCV抗 原检测试剂盒。但在临床检测实践中，出现一些特定基因型的样本，虽然其HCV RNA浓度较 高，表明病毒处于活动复制期，但使用该试剂盒对HCV核心抗原定量，结果却为"阴性"，这 说明目前的检测HCV试剂盒仍然存在针对某些样本出现假阴性问题，即其对某些阳性HCV 样本的检测灵敏度明显降低，但未有报道指出造成这些标本检测灵敏度降低的原因。
[0005] 对样本中HCV的正确诊断对于早期丙型肝炎病毒感染患者的早期干预与治疗具 有重要的指导意义，若能够克服现有试剂盒出现检测某些标本灵敏度降低的情况，则有助 于HCV的早期诊断和治疗。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的在于提供用于检测丙型肝炎病毒的核心抗原片段。
[0007] 本发明的第二个目的在于提供该核心抗原片段的应用。
[0008] 本发明使用Architect HCV Ag试剂检测中国CHC患者血清的HCV抗原，通过检测 不同HCV基因型血清样本的抗原水平，比较检测不同基因型的灵敏度，对影响检测灵敏度 的特定基因型的样本，进一步检测其核心抗原的氨基酸序列21-50片段（DVKFPGGGQIVGGV YLLPRRGPRLGVRATR)， 申请人:发现在核心抗原氨基酸21-50区域，存在多处氨基酸多态性位 点，D21N，L36V 和 T49V 共存或 D21N，L36V，P42L 和 T49V 共存时可影响雅培 Architect HCV Ag试剂盒的检测性能，造成其检测灵敏度降低。而上述两种氨基酸多态性均出现在丙型肝 炎病毒的3b基因型中。
[0009] 因此，本发明提供了用于检测丙型肝炎病毒的核心抗原片段，其氨基酸序列含有 如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示的氨基酸片段。即：
[0010] SEQ ID N0:1 ：NVKFPGGGQIVGGVYVLPRRGLRLGVRAVR
[0011] SEQ ID N0:2 :MKFPGGGQIVGGVYYLPRRGPRLGVRAYR 上述具有氨基酸多态性的片段 可作为分子标记用于检测丙型肝炎病毒，尤其可用于检测3b基因型丙型肝炎病毒。为表述 方便，本申请所述的氨基酸多态性"模式1"为SEQ ID NO. 1所示的氨基酸片段，"模式2"为 SEQ ID NO. 2所示的氨基酸片段。
[0012] 编码上述2个核心抗原片段的基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6所示。
[0013] 含有SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6所示基因的表达载体在制备丙型肝炎病毒检测 试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
[0014] 本发明还提供了上述核心抗原片段在制备3b基因型丙型肝炎病毒诊断试剂盒中 的应用。当检测到的抗原片段氨基酸序列含有如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示的序列 时，被检测病毒为HCV 3b基因型。
[0015] 本发明提供了上述核心抗原片段或其编码基因在制备3b基因型丙型肝炎病毒抗 体诊断试剂中的应用。
[0016] 上述核心抗原片段在制备3b基因型丙型肝炎疫苗中的应用也属于本发明的保护 范围。
[0017] 本发明还提供一种单克隆抗体，其对应的抗原表位含有SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
[0018] 分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株也属于本发明的保护范围。
[0019] 本发明提供了上述核心抗原片段在制备鉴定丙型肝炎病毒3b基因型与其他基因 型的试剂盒中的应用，当检测到的抗原片段氨基酸序列含有如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2 所示的序列时，被检测病毒为HCV 3b基因型。
[0020] 本发明提供了含有本发明所述核心抗原片段的检测丙型肝炎病毒的试剂盒。
[0021] 含有任何能够扩增SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6所述基因的引物对的用于制备检 测丙型肝炎病毒的试剂盒也属于本发明的保护范围。
[0022] 优选地，上述检测丙型肝炎病毒的试剂盒为检测3b基因型丙型肝炎病毒的试剂 盒。
