专利名称：全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因重组抗体药物技术领域，具体而言，涉及全人源基因重组Fab抗体，尤其涉及特异地针对丙型肝炎核心抗原的基因工程Fab抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
丙型肝炎病毒(Hepatitis Virus C type, HCV)是一种能够引起人类非甲非乙型肝炎的RNA病毒，其主要经血液途径传播，据统计目前全世界约有1.7亿HCV的感染者，我国的丙型肝炎感染者已经超过4000万。目前还没有针对HCV的有效疫苗用以预防丙型肝炎的传播，因此为防止医源性 的丙型肝炎的传染，HCV感染的诊断和血液制品生产相关领域的筛查，对于阻止HCV的传播具有重要的意义。目前，国内外针对丙型肝炎的诊断试剂盒分为两种，一种是检测病人血液或其它样品中存在的HCV病毒基因组，而采用RT-PCR方法进行定量检测；另一种则采用免疫学方法检测样品中的HCV相关的抗原和或抗体。针对抗HCV病毒相关的抗体类试剂盒在检测HCV感染的“窗口期”约70-80天；而针对HCV核心抗原的，用抗HCV核心抗原的单抗的双抗体夹心法检测样品中存在的HCV核心抗原，使检测HCV感染的“窗口期”提高至14天，但两种试剂盒均各有优缺点。单克隆抗体技术、基因重组抗体技术已经是比较成熟的技术，并且通过杂交瘤技术已经制备了多种针对HCV的单克隆抗体。也有采用噬菌体展示技术，构建了针对HCV的抗体库。我们通过噬菌体技术从HCV感染者中分离外周血单个核细胞，建立了相应的抗HCV抗体展示库，并从该库中筛选到能够与HCV核心抗原具有高亲和力的噬菌体颗粒，并通过基因克隆技术获得相应的抗体基因，采用全人源抗体基因工程表达技术，在大肠杆菌中实现全人源Fab抗体的表达。利用本方法制备的Fab抗体可能作为HCV诊断试剂盒的组分用于诊断试剂盒的开发，并且该Fab抗体可能具有治疗HCV的潜在价值。
发明内容
本发明通过基因重组技术，克隆抗HCV核心抗原的抗体基因，表达并分离纯化全人源抗HCV核心抗原的基因工程Fab抗体，并将该抗体用于研制HCV诊断试剂盒，尤其是用于早期复查HCV感染的HCV核心抗原的检测。因此，本发明的目的在于提供一种全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体及其制备方法和应用、编码该Fab抗体的DNA分子、包含该DNA分子的表达载体，以及被该表达载体转化的原核宿主细胞。本发明的目的是这样实现的:一种全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其中:(I)重链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；
(2)轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。一种DNA分子，编码上述的基因工程Fab抗体的重链或/和轻链。在本发明的一个较佳的实施例中，上述的DNA分子编码所述基因工程Fab抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所示，以及编码所述基因工程Fab抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8所示。一种表达载体，包含有上述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。一种原核宿主细胞，它被上述的表达载体转化。优选地，所述的原核宿主细胞是大肠杆菌。进一步优选地，所述的原核宿主细胞是大肠杆菌BL21。上述的基因工程Fab抗体可以用于制备诊断、预防和/或治疗丙型肝炎病的试剂或药物。一种制备上述的基因工程Fab抗体的方法，包括如下步骤:(I)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求2所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列；(2)用步骤(I)所述的表达载体转化原核宿主细胞；(3)在适合所述的基因工程Fab抗体表达的条件下培养步骤(2)所得的原核宿主细胞；(4)分离纯化获 得所述的基因工程Fab抗体。上述的制备方法，其中所述的表达载体为分泌型表达载体，该分泌型表达载体能在分泌信号引导下使所述基因工程Fab抗体的多肽链被分泌到原核宿主细胞周质中。与现有技术相比，本发明涉及的基因工程Fab抗体及其制备方法具有如下优点和显著的进步:(I)采用从感染者淋巴细胞中分离抗体基因的方法获得一种全人源的抗体基因序列，并采用基因工程技术表达FAB抗体技术，获得的一组全人源的基因工程FAB抗体；(2)通过体外组合的方法，获得的FAB抗体具有双识别的特性。
