专利名称：一种比伐卢定的制备方法
技术领域：
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种比伐卢定的制备方法。
背景技术：
比伐卢定(Bivalirudin),氨基酸序列如SEQ ID No. 3 所不，即 D-Phe-Pro-Arg-Prο-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-I Ie-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH,是一种应用于临床的凝血酶抑制剂，早期的临床研究表明比伐卢定抗凝治疗效果确切，且出血事件的发生率较低，和传统的肝素抗凝治疗相比使用更为安全。比伐卢定可通过结合于催化剂位点和循环及凝血酶血块的阴离子输出位点而直接抑制凝血酶的作用。关于比伐卢定的制备方法，国内外已有大量报道。中国专利CN101475631B报道了采用全液相方法合成比伐卢定。首先合成三条分别含有6，6，8个氨基酸全保护片段，然后在液相中将三个片段依次偶联。同时，专利CN102164609A和专利CN102264757A中亦报道了类似的全液相合成方法，只是将片段分别分为了 4条和5条。US20070093423报道了一种比伐卢定的制备方法，其采用的是片段缩合方法得到粗品，经HPLC纯化得到比伐卢定精肽的纯度大于98. 5%，总杂小于I. 5%，单杂小于I. 0%，[Asp9-比伐卢定]小于O. 5%。中国专利200910051311公开了一种比伐卢定的Fmoc固相顺序合成方法，采用王树脂为起始树脂，依次接入保护氨基酸，所得肽树脂采用三氟乙酸酸解得到比伐卢定粗品。W091/02750报道了一种采用Boc方法制备比伐卢定的方法，采用Merrifiled树脂为固相载体进行合成，最终采用HF酸解。目前的合成方法有的采用液相合成，但由于比伐卢定的结构属于多肽类似物，肽序长，液相反应较为繁琐，不易纯化，合成起来花费时间较长，收率低；此外，所述部分专利虽采用固相合成比伐卢定，但比伐卢定结构中含有一个-Gly-Gly-Gly-Gly片段，在依次偶联-Gly过程中，由于Gly自身特性，极易在主峰前后产生BivalirudinilGly和Bivalirudin±2Gly的杂质,这些杂质在后续分离时很难去除,且部分专利固相合成时,裂解用到HF，设备性能要求高，条件较为苛刻，不利于工业化生产。此外，比伐卢定肽序中含D-Phe，合成过程会产生其异构体L-Phe。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种比伐卢定的制备方法。该方法采用固相合成的多肽片段 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-GIy-Gly-Gly-OH 为原料,避免了 Bivalirudin土 IGly和Bivalirudin±2Gly的问题；此外，本发明采用特定偶联试剂使该异构体L-Phe的量大大降低；同时提高了产品的收率和纯度，操作简便，条件温和，有利于实现规模化的制备。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案本发明提供了一种比伐卢定的制备方法，包括如下步骤步骤I :取甘氨酸与氯树脂经第一偶联获得甘氨酸-氯树脂，取氨基酸依次经第二偶联获得第一肽树脂，经第一裂解获得序列如SEQ ID No. I所示的第一片段；步骤2 :取亮氨酸与固相载体经第三偶联获得亮氨酸-树脂，取氨基酸依次经第四偶联获得序列如SEQ ID No. 2所不的第_■妝树脂； 步骤3 :取第一片段与序列如SEQ ID No. 2所示的第二肽树脂固相偶联获得比伐卢定肽树脂，经第二裂解、纯化，即得；第二偶联的偶联剂为HOBt与DIC的混合物，HOBt、PyBOP与DIPEA的混合物，HOAt、PyAOP与DIPEA的混合物，HBTU, HOBt与DIPEA的混合物，HATU, HOAt与DIPEA的混合物。比伐卢定结构中含有一个-Gly-Gly-Gly-Gly片段，在依次偶联-Gly过程中，由于Gly自身特性,极易在主峰前后产生Bivalirudin± IGly和Bivalirudin±2Gly的杂质,这些杂质在后续分离时很难去除。本发明采用固相合成的多肽片段Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-GIy-Gly-Gly-OH 为原料，避免了 Bivalirudin+ IGly 和 Bivalirudin±2Gly 的问题。比伐卢定肽序中含D-Phe，合成过程会产生其异构体L-Phe，采用特定偶联试剂能够使该异构体L-Phe的量大大降低。在本发明提供的比伐卢定的制备方法中，步骤I中第二偶联的偶联剂为HOBt、PyBOP与DIPEA的混合物。作为优选，氯树脂为2-CTC-树脂。作为优选，步骤I中第一裂解所用裂解剂为三氟乙醇和二氯甲烷的混合试剂，混合试剂中三氟乙醇与二氯甲烷的体积比为1:4。作为优选，步骤3中固相偶联的偶联剂为DIC与HOBt的混合物，HBTU, HOBt与DIPEA的混合物或HATU、HOAt与DIPEA的混合物。作为优选，步骤3中固相偶联的偶联剂为HATU、HOAt与DIPEA的混合物。作为优选，步骤3中第二裂解的裂解剂为三氟乙酸、苯甲硫醚、苯酚、1，2_乙二硫醇、水和二异丙基娃烧的混合试剂。作为优选，裂解剂中三氟乙酸占裂解剂的体积百分数为81-89%，苯甲硫醚占裂解剂的体积百分数为2-6%，苯酚占裂解剂的体积百分数为2-6%，三异丙基硅烷占裂解剂的体积百分数为1_3%，1，2_乙二硫醇占裂解剂的体积百分数为2-6%，余量为水。作为优选，步骤I中第一肽树脂替代度为O. 5^1. Ommol/g,优选的步骤I中第一肽树脂替代度为O. 7mmol/go作为优选，步骤2 中固相载体选自 PAM Resin、HMPA-AM Resin、HMPA-MBHA Resin或者 Wang Resin,优选 Wang Resin。作为优选，步骤2中亮氨酸-树脂的替代度为O. 4"O. 8mmol/g,优选O. 5mmol/g。作为优选，步骤I具体为取甘氨酸与氯树脂经第一偶联获得甘氨酸-氯树月旨，去保护后，依次偶联 Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-0H>Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH,得到 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC 妝树脂，即第一肽树脂，再经第一裂解获得序列如SEQ ID No. I所示的第一片段。作为优选，步骤2具体为取亮氨酸与固相载体经第三偶联获得亮氨酸-树月旨，去保护后，依次偶联 Fmoc-Tyr (tBu) -OH> Fmoc-Glu (OtBu) -OH> Fmoc-Glu (OtBu) -OH>Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu (OtBu) _0H、Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Asn (Trt) -OH 和 Fmoc-Gly-OH 获得序列如 SEQ ID
