专利名称：化学合成的sars病毒s基因片段及其表达、应用的制作方法
技术领域：
本发明是化学合成的SARS病毒S蛋白的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组SARS病毒S蛋白。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于疫苗及SARS病毒抗体或抗原的检测等，本发明涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。
SARS病毒是一种新型的冠状病毒，由于这种病毒以前未曾感染过人类，所以人群对该病毒普遍易感，SARS病毒是一种单股正链RNA病毒，目前对其全基因序列已经测定，Genebank内已公布了10个左右的全长病毒基因序列，为利用基因工程技术研究诊断试剂、疫苗及筛选抗病毒药物奠定了基础。
SARS病毒用Vero-E6可以体外培养，所以利用培养的SARS病毒建立了检测SARS病毒抗体的免疫荧光方法和酶联免疫检测法，但是用培养的SARS病毒作抗原检测抗体，难以大量生产，亦会产生假阳性，研制特异的基因重组抗原是建立SARS病毒特异抗体检测试剂的发展方向。预防SARS感染的最理想途径是注射疫苗，但目前没有预防SARS的疫苗，国内外均在积极开展疫苗的研制，尤其对灭活疫苗的研究进展较快，基因工程疫苗是最终的发展方向。
SARS病毒最外层的S蛋白，是介导病毒和宿主细胞结合的主要蛋白，封闭该蛋白的结合位点可阻止病毒感染细胞，所以SARS病毒的S蛋白是研制疫苗的首选蛋白。通过计算机分析，我们筛选出含强抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于疫苗及SARS病毒抗体或抗原的检测等。
发明内容
本发明是化学合成的SARS病毒S蛋白的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组SARS病毒S蛋白片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，第162个氨基酸一第460个氨基酸，共299个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达该基因。表达的蛋白可用于疫苗、SARS病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗人巨细胞病毒单抗和多抗等。化学合成的SARS病毒S基因片段及其表达、应用是采取以下步骤实施的1.SARS病毒S蛋白抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析SARS病毒S蛋白的氨基酸序列，发现S蛋白的N端(第162氨基酸-第460氨基酸)含有较强的抗原决定簇。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5’端增加了BamHI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(GT)，在3’端增加了终止密码子(TAA)和EcoRI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(AC)，使该基因片段易于克隆至质粒pET28a(+)内的BamHI和EcoRI酶切位点内。
筛选的SARS病毒S蛋白内的抗原表位氨基酸序列(第162个aa-第460个aa)Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe LysHis Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys GlyTyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys ProIle Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr AlaPhe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Glv TyrLeu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp AlaVal Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe GluIle Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp ValVal Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala ThrLys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala AspTyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val SerAla Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val ValLys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp TyrAsn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg AsnIle Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His GlyLys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe化学合成的含SARS病毒S蛋白抗原表位基因的DNA序列(916bp)GTGGATCCGAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AACTTC AAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TACAAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTGAAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTGACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTTGGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACTGAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGCTTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGTGAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AACGCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTTGCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGCGTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTCGTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCTGAC TAC AAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACTCGT AAC ATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGTCAC GGC AAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAAGAATTCAC2.表达SARS病毒S蛋白片段重组质粒的构建提取质粒pET28a(+)，用BamHI和EcoRI双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内。同样用BamHI和EcoRI双酶切化学合成的SARS病毒S蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内。