图1抗体重链基因PCR克隆(以pMD-VHl为例)图2FAB抗体基因表达载体pFAB_VHl的构建图3FAB抗体基因表达载体pFAB_VH2的构建图4FAB抗体基因表达载体pFAB_VKl的构建图5FAB抗体基因表达载体pFAB_VK2的构建图6分泌FAB抗体基因表达载体pFAB_pelB_VHlCH的构建图7分泌FAB抗体基因表达载体pFAB_pelB_VH2CH的构建图8分泌FAB抗体基因表达载体pFAB_pelB_VKlCK的构建图9分泌FAB抗体基因表达载体pFAB_pelB_VK2CK的构建图10分泌成熟FAB抗体表达载体pFAB_pelB-VHlCH-VKlCK的构建图11分泌成熟FAB抗体表达载体pFAB_pelB-VH2CH_VKlCK的构建图12分泌成熟FAB抗体表达载体pFAB_pelB-VHlCH_VK2CK的构建
图13分泌成熟FAB抗体表达载体pFAB_pelB-VH2CH_VK2CK的构建。
具体实施例方式本发明涉及的基因工程Fab抗体的制备包括如下步骤:1、采用HCV感染病人，经过诊断是抗HCV核心抗原抗体阳性的患者，从一病人中分离出外周血单个核细胞，采用常规分子生物学技术，分离细胞总RNA，反转录出cDNA，并用针对抗体基因重链可变区和轻链可变区基因的通用引物进行扩增，扩增产物经电泳分离并胶回收相应的特异扩增基因产物，经过双酶切并与同样酶切的PC0MB3，连接并转化大肠杆菌，并在辅助噬菌体作用下，建立相应的噬菌体展示库。2、将重组人HCV核心抗原包被到酶标板上，将上述噬菌体展示库经过四轮淘洗筛选，获得表达具有抗HCV核心抗原高亲和力的噬菌粒。经过转化、扩增、提取噬菌体DNA，将阳性克隆进行测序并分析抗体可变区基因序列及编码氨基酸。共选择具有较高亲和力的两个阳性克隆，对它们的轻链和重链分别进行序列分析，结果为重链可变区核苷酸序列如SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8所示。其对应的重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO: 2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4所示。3、设计与Fab抗体表达载体pFABs相匹配的带相应酶切位点的针对前述各个抗体重链和轻链基因引物，PCR,以阳性噬菌粒为模板，扩增各个基因片段，并亚克隆到pMD-18 (TaKRa，Inc)载体中，分别得到各个基因重组质粒，标记为pMD_VHl、pMD_VH2、pMD-VKl 和 pMD-VK2 (参见图1)。4、按设计的限制性内切酶位点，进行双酶切获得相应的基因片段，采用基因亚克隆技术将获得的各个抗体基因可变区与含有人源抗体基因相应的恒定区的PFabl和pFab2连接，构建相应的抗HCV核心抗原抗体的重链和轻链表达载体，pFABl-VHlCH, pFABl_VH2CH，PFAB2-VK1CK, pFAB2_VK2CK四个重组载体，经过筛选鉴定后，重组质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21菌，并进行诱导表达分析，建立表达抗HCV核心抗原的Fab抗体的工程菌，用于制备重组全人源Fab抗体。5、为优化或提高表达抗体表达水平，采用一个抗体链一个表达载体、一个工程菌进行表达的方式。6、表达工程菌经过发酵、收集发酵菌体、破菌、分离纯化包涵体，并经过包涵体的洗涤、变性和复性，然后采用离子交换、凝胶过滤等纯化手段，获得纯化多肽，按分子摩尔比进行重链多肽与轻链多的混合以完全复性成为FAB抗体，并经过亲和层析纯化得到最终获得具有高亲和力的抗HCV核心抗原的Fab抗体。更佳地是，采用变性后的抗体轻链与重链蛋白，经过两两组合后，一起复性的方法，以抗体轻链与重链的相互作用促进复性过程。此夕卜，通过轻链和重链的组合，可以使产生的抗体可能识别两个不同表位的特点。7、又通过将表达重链基因的转录表达盒子亚克隆到表达抗体基因轻链基因转录盒子的载体中，建立双顺反子以同时在一个菌体内表达重链、轻链基因多肽，获得相应的Fab抗体蛋白表达， 并在编码基因上游包含有分泌表达相关的信号肽序列以实现Fab抗体的分泌表达。8、对于以分泌表达表达的FAB抗体直接应用亲和层析进行纯化，获得重组抗体。
