一种比伐卢定的合成方法与流程

本发明属于多肽药物制备方法
技术领域：
，特别涉及比伐卢定的固相片段合成方法。
背景技术：
：比伐卢定外文名或通用名为Bivalirudin，具有以下结构：D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-L-甘胺酰-L-甘氨酰-L-甘氨酰-L-甘氨酰-L-天冬酰氨酰-L-甘氨酰-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L异亮氨酰-L-脯胺酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-酪胺酰-L-亮氨酸比伐卢定(bivalirudin)是一种近年来应用于临床的直接凝血酶抑制剂，于2000年批准在美国上市，其有效抗凝成分为水蛭素衍生物片段，通过直接并特异性抑制凝血酶活性而发挥抗凝作用，作用可逆而短暂。早期的临床研究显示：比伐卢定抗凝治疗效果确切，且出血事件的发生率较低，和传统的肝素抗凝治疗相比使用更为安全。对于接受经皮冠状动脉介入治疗（PCI）的患者，比伐卢定可用于替代肝素。大多数比伐卢定的III期试验均使用缺血和出血结局的主要复合终点比较比伐卢定和肝素，这些试验发现比伐卢定优于或不劣于肝素。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提出一种新的比伐卢定的合成方法，该方法显著的提高了比伐卢定的收率与纯度，反应简单可控，适用于工业生产。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种比伐卢定的固相片段合成方法，其特点是：该方法以三苯甲基氯类型树脂为起始，采用固相合成1-10全保护肽树脂，将全保护十一肽从树脂上切割下来在固相中接入11-20肽树脂，经裂解得到比伐卢定粗品。本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来实现。本发明所述的比伐卢定的合成方法，其进一步优选的技术方案是：该方法的具体步骤如下：（1）在缩合剂与催化剂作用下，由Fmoc-Leu-OH和wangresin偶联得到Fmoc-Leu-wangresin脂；（2）脱去Fmoc，在缩合剂作用下，依次偶联Tyr,Glu,Glu,Ile,Glu,Glu,Phe,Asp得到Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-wangresin，即S1；（3）Fmoc-Gly-OH与CTCResin在有机碱作用下反应得到Fmoc-Gly-CTCResin；（4）脱去Fmoc，在缩合剂作用下，依次偶联Asn,Gly-Gly,Gly-Gly,Pro,Arg,Pro,D-Phe得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-CTCresin，即S2；其中X为氨基保护基；（5）使用切割试剂切割S1得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly，即S3；（6）在缩合剂作用下，S3与S1反应得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-wangresin，即S4；当X是不为Boc的氨基保护基时，先脱除X，再裂解得到比伐卢定粗品；当X为Boc时，直接经裂解得到比伐卢定粗品。本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来实现。本发明所述的比伐卢定的合成方法，其进一步优选的技术方案是：1、所述的缩合剂选自DIC、EDC·HCl中任意一种与HOBt、Cl-HOBt、HOAt、HOCt中任意一种的组合。2、所述的缩合剂选自HBTU、HATU、HCTU、TBTU、PyBOP、PyAOP中任意一种与DIEA、TEA、NMM中任意一种的组合。3、所述的氨基保护基X可以为现有技术中可适用于本发明的任何氨基保护基，优选自Boc或者Fmoc。4、使用切割试剂选自20%的TFE/DCM溶液或者1-2%的TFA/DCM溶液。5、步骤（3）中所述的CTCResin替代度为0.5-2.0mmol/g，优选为1.0-1.5mmol/g。6、步骤（1）中所述的WangResin替代度为0.3-1.5mmol/g,优选0.5-0.6mmol/g。7、所述的有机碱选自DIEA、NMM、Py、DMAP中任意一种。8、所述催化剂选自Py、DMAP中任意一种。本发明涉及的英文缩写所对应的中文名称见下表：英文缩写中文名称英文缩写中文名称Pro脯氨酸CTCResin2-氯-三苯甲基氯树脂Leu亮氨酸Wangresin王树脂Arg精氨酸TEA三乙胺Tyr酪氨酸NMMN-甲基吗啉Phe苯丙氨酸DIEAN,N-二异丙基乙胺Asp天冬氨酸DIC二异丙基碳二亚胺Asn天冬酰胺HOBt1-羟基苯并三氮唑Gly甘氨酸DMAP对二甲氨基吡啶Glu谷氨酸Boc叔丁氧羰基Ile异亮氨酸Trt三苯甲基Fmoc9-芴甲氧羰基TFE三氟乙醇tBu叔丁基TFA三氟乙酸pbf(2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基HOAt1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑PIP六氢吡啶DCM二氯甲烷Py吡啶DMFN,N-二甲基甲酰胺HBTU苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐EDC·HCI1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐HCTU6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯PyBOP六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷PyAOP(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐HATU2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯本发明提供的合成方法中，所用到的原料、试剂及Fmoc-Gly-Gly-OH均可由市场购得。