取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使SARS病毒S蛋白基因片段插入到载体pET28a(+)内的BamHI和EcoRI位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白。3.重组质粒的筛选与鉴定将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(60μg/ml)LB平板，置37℃过夜。次日随机挑取转化菌落和个对照菌(质粒pET28a转化菌)，分别提取质粒，以提取的质粒为模板，PCR扩增SARS病毒S蛋白基因片段，含SARS病毒S蛋白基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约916bp的基因片段。将含有外源基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有合成的SARS病毒S蛋白基因片段，序列完全正确GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTC AAACAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TAC AAG GGCTAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTG AAA CCGATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTG ACT GCTTTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTT GGC TACCTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCTGTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAGATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTTGTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACTAAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GATTAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCTGCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTTAAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TACAAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AACATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGCAAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA构建的重组质粒表达SARS的病毒S蛋白片段(299个氨基酸)，在其N端融合了载体上的34个氨基酸，全长333个氨基酸，其氨基酸序列如下Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Lys Val Pro Arg Gly SerHis Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Tyr Ile SerAsp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg GluPhe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro IleAsp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys LeuPro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro AlaGln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro ThrThr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys SerGln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys GlyIle Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe ProAsn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro SerVal Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val LeuTyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys LeuAsn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp AspVal Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys LeuPro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala ThrSer Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg ProPhe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe4.表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含3ml LB培养基(含卡那毒素60μg/ml)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续振荡培养诱导6h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，重组子表达相对分子量约为37kD的SARS病毒S蛋白，表达量约为30％，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带。5.表达SARS病毒S蛋白的纯化1)表达SARS病毒S蛋白工程菌的超声裂解将诱导表达融合蛋白的工程菌离心(8000rpm、10min、4℃)收菌，菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0、10mmol/L EDTA、10mmol/LDTT)内，冰浴超声破菌10min，离心(12000rpm、20min、4℃)收集上清，弃沉淀。收集的上清用于下一步的离子交换纯化。
2)DEAE-Sepharose FF阴离子柱纯化将DEAE-Sepharose FF阴离子柱连接至常压层析系统，先用平衡液(50mmol/LTris-HCl pH8.0、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L DTT)冲洗平衡，然后将上步获得的裂解上清直接上样，上样流速为1.5ml/min，收集穿过峰。
3)S-Sepearse FF阳离子柱纯化将上步DEAE-Sepharose FF阴离子穿过峰，装入透析袋内，对透析液(20mmol/LPB(pH7.4)、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L DTT)搅拌透析4h。用上述透析液冲洗平衡S-Sepharose FF阳离子柱，然后将透析后的穿过峰直接上样，上样流速1.5ml/min。上样结束后用透析液充分洗柱，再依次用含50、100、1000mmol/L NaCl的透析液洗脱蛋白，收集100mmol/L NaCl洗脱峰蛋白，即为纯化的SARS病毒S蛋白。6.纯化的SARS病毒S蛋白用作抗原检测HCMV抗体将纯化的SARS病毒S蛋白用50mmol/L的碳酸盐(pH9.6)倍比稀释后包被酶联板，间接酶联免疫法检测已知的抗SARS病毒阳性血清及正常人血清，SARS病毒S蛋白能与抗SARS病毒阳性血清反应，不与正常人血清反应，说明病毒的SARS病毒S蛋白有较好抗原性和特异性。
同样用辣根过氧化物酶(HRP)标记SARS病毒S蛋白，用扑获法检测抗SARS病毒IgM或IgG抗体，有较高的敏感性和特异性。SARS病毒S蛋白用作抗原，用金标法检测抗SARS病毒抗体，亦有较高的敏感性和特异性。7.将表达的SARS病毒S蛋白片段，用于疫苗、SARS病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗SARS病毒单抗和多抗等。8.将合成的SARS病毒S蛋白基因片段与其它基因片段连接，以融合蛋白的形式进行表达、制备。本发明与现有技术相比具有的优点我们表达的SARS病毒的S蛋白片段，有较多优点1.目前应用的SARS病毒抗体的酶联免疫检测试剂盒，其使用的抗原是全病毒抗原，生产较危险、成本高、与其它冠状病毒有交叉反应等缺点。表达的SARS病毒的S蛋白片段用作抗原可克服上述缺点。
2.目前缺乏SARS病毒疫苗。灭活疫苗的研究取得了较打进展，但是生产成本高、危险大。SARS病毒最外层的S蛋白，是介导病毒和宿主细胞结合的主要蛋白，封闭该蛋白的结合位点可阻止病毒感染细胞，所以SARS病毒的S蛋白是研制疫苗的首选蛋白，我们选择了其强抗原表位，利用基因工程技术表达制备，为研制基因工程疫苗奠定基础。基因工程疫苗安全、成本低。
3.根据筛选出的SARS病毒的S蛋白片段氨基酸序列，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，该基因适宜在真核和原核细胞内高表达。
4.本文构建的表达SARS病毒的S蛋白的工程菌，表达量可达菌体蛋白的30％，易于纯化，可大量纯化制备该蛋白。目前未见表达该段蛋白的报道。
以下将结合附图对本发明作进一步说明图1是分子生物学软件对SARS病毒S蛋白的抗原表位进行分析结果。结果显示，在SARS病毒的S蛋白N端从第162个氨基酸到第460个氨基酸，含有强的亲水性抗原表位，即图内箭头标示的位置。
图2是表达SARS病毒的S蛋白的重组质粒构建流程图。
图3是用1.2％的Agarose凝胶检测5个重组子的PCR扩增产物。M低分子量DNA标准(TaKaRa，DL2000)；C含质粒pET28a(+)的对照菌；1～5∶5个转化子均扩增出916bp的目的基因片段，即图内箭头标示的位置。