4No. 2所示的第二肽树脂。本发明提供了一种比伐卢定的制备方法。该方法采用固相合成的多肽片段Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-GIy-Gly-Gly-OH为原料，在片段合成初始段就开始偶联-G-G-G-,区别于合成比伐卢定时中间顺次偶联-G-G-G-G-,能避免片段加减甘氨酸，解决了 Bivalirudin± IGly和Bivalirudin±2Gly的问题；此外，本发明采用特定偶联试剂使该异构体L-Phe的量大大降低；同时提高了产品的收率和纯度，操作简便，条件温和，有利于实现规模化的制备。且提高了产品的收率和纯度，操作简便，条件温和，有利于实现规模化的制备。
图I示对比例制得的比伐卢定的HPLC谱图；图2示实施例43制得的比伐卢定精肽的HPLC谱图。
具体实施例方式本发明公开了一种比伐卢定的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。PAM Resin、HMPA-AM Resin, HMPA-MBHA Resin、Wang Resin 和 2-CTC 树脂购自天津南开和成有限公司，各种保护氨基酸购自苏州天马有限公司，其它溶剂和试剂为普通市售品。说明书和权利要求书中所使用英文缩写的含义列于下表中
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义如下
Fmoc9-芴甲氧羰基
2-CTC树脂 2-三苯甲基氯树脂
tBu叔丁基
OtBu叔丁氧基
Pbf2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基
Trt三苯甲基
DCM二氯甲烷
DBLK20%六氢吡啶/DMF溶液
DIPEAN, N-二异丙基乙胺
TFE三氟乙醇
TIS二异丙基娃烧
DMFN, N-二甲基甲酰胺
DMAP4-二甲氨基吡啶
HPLC高效液相色谱法
EDTI，2-乙_■硫醇
TFA三氟乙酸
下面以具体的实施例，对本发明的技术方案做进一步的技术说明；但本发明并不限于这些实施例。实施例I :替代度为 O. 5mmol/g 的 Fmoc-Gly-CTC Resin 的制备称取替代度为I. Ommol/g的2-CTC树脂150g (O. 15mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取66. 9g (O. 225mmol )Fmoc-Gly-0H用DMF溶解，冰水浴下加入58. 2g (O. 45mmol) DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入182mL无水甲醇封闭30min。用DMF洗漆3次，DCM洗3次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为O. 511mmol/g。实施例2 :替代度为 I. Ommol/g 的 Fmoc-Gly-CTC Resin 的制备称取替代度为I. 2mmol/g的2-CTC树脂150g (180mmol )，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取107. Ig (360mmol) Fmoc-Gly-OH用DMF溶解，冰水浴下加入69. 8g (540mmol)DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入182mL无水甲醇封闭30min。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTC 树脂，检测替代度为 0. 986mmol/g。实施例3 :替代度为 0. 7mmol/g 的 Fmoc-Gly-CTC Resin 的制备称取替代度为I. 0mmol/g的2-CTC树脂150g (150mmol )，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取80. 3g (270mmol) Fmoc-Gly-OH用DMF溶解，冰水浴下加入58. 2g (450mmol)DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入182mL无水甲醇封闭30min。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，甲醇收缩抽干，得到Fmo-Gly-CTC树脂，检测替代度为O. 711mmol/g。实施例4 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 的制备称取实施例3制备的替代度为O. 711mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂155g(I IOmmol )，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30分钟后，用 DBLK 脱除 Fmoc 保护，然后用 DMF 洗涤 6 次。将 98. Ilg Fmoc-Gly-OH (330mmol), 53. 5gH0Bt(396mmol ),50. Og DIC(396mmol)溶于DMF溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh)。得到Fmoc-Gly-Gly-CTC Resin。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，顺次完成Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf) -OH和 Fmoc-Pro-OH 的偶联，得到 Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 264. 25g。用DBLK脱除上述得到的肽树脂的Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将127. 8gFmoc-D-Phe-OH (330mmol), 53. 5g HOBt (396mmol),61. 7mL DIC (396mmol)溶于 DMF 溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h (反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh)。得到Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 280. 25g。实施例5 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 的制备称取实施例3制备的替代度为O. 711mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂155g(I IOmmol )，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30分钟后，用 DBLK 脱除 Fmoc 保护，然后用 DMF 洗涤 6 次。将 98. Ilg Fmoc-Gly-OH (330mmol), 53. 5gH0Bt(396mmol ),50. Og DIC(396mmol)溶于DMF溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh)。得到Fmoc-Gly-Gly-CTC Resin。