本发明属于HPV检测
技术领域：
，具体涉及一种HPVl6感染相关疾病的免疫学检测方法。
背景技术：
：人乳头瘤病毒(HPV)为对称二十面体，是微小无包膜的环状双链DNA病毒，大小约8kb。流行病学调查证实了HPV感染与宫颈癌的发生有极密切的相关性，检测结果表明宫颈癌病例中HPV病毒基因组的阳性率大于99％，其中70％的病例由高危型病毒HPV16和HPV18的感染引起。HPV16是最常见的与宫颈癌相关的高危型病毒。HPV基因组按功能不同分为3个区：非编码区，为基因转录复制调控区；早期区，含6个开放读码框架(El，E2，E4，E5，E6，E7)，编码的蛋白参与病毒的复制与转录；晚期区，含L1和L2两个开放读码框架，编码病毒两个衣壳蛋白，即主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白，共同组成病毒的外壳。HPV16的E6和E7是主要的致癌基因，在宫颈癌SiHa细胞系中，当HPV16E6/E7表达沉默时，SiHa细胞的增殖及迁移能力就会明显受到抑制。1993年比利时的HamersCasterman报道了在骆驼血清中不仅存在由2条H链和2条L链构成的常规抗体，还存在缺失轻链的重链抗体(heavy-chainantibody，hcAb)这类抗体的抗原结合位点仅由重链的可变区VHH(variabledomainoftheheavychainofHCAbs,VHH)形成，尽管天然缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力。VHH纳米抗体分子量为15kDa，仅为常规抗体的1/10。纳米抗体具有易表达，水溶性好，稳定性强，免疫原性弱，组织穿透性好等优点，这些特点使得纳米抗体在基础研究、药物开发等领域有重要的应用价值。而传统抗体稳定性差、生产成本高，限制了对于乳头瘤病毒的检测。因此应用纳米抗体技术研发乳头瘤病毒的检测试剂具有广阔的前景。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是，提供一种HPV16E7蛋白纳米抗体。本发明还要解决的技术问题是，提供上述HPV16E7蛋白纳米抗体的制备方法。本发明还要解决的技术问题是，提供上述HPV16E7蛋白纳米抗体在检测HPV16E7蛋白中的应用。HPV16E7蛋白纳米抗体，所述HPV16E7蛋白纳米抗体的包括框架区和互补决定区：其中，所述框架区包括如下序列：如SEQIDNO.1所示的FR1，如SEQIDNO.2所示的FR2，如SEQIDNO.3所示的FR3，如SEQIDNO.4所示的FR4；所述互补决定区包括如下序列如SEQIDNO.5所示的CDR1，如SEQIDNO.6所示的CDR2，如SEQIDNO.7所示的CDR3；或者，所述框架区包括如下序列：如SEQIDNO.8所示的FR1，如SEQIDNO.9所示的FR2，如SEQIDNO.10所示的FR3，如SEQIDNO.11所示的FR4；所述互补决定区包括如下序列如SEQIDNO.12所示的CDR1，如SEQIDNO.13所示的CDR2，如SEQIDNO.14所示的CDR3。HPV16E7蛋白纳米抗体，所述HPV16E7蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.15或SEQIDNO.16所示。编码HPV16E7蛋白纳米抗体的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.17或SEQIDNO.18所示。一种重组质粒，该质粒包含SEQIDNO.17或SEQIDNO.18所示的序列。一种重组细胞，该重组细胞包含SEQIDNO.17或SEQIDNO.18所示的序列。上述HPV16E7蛋白纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：将SEQIDNO.17或SEQIDNO.18所示的核苷酸序列克隆到表达质粒上，再将得到的重组质粒转化宿主细胞，培养，得到HPV16E7蛋白纳米抗体。其中，所述表达质粒为pET28a。其中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。上述HPV16E7蛋白纳米抗体在检测HPV16E7蛋白中的应用在本发明的保护范围之内。有益效果：本发明的优点如下：本发明利用原核表达的HPV16E7抗原免疫骆驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因库。然后将HPV16E7蛋白包被在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库，从而获得HPV16E7特异性的纳米抗体基因，再将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。附图说明图1是pSUMO-HPVl6E7蛋白原核表达SDS-PAGE电泳图：M为蛋白分子标准；1为未诱导全菌；2为IPTG诱导全菌。图2是pSUMO-HPVl6E7蛋白镍柱亲和层析纯化后的蛋白SDS-PAGE电泳图：1为蛋白分子标准；2为目的蛋白。