图4是表达SARS病毒的S蛋白重组菌的SDS-PAGE分析结果。M低分子量蛋白标准(Pharmacia)；C对照菌E.coli BL21(DE3)；1～5∶1～5号重组菌，5个重组子均表达相对分子量约为37000的融合蛋白，即图内箭头标示的位置。
图5是表达SARS病毒的S蛋白纯化前后的SDS-PAGE分析结果。M低分子量蛋白标准(Pharmacia)；1对照菌BL21(DE3)；2表达PSARS病毒的S蛋白的工程菌；3S-Sepharose FF阳离子柱纯化后的的SARS病毒的S蛋白。
2.分子生物学试剂限制性内切酶BamHI、EcoRI、及T4 DNA连接酶为TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒及从琼脂糖凝胶内回收DNA片段的试剂盒为德国QIAGEN公司产品。DTT及IPTG为Promega公司产品。其它试剂为进口或国产分析纯试剂。
3.基因片段的合成由大连TaKaRa公司帮助合成。
4.基因克隆方法DNA的酶切、连接、电泳；质粒的提取、转化；蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法按常规方法进行。其它试剂盒按说明书进行操作。
5.DNA序列分析用QIAGEN公司质粒纯化试剂盒纯化质粒，用DNA全自动测序仪测序。结果1.SARS病毒的S蛋白抗原表位筛选及基因片段的合成利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析SARS病毒的S蛋白的全部氨基酸序列(GeneBank，接通号AY278488)，筛选出SARS病毒的S蛋白内的强抗原表位(图1)，即从第162个氨基酸到第460个氨基酸，其氨基酸序列如下Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe LysHis Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys GlyTyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys ProIle Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr AlaPhe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly TyrLeu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp AlaVal Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe GluIle Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp ValVal Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala ThrLys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala AspTyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val SerAla Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val ValLys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp TyrAsn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg AsnIle Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His GlyLys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe根据筛选的SARS病毒S蛋白内的抗原表位氨基酸序列，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5’端增加了BamHI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(GT)，在3’端增加了终止密码子(TAA)和EcoRI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(AC)，使该基因片段易于克隆至质粒pET28a(+)内的BamHI和EcoRI酶切位点内。化学合成的含SARS病毒S蛋白抗原表位基因的DNA序列(916bp)如下GTGGATCCGAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AACTTC AAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TACAAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTGAAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTGACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTTGGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACTGAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGCTTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAG CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGTGAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AACGCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTTGCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGCGTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTCGTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCTGAC TAC AAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACTCGT AAC ATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGTCAC GGC AAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAAGAATTCAC2.表达SARS病毒S蛋白片段重组质粒的构建提取质粒pET28a(+)(美国Novagen公司产品)，用BamHI和EcoRI双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内。同样用BamHI和EcoRI双酶切化学合成的SARS病毒S蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内。
取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使SARS病毒S蛋白基因片段插入到载体pET28a(+)内的BamHI和EcoRI位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白(构建流程见图2)。3.重组质粒的筛选与鉴定将上步连接的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，将转化产物涂布含卡那霉素(60μg/ml)的固体LB培养基上，置37℃培养过夜。次日随机挑选5个转化子菌落(分别标记为1-5号)和1个对照菌(质粒pET28a转化菌)，分别接种到含4ml液体LB培养基(含卡那霉素60μg/ml)的试管内，置37℃振荡培养6h，取菌液1ml，离心收菌。分别用50μl去离子水悬浮菌体，沸水煮5min，离心(4℃，12000rpm)5min，取上清(内有质粒)2μl用作PCR模板，PCR扩增插入载体内的SARS病毒S蛋白基因片段，PCR反应浓度为质粒模板2μl、SARS病毒S蛋白基因片段的正链P1(GAATACATCTCTGACGCATTC)和负链引物P2(TTAGAACGGCACGTTAGAGAT)各1μl、10xBuffer 5.0μl、2.5mmol/L dNTP 4.0μl、Taq DNA聚合酶0.5μl(2.5U)、去离子水36.5μl，总体积50μl。扩增条件为94℃ 30秒、65℃30秒、72℃60秒，35个循环；最后72℃延伸7分钟。取PCR扩增产物5μl，用1.2％的Agarose凝胶检测，结果，5个转化子均扩增出900bp的目的基因片段(见图3)，而含质粒pET28a(+)的对照菌没有扩增出该基因片段。初步证实，这5个转化子均含有SARS病毒S蛋白基因片段。