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，顺次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf) -OH和 Fmoc-Pro-OH 的偶联，得到 Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 263. 75g。 用DBLK脱除上述得到的肽树脂的Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将127. 8gFmoc-D-Phe-0H(330mmol)，53.5g H0Bt(396mmol),171.6g PyBOP(396mmol),115.2mLDIPEA(396mmol)溶于DMF溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh)。得到Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 282. 21g。实施例6 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 的制备称取实施例3制备的替代度为O. 711mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂155g(I IOmmol )，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30分钟后，用 DBLK 脱除 Fmoc 保护，然后用 DMF 洗涤 6 次。将 98. Ilg Fmoc-Gly-OH (330mmol), 53. 5gHOBtC396mmol ),50. Og DIC(396mmol)溶于DMF溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh)。得到Fmoc-Gly-Gly-CTC Resin。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，顺次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf) -OH和 Fmoc-Pro-OH 的偶联，得到 Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 265. 05g。用DBLK脱除上述得到的肽树脂的Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将127. 8gFmoc-D-Phe-0H(330mmol)，53. 5g H0At(396mmol), 171. 6g PyAOP(396mmol), 115. 2mLDIPEA(396mmol)溶于DMF溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh)。得到Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 279. 27g。实施例7 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 的制备称取替代度为O. 711mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂155g( IlOmmol),加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用 DMF 洗涤 6 次。将 98. Ilg Fmoc-Gly-OH (330mmol), 53. 5g HOBt (396mmol), 50. OgDIC (396mmol)溶于DMF溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h (反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh)。得到Fmoc-Gly-Gly-CTC Resin。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤,按照片段的顺序，顺次完成 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH 和 Fmoc-Pro-OH 的偶联，得至IJFmoc-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 263. 85g。用DBLK脱除上述得到的肽树脂的Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将127. 8gFmoc-D-Phe-OH (330mmol),53. 5g HOBt (396mmol), 125. Ig HBTU (396mmol)，115. 2mLDIPEA(396mmol)溶于DMF溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh)。得到Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 278. 36g。实施例8 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 的制备
称取替代度为O. 711mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂155g( IlOmmol),加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用 DMF 洗涤 6 次。将 98. Ilg Fmoc-Gly-OH (330mmol), 53. 5g HOBt (396mmol), 50. OgDIC (396mmol)溶于DMF溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h (反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh)。得到Fmoc-Gly-Gly-CTC Resin。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤,按照片段的顺序，顺次完成 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH 和 Fmoc-Pro-OH 的偶联，得至IJFmoc-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 265. 15g。用DBLK脱除上述得到的肽树脂的Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将127. 8gFmoc-D-Phe-OH (330mmol),53. 5g HOAt (396mmol), 125. Ig HATU (396mmol), 115. 2mLDIPEA(396mmol)溶于DMF溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh)。得到Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 278. 54g。