9、对获得的全人源重组Fab抗体进行表位识别分析，确定所获得的抗体具有不同的识别表位，分别是HCV核心抗原的表位FPGGGQIV和EDGVNYATGN。以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例1抗HCV抗体噬菌体展示库的建立1、人外周血淋巴细胞的分离从医院门诊随机取5例经第2代ELISA试剂检测血清抗HCVIG强阳性，PCR检测HCVRNA阳性的慢性丙型肝炎患者的外周血。每例采血10mL，用淋巴细胞分层液按常规方法制备人外周血淋巴细胞，并用冷PBS洗3次，混合后用倒置显微镜计数，分装(每管5 X 106细胞)。5例患者经HCV5'端非编码区型特异性引物PCR分型，4例为Ib型，I例为3型。2、总RNA提取和cDNA第I链的合成以Trizol提取细胞总RNA，按说明书操作。取RNA2 μ L测A260nm和A280nm值鉴定其浓度和纯度。另取5 μ LRNA，用6g/L琼脂糖凝胶电泳检查总RNA的完整性。取10 μ g RNA 溶液，加入 Oligo dT 4“1^0.4 4 8)，于701:变性81^11，冰浴51^11。分别加入 5 X BufferlO μ L, 2.5mmol/LdNTP10 μ L, 0.lmol/LDTT5 μ L, RNA 酶抑制物 40U 和 M-MLV400U，用DEPC处理水补足体积至50 μ L，37°C水浴lh，95°C 5min,冰浴lOmin，于_20°C储存。3、引物设计及扩增Fd和k基因PCR所用人抗体引物，根据`Kang [6)的设计加适当改动和简并，由上海生工生物工程公司合成，PAGE纯化。IgGlCH 3'端引物为:5' -GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGG ；VH5/ 端引物:Pl 为:5' -SAGGTGCAGCTCGAGSAGTCTGG(由 VHla 与 VH3a 简并与);P2 为:5' -SAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG (由 VHlf■与 VH3f 简并)；P3 为:5' -CAGGTGCAGCTRCTCGAGTCGGG (由 VH 与 VH4f 简并)。Ck3/ 端引物为:5' -GCGCCGTCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTACGGGCAAG；Vk5'端引物为:5' -GAMATYGAGCTCACSCAGTCTCCA(由 Vkla 与 Vk3a 简并)。其中M=A或C，S=C或G，Y=C或T。重链引物中分别含有内切酶XhoI和SpeI的识别序列(下画线部分)；轻链引物中分别含有内切酶SacI和XbaI的识别序列(下画线部分)。每管以5 μ I cDNA为PCR反应的模板，分别对Fd和k基因进行扩增。4、大肠杆菌的电穿孔转化将2.5mL过夜培养的XLl-Blue菌液，接种在400mL含有四环素10mg/L的SB中，37°C培养至A600nm值为0.5。置冰浴中15min，于4°C离心弃上清，用100mL/L冷甘油水将细菌洗涤3次后，悬于4mL100mL/L甘油中即为感受态细胞。分装(每管0.2mL)，于液氮中冻5min后，取出，置-70°C冻存。按Bio-Rad基因脉冲仪说明书中所述方法进行电穿孔转化。5、噬菌体抗体库的构建PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，以QIAGEN凝胶提取Kit纯化，SacI + XbaI双酶切，再以PCR产物纯化Kit纯化。然后用T4DNA连接酶使之与相应酶切纯化的噬菌粒pComb3连接，电穿孔转化XLl-Blue细胞，扩增转化后的细菌。扩增后提取质粒得到含轻链片段的pComb3。对其进行XhoI + SpeI双酶切，并与用相应酶切的重链FdPCR产物连接，电穿孔转化XLl-Blue。转化后的细菌加2mL预热的S0C，置37°C振荡培养Ih后，转移至SOC固体平板(含氨苄青霉素100mg/L，四环素10mg/L)，于37°C培养24h。用SB洗下菌苔，取20 μ L菌液加入20mL含氨苄青霉素的SB中，37°C培养至A600nm约为0.5。加入约IOllpfu的辅助噬菌体VCSM13，37°C培养lh，再加入终浓度为70mg/L的卡那霉素，振荡培养过夜。离心、收集上清，加入PEG6000到40g/L，NaCl到30g/L，置冰浴Ih后，于4°C以12000r/min离心。弃上清，以3mLPBS溶解沉淀，再以12000r/min离心5min，弃去不溶物，收集上清即为噬囷体抗体库，对库各测定结果为1.2*107。实施例2抗HCV核心抗原阳性噬菌粒的分离1、曬菌体抗体库的筛选将HCV核心抗原蛋白以每孔IOOng包被ELISA板条，用30g/LBSA封闭、PBS洗后，加入噬菌体抗体库100 μ L (约1012cfu)，37°C温育2h。吸出噬菌体抗体液，以PBST洗I次(第2轮洗5次，第3，4，5轮各洗10次)，PBS洗I次，加入100 μ L洗脱液(0.lmol/LHCl,以甘氨酸调至PH2.2，并含lg/LBSA)于室温静置lOmin。将洗脱液稍加吹打后吸出，立即用6μ L2mol/L Tris中和，并加入2mLXLl_Blue，于37°C静置20min后，再加入20mLSB (含氨苄青霉素和四环素)，取10 μ L稀释铺平板测定cfu。其余细菌置37°C培养2h后，加入VCSMl3和卡那霉素。噬菌体的沉淀和收集均按实施例1步骤5中的程序进行。反复进行“吸附一洗脱一扩增”4次淘洗，以使特异性噬菌体抗体高度富集。