提取1号重组子的质粒，测定质粒内的SARS病毒S蛋白基因序列，DNA序列分析证实，重组质粒含有合成的SARS病毒S蛋白基因片段，序列完全正确GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTC AAACAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TAC AAG GGCTAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTG AAA CCGATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTG ACT GCTTTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTT GGC TACCTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCTGTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAGATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTTGTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACTAAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GATTAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCTGCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTTAAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TACAAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AACATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGCAAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA构建的重组质粒表达SARS的病毒S蛋白片段(299个氨基酸)，在其N端融合了载体上的34个氨基酸，全长333个氨基酸，其氨基酸序列如下Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Lys Val ProArg Gly SerHis Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Tyr Ile SerAsp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg GluPhe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro IleAsp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys LeuPro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro AlaGln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro ThrThr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys SerGln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys GlyIle Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe ProAsn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro SerVal Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val LeuTyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys LeuAsn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp AspVal Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys LeuPro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala ThrSer Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg ProPhe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe4.表达SARS病毒S蛋白工程菌的筛选鉴定将含有重组质粒的5个阳性转化子和1个对照菌(质粒pET28a转化菌)，接种至含3ml LB培养基(含卡那毒素60μg/ml)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续振荡培养诱导6h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，重组子表达相对分子量约为37 kD的SARS病毒S蛋白，表达量约为30％，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带(图4)。
表达SARS病毒S蛋白的纯化根据表达SARS病毒S蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，确定适当的纯化方法。经计算机分析，表达SARS病毒S蛋白的等电点为pH8.5，因此我们决定在pH为8.0的Tris-HCl的缓冲液内，用DEAE-SepharoseFF阴离子纯化，收集穿溜峰。然后再在pH为7.4的磷酸盐缓冲液内，用S-SepharoseFF阳离子纯化。具体步骤如下材料和方法1.主要试剂DEAE-SepharoseFF阴离子和S-SepharoseFF阳离子凝胶为Pharmacia公司产品，IPTG、DTT为Promega公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。2.表达SARS病毒的S蛋白的超声裂解将培养的表达SARS病毒的S蛋白的工程菌离心(8000rpm，l0mins，4℃)，弃上清，菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0、10mmol/L EDTA、10mmol/L DTT)内，冰浴超声破菌10mins，离心(12000rpm、20mins，4℃)收集上清，弃沉淀。收集的上清用于下一步的离子交换纯化。3.DEAE-Sepharoe FF阴离子柱纯化将DEAE-Sepharose FF阴离子柱(胶高20cm，直径1.2cm)连接至Bio-Rad常压层析系统，先用平衡液(50mmol/LTris-HCl pH8.0、1mmol/L EDTA、0.1mMmol/L DTT)冲洗平衡，然后将上步获得的裂解上清直接上样，上样流速为1.5ml/min。收集穿过峰。4.S-Sepharose FF阳离子柱纯化将上步DEAE-Sepharose FF阴离子穿过峰，装入透析袋内，对pH7.4的磷酸盐透析液(20mmol/L PB、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L DTT)搅拌透析4h。用上述透析液冲洗平衡S-Sepharose FF阳离子柱，然后将透析后的穿过峰直接上样，上样流速1.5ml/min。上样结束后用透析液充分洗柱，使记录笔回至基线，再依次用含50、100、1000mmol/L NaCl的透析液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白进行SDS-PAGE检测。结果将不同浓度NaCl从S-Sepharose FF柱上洗脱的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果显示(见图5)，SARS病毒的S蛋白仅存在于100mmol/L NaCl洗脱峰内，显色一条很浓的SARS病毒的S蛋白带(37kD处)，其它洗脱峰内无明显SARS病毒的S蛋白带。
纯化SARS病毒的S蛋白的鉴定及应用将纯化的重组人巨细胞病毒融合蛋白用作抗原，通过间接ELISA试验方法，检测抗SARS病毒抗体(IgM或IgG)阳性及阴性血清，以鉴定表达的SARS病毒S蛋白的抗原性和特异性。实验结果显示，该重组蛋白有很好的抗原性和特异性，可用作抗原检测抗SARS病毒抗体。材料和方法1.抗SARS病毒抗体阳性血清及正常人血清GBI公司生产的抗SARS病毒抗体ELISA试剂盒内的阳性对照，及2份灭活的抗SARS病毒抗体阳性血清。正常人血清由本实验室保存。
2.酶联反应材料酶联板为深圳产96孔板，辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人μ链单克隆抗体购自Sigama公司。其它材料为酶联反应的常规材料。