[0023] 本发明发现了现有技术检测丙型肝炎病毒的试剂盒其检测HCV的核心抗原氨基 酸21-50区域，存在多处氨基酸多态性位点，造成其检测灵敏度降低，而上述两种氨基酸多 态性均出现在丙型肝炎病毒的3b基因型中。这就意味着现有技术对丙型肝炎病毒的3b基 因型的检测灵敏度不高，容易出现假阴性结果。本发明创造性地发现了上述核心抗原多态 性位点的氨基酸片段可作为HCV核心抗原检测的分子标记用于检测丙型肝炎病毒3b基因 型，并且该分子标记的存在能够指示现有的抗原定量检测试剂检测灵敏度降低，有助于HCV 核心抗原检测的规范化与标准化，可用于制备检测HCV 3b基因型的试剂盒，有利于弥补现 有试剂盒检测HCV灵敏度不足的缺陷，进一步完善现有技术中的检测丙型肝炎病毒的试剂 盒的检测灵敏度和准确度，使之更加广谱有效。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为不同基因亚型慢性丙型肝炎患者血清HCV核心区氨基酸序列比较图（从核 心抗原第21位至50位氨基酸），最左列编号为样本编号及其基因型。
[0025] 图2为哺乳动物细胞HEK293T表达的FLAG-HCV核心蛋白多肽（包含氨基酸多态 性位点）western blot确认结果。**为包含氨基酸多态性"模式1"的3b基因型样本；*为 包含氨基酸多态性"模式2"的3b基因型样本。
[0026] 图3为雅培Architect HCV抗原定量检测各基因型HEK293T表达产物的结果比较。 **为包含氨基酸多态性"模式1"的3b基因型样本；*为包含氨基酸多态性"模式2"的3b 基因型样本。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0028] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0029] 实施例1不同HCV基因型样本核心抗原水平的比较
[0030] 1、病例选择
[0031] 2011年3月至6月，收集203例CHC患者血清，其中男性130例，女性73例，年龄 24-76岁，平均（37. 3±8. 6)岁。HCV基因型使用 Versant HCV Genotype 2. 0(LiPA，西门子 公司，马尔堡，德国）检测，其中基因型Ib为41例，2a为43例，3a为31例，3b为43例，6a 为45例，基本涵盖中国常见基因型。HCV RNA使用罗氏Taqman HCV RNA试剂盒定量，最低 检测限为15IU/mL。不同HCV基因型患者在年龄、性别和HCV病毒载量具有可比性。
[0032] 2、方法
[0033] 使用雅培Architect HCV Ag核心抗原定量检测试剂盒，在雅培Architect i2000全自动化学发光仪上进行HCV抗原定量检测。定量检测的线性范围为3.00fmol/ L-20000fmol/L，最低检测限为3. 00fmol/L。分别使用单因素方差分析法和LSD法进行整体 均数的比较和各组均数的多重比较，P〈〇. 05为差异有显著性意义。
[0034] 3、结果
[0035] 不同基因型患者组HCV抗原定量结果见表1。结果显示，3b基因型抗原水平低于 其他基因型。
[0036] 表1不同基因型患者血清HCV核心抗原水平比较
[0037]
【权利要求】
1. 用于检测丙型肝炎病毒的核心抗原片段，其特征在于，其氨基酸序列含有如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示的氨基酸片段。
2. 如权利要求1所述的用于检测丙型肝炎病毒的核心抗原片段，其特征在于，所述丙 型肝炎病毒为HCV 3b基因型。
3. 编码权利要求1所述的核心抗原片段的基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 5或 SEQ ID NO. 6 所示。
4. 权利要求1所述的核心抗原片段或权利要求3所述的基因在制备丙型肝炎病毒诊断 试剂盒中的应用。
5. 含有权利要求3所述基因的表达载体在制备丙型肝炎病毒诊断试剂盒中的应用。
6. 权利要求1所述的核心抗原片段在制备3b基因型丙型肝炎病毒抗体诊断试剂中的 应用。
7. 权利要求1所述的核心抗原片段在制备3b基因型丙型肝炎疫苗中的应用。
8. -种单克隆抗体，其特征在于，其对应的抗原表位含有SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列。
9. 分泌权利要求8所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
10. 含有扩增权利要求3所述基因的引物对的检测丙型肝炎病毒的试剂盒。
【文档编号】G01N33/569GK104374915SQ201410601946
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】杨瑞锋 申请人:北京大学人民医院