2、单克隆嗤囷体抗体的制备及鉴定将经第4轮筛选、洗脱的噬菌体感染XLl-Blue后划平板，过夜培养。随机挑选细菌菌落，接种于4mL含氨苄青霉素和四环素的SB中，置37°C振荡培养过夜。取200 μ L加到4mL含同样量抗菌素的SB中，再37 °C振荡培养2h，加入40 μ L的VCSMl3培养2h后，力口卡那霉素至70mg/L，置30°C振荡培养过夜。离心收集上清，即为单克隆噬菌体抗体，置4°C保存。将待检噬菌体抗体与等量10g/LBSA混合后，置室温孵育20min，加到已经HCV核心抗原包被和BSA封闭的ELISA板中，于37°C温育2h。用PBST洗4次、PBS洗2次后，加入HRP-羊抗M13抗体进行结合反应，以TMB显色。实验中采用VCSM13作为阴性对照。3、抗HCV核心抗原抗体基因的分离与鉴定将筛选到的阳性克隆，采用Qiagen小量质粒抽提试剂盒，送公司进行测序，获得表达抗体基因的序列。实施例3抗HCV核心抗原Fab抗体的表达载体构建与表达1、设计引物根据已经测定的抗体重链和轻链基因序列，分别设计扩增出抗体基因的重链可变区和轻链可变区的引物，如下表1:表I抗体扩增引物
权利要求
1.一种全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于:(I)重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；(2)轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。
2.—种DNA分子，编码权利要求1所述的基因工程Fab抗体的重链或/和轻链。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于:它编码所述基因工程Fab抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N0:5或SEQ ID NO:6所示，以及编码所述基因工程Fab抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8所示。
4.一种表达载体，包含有权利要求2所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。
5.一种原核宿主细胞,它被权利要求4所述的表达载体转化。
6.根据权利要求5所述的原核宿主细胞，其特征在于:它是大肠杆菌。
7.根据权利要求5所述的原核宿主细胞，其特征在于:它是大肠杆菌BL21。
8.权利要求1所述的基因工程Fab抗体在制备诊断、预防和/或治疗丙型肝炎病的试剂或药物中的用途。
9.一种制备权利要求1所述的基因工程Fab抗体的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求2所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列； (2)用步骤(I)所述的表达载体转化原核宿主细胞； (3)在适合所述的基因工程Fab抗体表达的条件下培养步骤(2)所得的原核宿主细胞； (4)分离纯化获得所述的基因工程Fab抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于:所述的表达载体为分泌型表达载体，该分泌型表达载体能在分泌信号引导下使所述基因工程Fab抗体的多肽链被分泌到原核宿主细胞周质中。
全文摘要
本发明公开了一种全人源抗丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程Fab抗体及其制备方法和应用，该Fab抗体是按照如下方法制备而成从丙型肝炎感染患者中分离淋巴细胞，并通过噬菌体展示技术分离全人源抗丙型肝炎核心抗原的抗体基因，采用Fab抗体基因表达方法，表达并分离得到相应的抗体蛋白，其可用于丙肝炎核心抗原的检测。
文档编号C07K16/10GK103159853SQ201310057388
公开日2013年6月19日 申请日期2013年2月23日 优先权日2013年2月23日
发明者娄永华 申请人:浙江家和制药有限公司