与现有技术相比，本发明方法既避免了多Gly10杂质的产生又成功的降低了Arg偶联的难度，显著的提高了比伐卢定的收率与纯度。本发明工艺过程仅涉及氨基酸的缩合和脱保护，反应简单可控，适用于工业生产。附图说明图1为实验例制得的比伐卢定产品MS图；图2为实验例制得的比伐卢定产品HPLC图。具体实施方式下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1，一种比伐卢定的合成方法：该方法以三苯甲基氯类型树脂为起始，采用固相合成1-10全保护肽树脂，将全保护十一肽从树脂上切割下来在固相中接入11-20肽树脂，经裂解得到比伐卢定粗品。实施例2，一种比伐卢定的合成方法，该方法的具体步骤如下：（1）在缩合剂与催化剂作用下，由Fmoc-Leu-OH和wangresin偶联得到Fmoc-Leu-wangresin脂；（2）脱去Fmoc，在缩合剂作用下，依次偶联Tyr,Glu,Glu,Ile,Glu,Glu,Phe,Asp得到Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-wangresin，即S1；（3）Fmoc-Gly-OH与CTCResin在有机碱作用下反应得到Fmoc-Gly-CTCResin；（4）脱去Fmoc，在缩合剂作用下，依次偶联Asn,Gly-Gly,Gly-Gly,Pro,Arg,Pro,D-Phe得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-CTCresin，即S2；其中X为氨基保护基；（5）使用切割试剂切割S1得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly，即S3；（6）在缩合剂作用下，S3与S1反应得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-wangresin，即S4；当X是不为Boc的氨基保护基时，先脱除X，再裂解得到比伐卢定粗品；当X为Boc时，直接经裂解得到比伐卢定粗品。所述的缩合剂选自DIC、EDC·HCl中任意一种与HOBt、Cl-HOBt、HOAt、HOCt中任意一种的组合。或者选自HBTU、HATU、HCTU、TBTU、PyBOP、PyAOP中任意一种与DIEA、TEA、NMM中任意一种的组合。所述的氨基保护基X选自Boc或者Fmoc。使用切割试剂选自20%的TFE/DCM溶液或者1-2%的TFA/DCM溶液。步骤（3）中所述的CTCResin替代度为0.5-2.0mmol/g，优选为1.0-1.5mmol/g。步骤（1）中所述的WangResin替代度为0.3-1.5mmol/g,优选0.5-0.6mmol/g。所述的有机碱选自DIEA、NMM、Py、DMAP中任意一种。所述催化剂选自Py、DMAP中任意一种。实施例3，一种比伐卢定的合成方法实验：实验例1Fmoc-Leu-wangresin的制备称取wangresin（0.53mmol/g）47.2g置于反应柱中，加入DCM400mL氮气吹拂搅拌溶涨30min，抽干。称取Fmoc-Leu-OH26.5g，HOBt11.1g,DMAP0.9g置于烧杯中，加入30%DCM/DMF135mL,搅拌溶解，降温至3±2℃。量取DIC12.8mL加入上述烧杯中，反应温度10±2℃，反应10min。加入反应柱中，30±5℃氮气吹拂搅拌反应5小时，抽干溶剂，DMF洗涤3次，DCM洗涤4次，35℃鼓风干燥8小时，得Fmoc-Leu-wangresin55.6g，取代度0.47mmol/g。实验例2Fmoc-Leu-wangresin的制备称取wangresin（0.53mmol/g）47.2g置于反应柱中，加入DCM400mL溶涨30min，抽干。称取Fmoc-Leu-OH26.5g，HOBt11.1g置于烧杯中，加入30%DCM/DMF135mL,搅拌溶解，降温至3±2℃。量取DIC12.8mL加入上述烧杯中，反应温度10±2℃，反应10min。加入反应柱中。量取Py20mL加入反应柱中，60±5℃氮气吹拂搅拌反应5小时，抽干溶剂，DMF洗涤3次,DCM洗涤4次，35℃鼓风干燥8小时，得Fmoc-Leu-wangresin52.6g，取代度0.45mmol/g。实验例3Fmoc-Gly-CTCResin的制备取CTCResin(1.2mmol/g)50.00g置于多肽反应器中，加入DCM400mL氮气吹拂搅拌30分钟，使树脂充分溶胀后抽干DCM。称取Fmoc-Gly-OH53.46g,加入DMF340mL搅拌溶解，加入DIEA94.5mL，冰浴15分钟后加入多肽反应器中，氮气吹拂搅拌反应2小时后抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤4次，35℃鼓风干燥8小时，得Fmoc-Gly-CTCResin65.6g，取代度0.92mmol/g。