实施例9 :替代度为 O. 4mmol/g 的 Fmoc-Leu-Wang Resin 的制备称取替代度为I. Ommol/g的Wang树脂120g( 120mmol),加入固相反应柱中,用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取84. 8g Fmoc-Leu-OH,38. 9g HOBt,36. 3g DIC、2. 93gDMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-Wang树脂，检测替代度为 O. 408mmol/go实施例10 :替代度为 O. 8mmol/g 的 Fmoc-Leu-Wang Resin 的制备称取替代度为I. Ommol/g的Wang树脂120g( 120mmol),加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取 127. 2g Fmoc-Leu-OH,58. 4g HOBt,54. 5g DIC、4. 4gDMAP溶于体积比为I: I的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-Wang树脂，检测替代度为 O. 807mmol/go实施例11 :替代度为 O. 5mmol/g 的 Fmoc-Leu-Wang Resin 的制备称取替代度为I. Ommol/g的Wang树脂120g(120mmol),加入固相反应柱中,用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取 101. 7g Fmoc-Leu-OH,46. 7g HOBt,43. 6g DIC、3. 5gDMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-Wang树脂，检测替代度为 O. 498mmol/g0实施例12 NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-Wang 肽树脂的制备称取实施例11制备的替代度为O. 498mmol/g的Fmoc-Leu-wang树脂120. 5g(60mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc 保护，然后用 DMF 洗涤 4 次，DCM 洗 2 次。将 82. 7gFmoc-Tyr (tBu)-OH (180mmol),29. IgHOBt (216mmol),27. 3g DIC (216mmol)溶于体积比为 1:1 的 DCM 和 DMF 混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h (反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，依次完成Fmoc-Glu (OtBu) -OH> Fmoc-Glu (OtBu) -OH>Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn (Trt) -0H> Fmoc-Gly-OH。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-Wang 树脂 248. 7g。实施例13 :替代度为 O. 4mmol/g 的 Fmoc-Leu-PAM Resin 的制备称取替代度为I. Ommol/g的PAM Resin 120g (120mmol),加入固相反应柱中，用DMF 洗涤 2 次，用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后，取 84. 8g Fmoc-Leu-OH,38. 9g HOBt,36. 3g DIC、2. 93g DMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-PAMResin，检测替代度为O. 409mmol/go实施例14 :替代度为 O. 8mmol/g 的 Fmoc-Leu-PAM Resin 的制备称取替代度为I. Ommol/g的PAM树脂120g (120mmol )，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取 127. 2g Fmoc-Leu-OH,58. 4g HOBt,54. 5g DIC,4. 4gDMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-PAM Resin,检测替代度为O. 809mmol/g。实施例15 :替代度为 O. 5mmol/g 的 Fmoc-Leu-PAM Resin 的制备称取替代度为I. Ommol/g的PAM树脂120g (120mmol )，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取 101. 7g Fmoc-Leu-OH,46. 7g HOBt,43. 6g DIC,3. 5gDMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-PAM Resin,检测替代度为O. 495mmol/g。实施例16 :替代度为 O. 4mmoI /g 的 Fmoc-Leu-HMPA-AM Resin 的制备称取替代度为I. Ommol/g的HMPA-AM Resin 120g (120mmol),加入固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2 次，用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后，取 84. 8gFmoc-Leu_0H、38. 9g HOBt、36. 3gDIC、2.93g DMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗漆4次，DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-HMPA-AMResin，检测替代度为O. 398mmol/g。
实施例17 :替代度为 O. 8mmoI /g 的 Fmoc-Leu-HMPA-AM Resin 的制备称取替代度为I. Ommol/g的HMPA-AM树脂120g( 120mmol )，加入固相反应柱中，用DMF 洗漆 2 次，用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后，取 127. 2gFmoc-Leu-0H,58. 4g HOBt,54. 5g DIC、4. 4g DMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗漆4次，DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-HMPA-AM Resin,检测替代度为0. 802mmol/go实施例18 :替代度为 0. 5mmol/g 的 Fmoc-Leu-HMPA-AM Resin 的制备称取替代度为I. 0mmol/g的HMPA-AM树脂120g( 120mmol )，加入固相反应柱中，用DMF 洗漆 2 次，用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后，取 101. 