图3是nest-PCR1产物琼脂糖凝胶电泳图：M为DNA分子标准；1为nest-PCR1产物。图4是nest-PCR2产物琼脂糖凝胶电泳图：M为DNA分子标准；1为nest-PCR2产物即扩增所得的VHH片段。图5是HPVl6E7蛋白纳米抗体文库的多样性鉴定图：M为DNA分子标准；1-17是HPVl6E7蛋白纳米抗体文库中随机挑选的单克隆噬菌体PCR产物。图6.HPVl6E7蛋白纳米抗体1诱导表达纯化的SDS-PAGE电泳图：M为蛋白分子标准；1为未诱导全菌；2为IPTG诱导全菌；3为超声破碎沉淀；4为超声破碎上清；5-6为流穿液；7，8为纯化所得的HPVl6E7蛋白纳米抗体。图7.HPVl6E7蛋白纳米抗体的免疫印迹亲和性分析.l：pSUMO空质粒表达蛋白对照，2：HPVl6E7具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1：HPVl6E7蛋白的诱导表达及纯化(1)HPVl6E7蛋白的诱导表达首先将成功构建好的pSUMO-HPVl6E7载体转化到BL21(DE3)中，获得pSUMO-HPVl6E7重组菌，挑选单克隆于卡那霉素液体LB中，培养过夜；然后以1：100接种于含卡那霉素液体LB中，培养1.5-2h，当菌液OD600为0.6～0.8时，用23℃，16h，0.1mmol/LIPTG进行诱导表达。图1SDS-PAGE电泳检测结果显示，诱导后的HPVl6E7蛋白表达菌在35KD处有一条带，符合目的蛋白的预期分子量。(2)HPVl6E7蛋白的纯化通过Ni-IDA亲和层析的方法获得纯化的HPVl6E7蛋白。层析柱首先用菌体缓冲液清洗，加入Ni-IDA填充层析柱；将上述菌体超声上清加入镍柱中，控制流速，使流穿液以2ml/min的流速流出；用至少3倍柱床体积的清洗缓冲液(40mmol/L咪唑，菌体缓冲液)洗掉杂蛋白；用等体积的洗脱缓冲液(250mmol/L咪唑，菌体缓冲液)洗脱目的蛋白，并收集洗脱液。图2SDS-PAGE电泳检测结果显示，经镍柱纯化的HPVl6E7蛋白，蛋白纯度高达90％以上。实施例2：HPVl6E7蛋白纳米抗体文库的构建(1)HPVl6E7蛋白免疫新疆双峰骆驼将1mg的HPVl6E7蛋白与等体积的弗氏佐剂混合均匀，免疫新疆双峰骆驼(皮下注射3-5点)，共免疫注射7次(首次用完全弗氏佐剂，其余用不完全弗氏佐剂)；免疫结束后，取免疫后骆驼的外周血200ml,分离获得外周血淋巴细胞。(2)外周血淋巴细胞的分离及其总RNA的提取首先采用Percoll密度梯度离心分离纯化骆驼外周血淋巴细胞。将淋巴细胞用生理盐水清洗几次后，加入Trizol,室温静置10min；然后加入氯仿剧烈震荡，室温静置15min；离心后，收集上层水相加入异丙醇混匀，室温静置10min；离心去上清，75％乙醇清洗RNA，并用DEPC水溶解。(3)逆转录PCRI.采用invitrogen公司的SuperScriptIIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR试剂盒，将外周血淋巴细胞总RNA逆转录成cDNA，通过nest-PCR扩增得到骆驼重链抗体的VHH片段。表1nest-PCR引物名称及序列引物引物序列nest-PCR1up5'>GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG<3'nest-PCR1down5'>GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC<3'nest-PCR2up5'>CCGGAATTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG<3'nest-PCR2down5'>GCCCAAGCTTTGAGGAGACGGTGACCTGGGT<3'II.nest-PCR125ul体系以上述所得的cDNA为模板，nest-PCR1up和nest-PCR1down为引物，进行PCR扩增反应。PCR反应体系：PCR条件：PCR反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，图3凝胶电泳结果显示，扩增基因片段在700bp处有特异性条带。切胶回收目的条带。III.nest-PCR225ul体系以nestPCR1DNA回收产物为模板，nest-PCR2up和nest-PCR2down为引物，进行PCR扩增反应。PCR反应体系：PCR条件：PCR反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，图4凝胶电泳结果显示，扩增基因片段在500bp处有特异性条带。切胶回收目的条带，即为VHH片段。(4)VHH片段的双酶切使用TAKARA公司的EcoRI和HindⅢ内切酶进行双酶切，反应体系如下：37℃水浴3小时，琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收。(5)T7噬菌体抗体库的构建选用Novagen公司的T7Select10试剂盒构建纳米抗体库。依据其说明书进行VHH片段和T7载体的连接以及T7噬菌体的包装。