3.ELISA试验采用间接ELISA检测血清中的抗SARS病毒抗体(IgG或IgM)。基本步骤为用50mmol/L碳酸盐溶液(pH9.6)稀释SARS病毒的S蛋白包被酶联板，每孔100μl，4℃过夜。次日用封闭液(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4，10％山羊血清，20％小牛血清，0.5％casein，0.05％硫硫汞，5％蔗糖)封闭，每孔130μl，37℃1h(或4℃过夜)。将待测的抗SARS病毒抗体(IgG或IgM)阴、阳性血清，用样本稀释液(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4，10％山羊血清，20％小牛血清，0.5％casein，0.05％硫硫汞，0.5mmol/L NaCl)稀释后(IgG 1∶20稀释，IgM 1∶100稀释)，分别加至封闭后的酶联板孔内，每孔100μl，每个样本加2孔，37℃反应30min，用PBST液(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4，0.5％吐温-20)洗5遍后，加1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG或抗人μ链单抗，每孔100μl，37℃反应30min，PBST洗5遍，加底物TMB溶液100μl，37℃避光显色10min，加50μl 4N硫酸混匀终止反应，用酶联仪测定A450值。结果1.间接ELISA检测血清中抗SARS病毒抗体(IgG或IgM)将纯化的SARS病毒的S蛋白与已知不同浓度的牛血清白蛋白(第五部分)共同电泳、显色后比较，确定纯化的SARS病毒的S蛋白浓度约为1.5mg/ml。用50mmol/L碳酸盐溶液(pH9.6)1∶1000稀释后包被酶联板，检测已知2份抗SARS病毒抗体(IgG)阳性血清和1份抗SARS病毒抗体(IgM)阳性血清。结果显示，2份抗SARS病毒抗体阳性血清均出现显色反应，A450值分别为0.857和0.731。1份抗SARS病毒抗体(IgM)阳性血清也出现显色反应，A450值为0.557。同时检测了180份正常人血清，它们的A450值均小于0.05，说明SARS病毒的S蛋白有较好的抗原性和特异性。
化学合成的SARS病毒S基因片段序列表<110>李越希 陶开华<120>化学合成的SARS病毒S基因片段及其表达、应用<160>2<210>1<211>299<212>PRT<213>SARS病毒的S蛋白片段<220><223>含强抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，第162个氨基酸-第460个氨基酸，共299个氨基酸。<400>1Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly1 5 10 15Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe20 25 30Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu35 40 45Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu Gly50 55 60Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala65 70 75 80Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu85 90 95Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr100 105 110Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser115 120 125Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe130 135 140Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn145 150 155 160Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val165 170 175Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser180 185 190Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val195 200 205Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp210 215 220Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln225 230 235 240Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met245 250 255Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr260 265 270Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg275 280 285Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe290 295<210>2<211>900<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)...(897)<223>人工合成的全新基因片段，编码SARS病毒S蛋白片段。<220><221>mis-feature<222>(898)...(900)<223>合成基因时增加的终止密码子。<400>2GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTC AAA CAC 60Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His1 5 10 15 20CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TAC AAG GGC TAC CAG 120Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln25 30 35 40CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTG AAA CCG ATC TTC AAG 180Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys45 50 55 60CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT 240Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala65 70 75 80CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC 300Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr85 90 95 100TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC 360Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn105 110 115 120CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG 420Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln125 130 135 140ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC 480Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn145 150 155 160CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG 540Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu165 170 175 180CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC 600Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe185 190 195 200TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC 660Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn205 210 215 220GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG 720Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln225 230 235 240ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG 780Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu245 250 255 260GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT 840Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg265 270 275 280TAC CTG CGT CAC GGC AAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA 900Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe285 290 29权利要求