7gFmoc-Leu_0H、46. 7g HOBt,43. 6g DIC、3. 5g DMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗漆4次，DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-HMPA-AM Resin,检测替代度为0. 502mmol/go实施例19 :替代度为 0. 4mmoI /g 的 Fmoc-Leu-HMPA-MBHA Resin 的制备称取替代度为I. 0mmol/g 的 HMPA-MBHA Resin 120g (120mmol)，加入固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2 次，用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后，取 84. 8gFmoc-Leu_0H、38. 9g HOBt、36. 3gDIC、2.93g DMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗漆4次，DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-HMPA-MBHAResin，检测替代度为0. 403mmol/g。实施例20 :替代度为 0. 8mmoI /g 的 Fmoc-Leu-HMPA-MBHA Resin 的制备称取替代度为I. 0mmol/g的HMPA-MBHA树脂120g( 120mmol )，加入固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2 次，用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后，取 127. 2gFmoc-Leu_0H、58. 4g HOBt、54. 5gDIC、4. 4g DMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-HMPA-MBHAResin，检测替代度为0. 806mmol/g。实施例21 :替代度为 0. 5mmol/g 的 Fmoc-Leu-HMPA-MBHA Resin 的制备称取替代度为I. 0mmol/g的HMPA-MBHA树脂120g( 120mmol )，加入固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2 次，用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后，取 101. 7gFmoc-Leu_0H、46. 7g HOBt,43. 6gDIC、3. 5g DMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-HMPA-MBHAResin，检测替代度为0. 498mmol/g。实施例22 NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-PAM Resin 月太树脂的制备称取实施例15制备的替代度为0. 495mmol/g的Fmoc-Leu-PAM Resin树脂120. 5g(60mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc 保护，然后用 DMF 洗涤 4 次，DCM 洗 2 次。将 82. 7gFmoc-Tyr (tBu)-OH (180mmol),29. Ig HOBt (216mmol ),27. 3g DIC(216mmol)溶于体积比为 1:1 的 DCM 和 DMF 混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h (反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，依次完成Fmoc-Glu (OtBu) -OH> Fmoc-Glu (OtBu) -OH>Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn (Trt) -0H> Fmoc-Gly-OH。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-PAM Resin 树脂 244. 2g。实施例23 NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-HMPA-AM Resin 妝树脂的制备称取实施例18制备的替代度为O. 502mmol/g的Fmoc-Leu-HMPA-AMResin树脂120. 6g(60mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除 Fmoc 保护，然后用 DMF 洗涤 4 次，DCM 洗 2 次。将 82. 7g Fmoc-Tyr (tBu) -0H( 180mmol),29. Ig HOBt (216mmol ),27. 3g DIC(216mmol)溶于体积比为 1:1 的 DCM 和 DMF 混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h (反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，依次完成Fmoc-Glu (OtBu) -OH> Fmoc-Glu (OtBu) -OH>Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn (Trt) -0H> Fmoc-Gly-OH。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重 NH2_Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-HMPA-AM Resin 树脂 241. 7g。实施例24:NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-HMPA-MBHA Resin 肽树脂的制备称取实施例21制备的替代度为O. 498mmol/g的Fmoc-Leu-HMPA-MBHAResin树脂120. 6g(60mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除 Fmoc 保护，然后用 DMF 洗涤 4 次，DCM 洗 2 次。将 82. 7g Fmoc-Tyr (tBu) -0H( 180mmol),29. IgHOBt (216mmol),27. 3gDIC (216mmol)溶于体积比为 1:1 的 DCM 和 DMF 混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h (反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联步骤，按照片段顺序，依次完成Fmoc-Glu (OtBu) -OH> Fmoc-Glu (OtBu) -OH> Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile_0H、Fmoc-Glu(OtBu) _0H、Fmoc-Glu(OtBu) _0H、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn (Trt) -0H> Fmoc-Gly-OH。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重