通过噬菌斑滴度测定，构建的HPVl6E7蛋白纳米抗体库滴度大约为1×107pfu/ml。(6)T7噬菌体抗体库的扩增选用液体裂解法对T7噬菌体抗体库进行扩增。在50mlTB培养基中加入1ml培养过夜的宿主BLT5403菌液，37℃，200r培养至OD600为0.6～1.0；加入⑸中所得的T7噬菌体抗体库，37℃，200r培养至有白色絮状沉淀出现时，停止培养；13000rpm,10min离心，上清为扩增的T7噬菌体抗体库；对其进行噬菌斑滴度测定，其滴度为1×1010pfu/ml。(7)检测HPVl6E7蛋白纳米抗体文库的多样性随机挑⑸中的噬菌斑于50ul10mMEDTA中,剧烈震荡混匀，65℃水浴15min，13000rpm离心10min，上清为粗提的噬菌体DNA；以其为模板，按照Novagen公司的T7Select10试剂盒说明书，进行PCR反应，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(见图5)，图5电泳结果显示，构建的HPVl6E7蛋白纳米抗体文库的重组阳性率为100％。然后对其测序，分析HPVl6E7蛋白纳米抗体文库的多样性。PCR反应体系如下：PCR条件如下：测序结果显示，17个单克隆噬菌斑，有15种核酸序列，并且这些序列翻译成的氨基酸序列也不相同，说明构建的HPVl6E7蛋白纳米抗体文库有很好的多样性。实施例3：运用镍离子金属螯合亲和层析介质Ni-NTA淘选HPV16E7纳米抗体。(1)Ni-NTA介质的清洗：取100ulNi-NTA介质于1.5mlEP管中，加1ml灭菌水，涡旋震荡仪混匀；3000rpm，30s离心，弃上清；共洗5次，最后一次用0.05％TBST代替灭菌水。(2)封闭：洗好的Ni-NTA介质加入1ml封闭液(0.5％BSA)，翻转摇匀1h；封闭结束后，1mlTBST洗4次。(3)负筛去除非特异结合的噬菌体：HPVl6E7的VHH-T7噬菌体库用TBST稀释至1ml，加入到封闭后的Ni-NTA介质中，置于翻转摇匀仪上，室温结合30min；离心，上清即为负筛后的T7噬菌体库。(4)与HPVl6E7特异结合的噬菌体的筛选：负筛后的HPVl6E7噬菌体库加入20ugHPVl6E7蛋白(1ug/ul)，室温结合30min。然后将混合物加入到封闭好的Ni-NTA介质中，室温结合30min；离心，弃上清。1mlTBST洗获得的沉淀，共洗5次；离心，弃上清；加入400ulTB培养基混匀，平均分为两份，一份用来测定筛选后的噬菌体的滴度，一份用来扩增筛选后的噬菌体。(5)筛选后的噬菌体的扩增：将筛选后的噬菌体加入到50mlOD600＝0.6的BLT5403宿主菌中，37℃震荡培养，培养至有白色絮状沉淀出现时，停止培养；离心，上清即为扩增的第一轮筛选后的噬菌体，置于4℃保存，并用于下一轮的筛选；按相同筛选步骤，筛选3-4轮。实施例4：ELISA鉴定特异性的HPVl6E7蛋白VHH-T7阳性克隆。上述最后一轮筛选所得的噬菌体，在150mm的TB固体培养基上培养，并挑选70个单克隆噬菌斑于3mlOD600＝0.6的BLT5403宿主菌中进行液体裂解法扩增，离心，上清于4℃保存，即为单克隆噬菌体；ELISA板每孔加入2ugHPVl6E7蛋白包被，置于4℃过夜，第二天0.5％BSA室温封闭1h；实验组每孔加入单克隆噬菌体，对照组加入等量的野生型T7噬菌体，室温孵育1-2h；200ulTBST洗去未结合的噬菌体，共洗5次，然后加入兔抗T7噬菌体10A抗体，室温孵育1-2h；TBST洗ELISA板3-5次，然后加入HRP标记的羊抗兔抗体，室温孵育1h；TBST洗ELISA板3-5次，然后加入显色液，避光反应10min，ELISA板置于酶标仪上，测吸光值，当实验孔与对照孔吸光值比值大于2时，判定其为阳性克隆；提取阳性克隆噬菌体的DNA进行测序。ELISA鉴定结果显示，获得30个阳性克隆。然后对其进行DNA测序，获得2种核苷酸序列；对其氨基酸序列进行分析，这两种序列均具有典型的纳米抗体结构，由框架区(FR1，FR2，FR4，FR4)和互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)构成。这两株单克隆噬菌体的核苷酸序列，氨基酸序列如下：HPVl6E7的VHH1：核苷酸序列(SEQIDNO.17)：CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTACACCAGCAGTAGCTGCAGCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGTTGGTCGCAACTATTTTTGCGGATGGTAGGACACGCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTAACACGGATGCACATGGCTCTTATAGTGACTATGACTGTGTGAATTGGAATAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA氨基酸序列(SEQIDNO.15)：QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTSSSCSMGWYRQAPGKERELVATIFADGRTRYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCNTDAHGSYSDYDCVNWNNYWGQGTQVTVSS框架区(FR1-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列：FR1(SEQIDNO.1)：QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASCDR1(SEQIDNO.5)：GYTSSSCSMGFR2(SEQIDNO.2)：WYRQAPGKERELVATCDR2(SEQIDNO.6)：IFADGRTRFR3(SEQIDNO.3)：YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCCDR3(SEQIDNO.7)：NTDAHGSYSDYDCVNWNNYFR4(SEQIDNO.4)：WGQGTQVTVSSHPVl6E7的VHH2：核苷酸序列(SEQIDNO.18)：GATGTGCAGCTGGTCAATACCATGAGTAACGAGAAGCTGGATGTAGAAGGCGTTACCAGCAAGTATGGGGTACGCCCAGATCAGATTATCGATTATTTAATGCTGATTGGCGACACTTCGGACAATATTCCCGGCGTTCCCAAGGTGGGGCCCAAGACGGCCGCCAAGTGGTTGGGCGAATATGGCAGTCTGGATGAACTGTTGCAGCATGCCGACAAAATCAAGGGGGTGGCCGGCCAGAATCTGGCCGGCAGCAGCTCCAACTTTGAAATGACGCGCAAACTGGTCACCGTCTCCTCA氨基酸序列(SEQIDNO.16)：DVQLVNTMSNEKLDVEGVTSKYGVRPDQIIDYLMLIGDTSDNIPGVPKVGPKTAAKWLGEYGSLDELLQHADKIKGVAGQNLAGSSSNFEMTRKLVTVSS框架区(FR1-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列：FR1(SEQIDNO.8)：DVQLVNTMSNEKLDVEGVTSKYGVRCDR1(SEQIDNO.12)：PDQIIDYLMLFR2(SEQIDNO.9)：IGDTSDNIPGVPKVGCDR2(SEQIDNO.13)：PKTAAKWLFR3(SEQIDNO.10)：GEYGSLDELLQHADKIKGVAGQCDR3(SEQIDNO.14)：NLAGSSSNFFR4(SEQIDNO.11)：EMTRKLVTVSS实施例5：HPVl6E7蛋白纳米抗体的诱导表达和纯化(1)HPVl6E7蛋白纳米抗体的诱导表达首先将HPVl6E7蛋白纳米抗体的基因序列用TAKARA公司的EcoRI和HindⅢ内切酶进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收酶切产物，分别将其插入到pET28a中，成功构建HPVl6E7蛋白纳米抗体的表达载体；将HPVl6E7蛋白纳米抗体的表达载体转化到BL21(DE3)中，涂卡那霉素抗性LB平板培养基，挑单克隆菌株，培养过夜。以1:100的比例将HPVl6E7蛋白纳米抗体表达菌加入到培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8时，IPTG诱导表达。离心菌液获得菌体沉淀，用裂解缓冲液重悬，置于冰盒内超声破碎，离心收集上清。(2)HPVl6E7蛋白纳米抗体的纯化通过Ni-IDA亲和层析的方法获得纯化的HPVl6E7蛋白纳米抗体。层析柱首先用菌体缓冲液清洗，加入Ni-IDA填充层析柱；将上述HPVl6E7蛋白纳米抗体表达菌菌体超声上清加入镍柱中，控制流速，使流穿液以2ml/min的流速流出；用至少3倍柱床体积的清洗缓冲液(40mmol/L咪唑)洗掉杂蛋白；用等体积的洗脱缓冲液(250mmol/L咪唑)洗脱目的蛋白，并收集洗脱液。然后用15％SDS-PAGE电泳检测HPVl6E7纳米抗体的表达纯化情况。(见图6)。SDS-PAGE电泳检测结果：图6结果显示，诱导后的HPVl6E7蛋白纳米抗体1表达菌与其未诱导的表达菌相比较，在20KD处有一条带，且符合目的蛋白的预期分子量；通过灰度分析，纯化所得的HPVl6E7蛋白纳米抗体的纯度大于90％。实施例6:HPVl6E7蛋白纳米抗体的免疫印迹亲和性分析对pSUMO-HPVl6E7质粒表达得到的HPV16E7蛋白及对照空质粒表达蛋白进行WesternBlot鉴定，结果表明HPVl6E7蛋白纳米抗体与HPVl6E7蛋白具有较好的结合能力，与空载体表达的蛋白不能结合，DAB显色后在大约35kDa位置有清晰的目标条带(图7)。实施例7:HPVl6E7蛋白纳米抗体的ELISA法亲和性分析以HPVl6E7蛋白和pSUMO空质粒表达蛋白包被酶标板，包被浓度10ug/ml，ELISA板每孔加200ul，4℃包被过夜。TBST洗ELISA板3次，加入0.5％BSA封闭液，室温封闭一小时。