实验例4S1肽树脂的制备取Fmoc-Leu-wangresin21.3g(10mmol)置于多肽反应器中，加入DCM200mL氮气吹拂搅拌30分钟，使树脂充分溶胀后抽干DCM。加入DBLK80mL脱Fmoc保护2次，5+15分钟，每次80mL。DMF洗涤5次，每次80mL，1分钟。称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH9.2g(20mmol),HOBt3.0g(22mmol),加入DMF80mL搅拌溶解，冰浴5分钟，加入DIC3.4mL(22mmol)，冰浴活化10分钟后加入多肽反应柱中，氮气吹拂搅拌反应1小时后抽干反应液，DMF洗涤3次，每次100mL。按此方法依次接入Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH。脱除Fmoc，得到S1肽树脂。实验例5S1肽树脂的制备取Fmoc-Leu-wangresin21.3g(10mmol)置于多肽反应器中，加入DCM200mL氮气吹拂搅拌30分钟，使树脂充分溶胀后抽干DCM。加入DBLK80mL脱Fmoc保护2次，5+15分钟，每次80mL。DMF洗涤5次，每次80mL，1分钟。称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH9.2g(20mmol),HBTU6.8g(19mmol)，加入DMF80mL搅拌溶解，冰浴5分钟，加入DIEA5.2mL(30mmol)，冰浴活化10分钟后加入多肽反应柱中，氮气吹拂搅拌反应1小时后抽干反应液，DMF洗涤3次，每次100mL。按此方法依次接入Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH。脱除Fmoc，得到S1肽树脂实验例6S2肽树脂的制备取Fmoc-Gly-CTCResin27.4g(25mmol)置于多肽反应器中，加入DCM200mL氮气吹拂搅拌30分钟，使树脂充分溶胀后抽干DCM。加入DBLK80mL脱Fmoc保护2次，5+15分钟，每次80mL。DMF洗涤5次，每次100mL，1分钟。称取Fmoc-Asn(Trt)-OH29.9g(50mmol),HOBt7.4g(55mmol),加入DMF100mL搅拌溶解，冰浴5分钟，加入DIC8.5mL(55mmol)，冰浴活化10分钟后加入多肽反应柱中，氮气吹拂搅拌反应1小时后抽干反应液，DMF洗涤3次，每次100mL，1分钟。按此方法依次接入Fmoc-Gly-Gly-OH,Fmoc-Gly-Gly-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Pro-OH,Boc-D-Phe-OH。DMF洗涤3次，DCM洗涤4次，35℃鼓风干燥8小时,得到S2肽树脂。实验例7S2肽树脂的制备取Fmoc-Gly-CTCResin27.4g(25mmol)置于多肽反应器中，加入DCM200mL氮气吹拂搅拌30分钟，使树脂充分溶胀后抽干DCM。加入DBLK80mL脱Fmoc保护2次，5+15分钟，每次80mL。DMF洗涤5次，每次100mL，1分钟。称取Fmoc-Asn(Trt)-OH29.9g(50mmol),HBTU16.1g(45mmol),加入DMF100mL搅拌溶解，冰浴5分钟，加入DIEA12.9mL(75mmol)，冰浴活化10分钟后加入多肽反应柱中，氮气吹拂搅拌反应1小时后抽干反应液，DMF洗涤3次，每次100mL，1分钟。按此方法依次接入Fmoc-Gly-Gly-OH,Fmoc-Gly-Gly-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Pro-OH,Boc-D-Phe-OH。DMF洗涤3次，DCM洗涤4次，35℃鼓风干燥8小时,得到S2肽树脂。实验例8S3全保护肽的制备取实验例6S2肽树脂，加入600mL1%TFA/DCM溶液中室温搅拌裂解2.0小时。滤去树脂，加入无水碳酸钾5g干燥8小时。过滤，浓缩至油状。实施例9S3全保护肽的制备取实验例7S2肽树脂肽树脂，加入600mL20%TFE/DCM溶液中室温搅拌裂解1.5小时。滤除树脂，树脂再加入300mL20%TFE/DCM溶液中室温搅拌裂解1.5小时后滤去树脂，合并滤液，浓缩至油状。实验例10S4肽树脂的制备取实验例8所得S3全保护肽(25mmol)，加入30%DCM/DMF200mL溶解后倒入烧杯中。称取HOBt3.7g(27.5mmol)加入烧杯中，溶解，降温至5℃。取DIC4.3mL(27.5mmol)加入上述已降温溶液中10±5℃反应15min，加入实施例4S1肽树脂中反应3小时。DMF洗涤3次，DCM洗涤4次，35℃鼓风干燥8小时,得到S4肽树脂。实验例11S4肽树脂的制备取实验例9所得S3全保护肽(25mmol)，加入30%DCM/DMF200mL溶解后倒入烧杯中。称取HATU8.6g(22.5mmol)加入烧杯中，溶解，降温至5℃。取DIEA6.5mL(37.5mmol)加入上述已降温溶液中10±5℃反应15min，加入实施例5S1肽树脂中反应3小时。DMF洗涤3次，DCM洗涤4次，35℃鼓风干燥8小时,得到S4肽树脂。实验例12裂解配制TFA:苯甲硫醚:EDT:苯甲醚=90:5:3:2(体积比)的裂解液400mL冰浴至5℃。取实施例10所得S4肽树脂加入上述裂解液中，25±5℃裂解2h，加入2400mL冰乙醚中析晶。离心，所得固体乙醚研洗离心3次，真空减压干燥。得粗肽31.4g，HPLC定量含目的肽16.7g，收率76.6%。本例所得产品MS，HPLC见图1-图2。以上所述仅是本发明的优选实施方式，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来应用和实现本发明技术。当前第1页1 2 3