NH2-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp (OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-HMPA-MBHA Resin 树脂 243. 3g。实施例25 :由以HOBt/DIC为偶联剂合成得到的多肽片段A :Fm0C-D-Phe-Pr0-Arg(Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-OH 的制备将实施例4 制备的 270g Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTCResin肽树脂置于裂解反应瓶中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFE DCM=20 :80(V/V))，室温搅拌2. 5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液,树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即多肽片段A粗肽124. 21g。重量收率为101. 7%, HPLC纯度为96. 4%。其中Fmoc-L-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH 纯度为 O. 03%。实施例26 :由以HOBt/PyBOP/DIPEA为偶联剂合成得到的多肽片段A =Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-GIy-Gly-Gly-OH 的制备将实施例5 制备的 270g Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTCResin肽树脂置于裂解反应瓶中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFE DCM=20 :80(V/V))，室温搅拌2. 5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液,树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即多肽片段A粗肽127. 27g。重量收率为106. 5%, HPLC纯度为98. 4%。其中Fmoc-L-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-OH 纯度为 0.05%，本法使得 L-Phe 含量最低。实施例27 :由以HOAt/PyAOP/DIPEA为偶联剂合成得到的多肽片段A =Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-GIy-Gly-Gly-OH 的制备将实施例6 制备的 270g Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTCResin肽树脂置于裂解反应瓶中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFE DCM=20 :80(V/V))，室温搅拌2. 5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液,树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即多肽片段A粗肽125. 13g。重量收率为104. 3%, HPLC纯度为96. 4%。其中Fmoc-L-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH 纯度为 O. 06%。实施例28 :由以HBTU/HOBt/DIPEA为偶联剂合成得到的多肽片段A =Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-GIy-Gly-Gly-OH 的制备将实施例7 制备的 270g Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTCResin肽树脂置于裂解反应瓶中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFE DCM=20 :80(V/V))，室温搅拌2. 5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液,树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即多肽片段A粗肽126. 21g。重量收率为105. 2%, HPLC纯度为96. 2%。其中Fmoc-L-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH 纯度为 O. 07%。实施例29 :由以HATU/HOAt/DIPEA为偶联剂合成得到的多肽片段A =Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-GIy-Gly-Gly-OH 的制备将实施例8 制备的 270g Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTCResin肽树脂置于裂解反应瓶中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFE DCM=20 :80(V/V))，室温搅拌2. 5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液,树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即多肽片段A粗肽123. 23g。重量收率为102. 7%, HPLC纯度为97. 4%。其中Fmoc-L-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH 纯度为 O. 09%。实施例30 :以 DIC/HOBt 为偶联的试剂，进行 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-ffang Resin 肽树脂的制备称取由实施例12 的方法制备的 316g (157. 4mmol)的 NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-AsP (OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-ffang肽树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将194. 2g实施例25制备的Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-OH 粗品(472. 2mmol),76. 5g HOBt (566. 6mmol),71. 5gDIC (566. 