丢弃封闭液并用TBST洗3次，加入HPVl6E7纳米抗体，或对照wasabi纳米抗体，室温孵育一小时。TBST洗板3次后，加入1:1000稀释的兔抗HA单克隆抗体，200μl/孔，室温孵育一小时。TBST洗板3次，加入1:2000稀释的HRP标记羊抗兔二抗，200μl/孔，室温孵育一小时。TBST洗板3次，每孔加入100ul的TMB显色液，ELISA板置于酶标仪上，测450nm吸光值。结果见表2，ELISA检测结果显示：HPVl6E7纳米抗体对HPVl6E7的结合活性远远高于wasabi纳米抗体对照组及pSUMO空质粒表达蛋白组.。表2ELISA检测HPVl6E7纳米抗体的亲和性SEQUENCELISTING<110>东南大学<120>HPV16E7蛋白纳米抗体及其制备方法与应用<130>SG20161130001<160>18<170>PatentInversion3.5<210>1<211>25<212>PRT<213>VHH1的FR1序列<400>1GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlySerValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSer2025<210>2<211>15<212>PRT<213>VHH1的FR2序列<400>2TrpTyrArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluLeuValAlaThr151015<210>3<211>37<212>PRT<213>VHH1的FR3序列<400>3TyrAlaAspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAla151015LysAsnThrValTyrLeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThr202530AlaMetTyrTyrCys35<210>4<211>11<212>PRT<213>VHH1的FR4序列<400>4TrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer1510<210>5<211>10<212>PRT<213>VHH1的CDR1序列<400>5GlyTyrThrSerSerSerCysSerMetGly1510<210>6<211>8<212>PRT<213>VHH1的CDR2序列<400>6IlePheAlaAspGlyArgThrArg15<210>7<211>19<212>PRT<213>VHH1的CDR3序列<400>7AsnThrAspAlaHisGlySerTyrSerAspTyrAspCysValAsnTrp151015AsnAsnTyr<210>8<211>25<212>PRT<213>VHH2的FR1序列<400>8AspValGlnLeuValAsnThrMetSerAsnGluLysLeuAspValGlu151015GlyValThrSerLysTyrGlyValArg2025<210>9<211>15<212>PRT<213>VHH2的FR2序列<400>9IleGlyAspThrSerAspAsnIleProGlyValProLysValGly151015<210>10<211>22<212>PRT<213>VHH2的FR3序列<400>10GlyGluTyrGlySerLeuAspGluLeuLeuGlnHisAlaAspLysIle151015LysGlyValAlaGlyGln20<210>11<211>11<212>PRT<213>VHH2的FR4序列<400>11GluMetThrArgLysLeuValThrValSerSer1510<210>12<211>10<212>PRT<213>VHH2的CDR1序列<400>12ProAspGlnIleIleAspTyrLeuMetLeu1510<210>13<211>8<212>PRT<213>VHH2的CDR2序列<400>13ProLysThrAlaAlaLysTrpLeu15<210>14<211>9<212>PRT<213>VHH2的CDR3序列<400>14AsnLeuAlaGlySerSerSerAsnPhe15<210>15<211>125<212>PRT<213>VHH1的氨基酸序列<400>15GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlySerValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrSerSerSerCys202530SerMetGlyTrpTyrArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluLeuVal354045AlaThrIlePheAlaAspGlyArgThrArgTyrAlaAspSerValLys505560GlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnThrValTyrLeu65707580GlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaMetTyrTyrCysAsn859095ThrAspAlaHisGlySerTyrSerAspTyrAspCysValAsnTrpAsn100105110AsnTyrTrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120125<210>16<211>100<212>PRT<213>VHH2的氨基酸序列<400>16AspValGlnLeuValAsnThrMetSerAsnGluLysLeuAspValGlu151015GlyValThrSerLysTyrGlyValArgProAspGlnIleIleAspTyr202530LeuMetLeuIleGlyAspThrSerAspAsnIleProGlyValProLys354045ValGlyProLysThrAlaAlaLysTrpLeuGlyGluTyrGlySerLeu505560AspGluLeuLeuGlnHisAlaAspLysIleLysGlyValAlaGlyGln65707580AsnLeuAlaGlySerSerSerAsnPheGluMetThrArgLysLeuVal859095ThrValSerSer100<210>17<211>375<212>DNA<213>VHH1的核苷酸序列<400>17caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactc60tcctgtgcagcctctgggtacaccagcagtagctgcagcatgggctggtaccgccaggct120ccagggaaggagcgcgagttggtcgcaactatttttgcggatggtaggacacgctatgca180gactccgtgaagggccgattcaccatctcccgagacaacgccaagaacacggtgtatctg240caaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatgtattactgtaacacggatgcacat300ggctcttatagtgactatgactgtgtgaattggaataactactggggccaggggacccag360gtcaccgtctcctca375<210>18<211>300<212>PRT<213>VHH2的核苷酸序列<400>18GlyAlaThrGlyThrGlyCysAlaGlyCysThrGlyGlyThrCysAla151015AlaThrAlaCysCysAlaThrGlyAlaGlyThrAlaAlaCysGlyAla202530GlyAlaAlaGlyCysThrGlyGlyAlaThrGlyThrAlaGlyAlaAla354045GlyGlyCysGlyThrThrAlaCysCysAlaGlyCysAlaAlaGlyThr505560AlaThrGlyGlyGlyGlyThrAlaCysGlyCysCysCysAlaGlyAla65707580ThrCysAlaGlyAlaThrThrAlaThrCysGlyAlaThrThrAlaThr859095ThrThrAlaAlaThrGlyCysThrGlyAlaThrThrGlyGlyCysGly100105110AlaCysAlaCysThrThrCysGlyGlyAlaCysAlaAlaThrAlaThr115120125ThrCysCysCysGlyGlyCysGlyThrThrCysCysCysAlaAlaGly130135140GlyThrGlyGlyGlyGlyCysCysCysAlaAlaGlyAlaCysGlyGly145150155160CysCysGlyCysCysAlaAlaGlyThrGlyGlyThrThrGlyGlyGly165170175CysGlyAlaAlaThrAlaThrGlyGlyCysAlaGlyThrCysThrGly180185190GlyAlaThrGlyAlaAlaCysThrGlyThrThrGlyCysAlaGlyCys195200205AlaThrGlyCysCysGlyAlaCysAlaAlaAlaAlaThrCysAlaAla210215220GlyGlyGlyGlyGlyThrGlyGlyCysCysGlyGlyCysCysAlaGly225230235240AlaAlaThrCysThrGlyGlyCysCysGlyGlyCysAlaGlyCysAla245250255GlyCysThrCysCysAlaAlaCysThrThrThrGlyAlaAlaAlaThr260265270GlyAlaCysGlyCysGlyCysAlaAlaAlaCysThrGlyGlyThrCys275280285AlaCysCysGlyThrCysThrCysCysThrCysAla290295300当前第1页1 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