1.一种化学合成的SARS病毒S蛋白的基因片段，该基因片段编码含强抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，第162个氨基酸-第460个氨基酸，共299个氨基酸，其DNA序列如下GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTCAAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TACAAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACTCTG AAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCTATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCCTAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AACGGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAATGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTCCGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGCCCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAGCGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACCTTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTGTGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGTCAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAA CTG CCGGAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GAC GCT ACTTCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGC AAA CTG CGTCCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA
2.权利要求1所述的化学合成的SARS病毒S蛋白的基因片段序列，利用基因工程技术表达该序列，具体方法如下SARS病毒S蛋白抗原表位的筛选通过计算机分析SARS病毒S蛋白的氨基酸序列，发现S蛋白的N端第162个氨基酸至第460个氨基酸含有较强的抗原决定簇，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5’端增加了BamHI酶切位点及两个保护碱基GT，在3’端增加了终止密码子TAA和EcoRI酶切位点及两个保护碱基AC，使该基因片段易于克隆至质粒pET28a(+)内的BamHI和EcoRI酶切位点内。筛选的SARS病毒S蛋白内的抗原表位氨基酸序列，既第162个氨基酸至第460个氨基酸，共299个氨基酸Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn PheLys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val TyrLys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn ThrLeu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg AlaIle Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala AlaTyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu AsnGly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu LysCys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn PheArg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu CysPro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp GluArg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser ThrPhe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp LeuCys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val ArgGln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu ProAsp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala ThrSer Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu ArgPro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe化学合成的含SARS病毒S蛋白抗原表位基因的DNA序列(916bp)GTGGATCCGAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGTAAC TTC AAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TACGTT TAC AAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTTAAC ACT CTG AAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTCCGC GCT ATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCTGCA GCC TAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GACGAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAACTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCTAAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AACCTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCATGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AACTCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AACGAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GACGTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAACTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GACGCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGC AAACTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAAGAATTCAC表达SARS病毒S蛋白片段重组质粒的构建提取质粒pET28a(+)，用BamHI和EcoRI双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内，同样用BamHI和EcoRI双酶切化学合成的SARS病毒S蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内；取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使SARS病毒S蛋白基因片段插入到载体pET28a(+)内的BamHI和EcoRI位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白；重组质粒的筛选与鉴定将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含60μg/ml卡那霉素的LB平板，置37℃过夜，次日随机挑取转化菌落和含质粒pET28a(+)的对照菌，分别提取质粒，以提取的质粒为模板，PCR扩增SARS病毒S蛋白基因片段，含SARS病毒S蛋白基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约916bp的基因片段，将含有外源基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有合成的SARS病毒S蛋白基因片段，序列完全正确GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTCAAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TACAAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACTCTG AAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCTATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCCTAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AACGGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAATGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTCCGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGCCCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAGCGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACCTTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTGTGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGTCAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAA CTG CCGGAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GAC GCT ACTTCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGC AAA CTG CGTCCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA构建的重组质粒表达SARS病毒S蛋白的299个氨基酸片段，在其N端融合了载体上的34个氨基酸，全长333个氨基酸，其氨基酸序列如下Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Lys Val ProArg Gly SerHis Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Tyr IleSer Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His LeuArg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly TyrGln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys ProIle Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu ThrAla Phe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe ValGly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Glv Thr IleThr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser ValLys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val ValPro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe GlyGlu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys LysIle Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe SerThr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe SerAsn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile AlaPro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp PheMet Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr GlyAsn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe GluArg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含卡那毒素60μg/mL的LB培养基内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5-1.0mmol/L，继续振荡培养诱导4-6h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，重组子表达相对分子量约为37kD的SARS病毒S蛋白，表达量约为30％，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带；表达SARS病毒S蛋白的纯化1)表达SARS病毒S蛋白工程菌的超声裂解将诱导表达融合蛋白的工程菌离心收菌，菌体重悬于裂解液(50mmol/LTris-HCl pH8.0、10mmol/L EDTA、10mmol/L DTT)内，冰浴超声破菌10min，离心收集上清，弃沉淀，收集的上清用于下一步的离子交换纯化；2)DEAE-Sepharose FF阴离子柱纯化将DEAE-Sepharose FF阴离子柱连接至常压层析系统，先用Tris-HCl缓冲液冲洗，然后将上步获得的裂解上清直接上样，收集穿过峰；3)S-Sepearse FF阳离子柱纯化将上步DEAE-Sepharose FF阴离子穿过峰，装入透析袋内，对pH7.4的磷酸盐透析液搅拌透析4h，用上述透析液冲洗平衡S-Sepharose FF阳离子柱，然后将透析后的穿过峰直接上样，上样结束后用透析液充分洗柱，用含梯度浓度的NaCl溶液洗脱蛋白，收集100mmol/L NaCl洗脱峰蛋白，即为纯化的SARS病毒S蛋白；纯化的SARS病毒S蛋白用作抗原检测HCMV抗体将纯化的SARS病毒S蛋白用碳酸盐溶液倍比稀释后包被酶联板，间接酶联免疫法检测已知的抗SARS病毒阳性血清及正常人血清，SARS病毒S蛋白能与抗SARS病毒阳性血清反应，不与正常人血清反应，说明病毒的SARS病毒S蛋白有较好抗原性和特异性；同样用辣根过氧化物酶标记SARS病毒S蛋白，用扑获法检测抗SARS病毒IgM或IgG抗体，有较高的敏感性和特异性，SARS病毒S蛋白用作抗原，用金标法检测抗SARS病毒抗体，亦有较高的敏感性和特异性。
3.权利要求1所述的化学合成的SARS病毒S蛋白的基因片段序列，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。
4.权利要求1所述的化学合成的SARS病毒S蛋白的基因片段表达的蛋白片段，用于疫苗、SARS病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗SARS病毒单抗和多抗。
5.权利要求1所述的化学合成的SARS病毒S蛋白的基因片段序列，与其它基因片段连接，以融合蛋白的形式进行表达、制备。
全文摘要
本发明化学合成的SARS病毒S基因片段及其表达、应用涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。本发明是通过计算机分析，筛选出SARS病毒的S蛋白内的强抗原表位，第162个氨基酸至第460个氨基酸，共299个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技术，表达该基因片段、制备SARS病毒S蛋白的强抗原表位片段。表达的SARS病毒S蛋白的强抗原表位片段可用于疫苗、SARS病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗SARS病毒单抗和多抗等。
文档编号G01N33/569GK1472321SQ03131879
公开日2004年2月4日 申请日期2003年6月13日 优先权日2003年6月13日
发明者李越希, 陶开华 申请人:李越希, 陶开华