6mmol)溶于DMF中，加入固相反应柱中，室温反应2h (反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh，用DBLK脱除Fmoc保护。反应结束后用甲醇收缩，肽树脂真空干燥过夜，称重H-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-ffang Resin 妝树脂为 498. 2g。实施例31 :以 HBTU/HOBt/DIPEA 为偶联的试剂，进行 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-GIu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-ffang Resin 妝树脂的制备称取由实施例12 的方法制备的 316g (157. 4mmol)的 NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-AsP (OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-ffang肽树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将194. 2g实施例26制备的Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH 粗品(472. 2mmol)，76. 5gH0Bt (566. 6mmol), 179. Ig HBTU (566. 6mmol),73. 2gDIPEA (566. 6mmol)溶于DMF中，加入固相反应柱中，室温反应2h (反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh，用DBLK脱除Fmoc保护。反应结束后用甲醇收缩，肽树脂真空干燥过夜，称重H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-ffang Resin 妝树脂为 497. 3g。实施例32 :以 HATU/HOAt/DIPEA 为偶联的试剂，进行 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-ffang Resin 妝树脂的制备称取由实施例12 的方法制备的 316g (157. 4mmol)的 NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-AsP (OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-ffang肽树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将194. 2g实施例27制备的Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH 粗品(472. 2mmol)，76. 5gH0At (566. 6mmol), 179. Ig HATU (566. 6mmol),73. 2g DIPEA (566. 6mmol)溶于DMF中，加入固相反应柱中，室温反应2h (反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh，用DBLK脱除Fmoc保护。反应结束后用甲醇收缩，肽树脂真空干燥过夜，称重H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu (OtBu)-Glu(OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-ffang Resin 妝树脂为 498. 7g。实施例33 :以 HATU/HOAt/DIPEA 为偶联的试剂，进行 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-PAMResin 妝树脂的制备称取实施例22 制备的 244. 2g (BOmmoI )的 NH2-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp (OtBu)-Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-PAM Resin 妝树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用 DMF 洗涤 6 次。将 209. 34g 实施例 28 制备的 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH 粗品(180mmol)，29. 18gH0At (180mmol),68. 2g HATU (180mmol),62. 8mlDIPEA(180mmoI)溶于DMF中，加入固相反应柱中，室温反应2h (反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh，用DBLK脱除Fmoc保护。反应结束后用甲醇收缩，肽树脂真空干燥过夜，称重H-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-PAM Resin 妝树脂为 313. 8g。实施例34 :以 HATU/HOAt/DIPEA 为偶联的试剂，进行 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-HMPA-AM Resin 妝树脂的制备称取实施例23 制备的 241. 7g (60mmol)的 NH2-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp (OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-HMPA-AM Resin肽树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将209. 34g实施例29制备的Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-OH 粗品(180mmol)，g29. 18gH0At (180mmol), 68. 2g HATU (180mmol), 62. 8mlDIPEA(180mmoI)溶于DMF中，加入固相反应柱中，室温反应2h (反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh，用DBLK脱除Fmoc保护。反应结束后用甲醇收缩，肽树脂真空干燥过夜，称重H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-HMPA-AM Resin 肽树脂为 311. 8g。实施例35 :以 HATU/HOAt/DIPEA 为偶联的试剂，进行 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-HMPA-MBHA Resin 妝树脂的制备称取实施例24 制备的 243. 3g(60mmol)的 NH2-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp (OtBu)-Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-HMPA-MBHA Resin肽树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将实施例25制备的209. 34gFmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-OH 粗品(180mmol)，g29. 18gH0At (180mmol), 68. 2g HATU (180mmol), 62. 8mlDIPEA(180mmoI)溶于DMF中，加入固相反应柱中，室温反应2h (反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh，用DBLK脱除Fmoc保护。反应结束后用甲醇收缩，肽树脂真空干燥过夜，称重H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-HMPA-MBHAResin 肽树脂为 308. 9g。实施例36 比伐卢定粗肽的制备将实施例30 制备的 450gH-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-Wang肽树脂置于裂解反应其中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA :苯酚苯甲硫醚EDT 7jC TIS=80 :6 :5 :5 :3 :1 (V/V))，室温搅拌2. 5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，S卩比伐卢定粗肽314. 3g。重量收率为101.9%，HPLC 纯度为 85. 9%。实施例37 比伐卢定粗肽的制备将实施例31 制备的 450gH-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-Wang肽树脂置于裂解反应其中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA :苯酚苯甲硫醚=EDT :水TIS=89 3 3 2 2 1 (V/V))，室温搅拌2. 5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即比伐卢定粗肽315. 2g。重量收率为102. I %，HPLC 纯度为 84. 9%。实施例38 比伐卢定粗肽的制备将实施例32 制备的 450gH-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-Wang肽树脂置于裂解反应其中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA :苯酚苯甲硫醚EDT 7jC TIS=85 :5 :4 :3 :2 :1 (V/V))，室温搅拌2. 5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即比伐卢定粗肽316. 5g。重量收率为102. 6%，HPLC 纯度为 85. 9%。实施例39 比伐卢定粗肽的制备将实施例30 制备的 450gH-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-Wang肽树脂置于裂解反应其中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA :苯酚苯甲硫醚=EDT :水TIS=82 5 5 4 3 1 (V/V))，室温搅拌2. 5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即比伐卢定粗肽319. 3g。重量收率为103. 5%，HPLC 纯度为 88. 9%。实施例40 比伐卢定粗肽的制备将实施例33 制备的 245gH-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-PAM Resin肽树脂置于裂解反应其中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA :苯酚:苯甲硫醚EDT 7jC TIS=82 :5 :5 :4 :3 :1 (V/V))，室温搅拌2. 5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即比伐卢定粗肽129. Sg。重量收率为99. 2%, HPLC 纯度为 76. 2%。实施例41 比伐卢定粗肽的制备将实施例34 制备的 245gH-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-HMPA-AM Resin肽树脂置于裂解反应其中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA 苯酚苯甲硫醚EDT 7jC TIS=82 :5 :5 :4 :3 :1 (V/V))，室温搅拌2. 5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即比伐卢定粗肽131. 5g。重量收率为 100. 6%, HPLC 纯度为 77. 9%。实施例42 比伐卢定粗肽的制备将实施例35 制备的 245gH-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp (OtBu)-Phe-Glu (OtBu)-Glu (OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-HMPA-MBHA Resin肽树脂置于裂解反应其中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA :苯酚苯甲硫醚=EDT :水TIS=82 5 5 4 3 1 (V/V))，室温搅拌2. 5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即比伐卢定粗肽129. 6g。重量收率为99. 0%, HPLC纯度为79. 2%。实施例43 比伐卢定粗肽纯化称取实施例36制备得到的12. 75g比伐卢定粗肽用400ml水溶解后，采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50 X 250mm反相C18柱，常规O. 2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到比伐卢定精肽4. 45g，HPLC纯度99. 63 %，其中,bivalirudin-Gly 为 O. Ol %, bivalirudin+Gly 为 O. 05%, bivalirudin(L-Phe)为 O. 03%。精肽谱图见图2。实施例44 比伐卢定粗肽纯化称取由实施例40肽树脂为载体制备得到的14. 75g比伐卢定粗肽用400ml水溶解后，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50X250mm反相C18柱，常规O. 2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到比伐卢定精肽4. 85g, HPLC 纯度 99. 1%。实施例45 比伐卢定粗肽纯化称取由实施例41肽树脂为载体制备得到的13. 45g比伐卢定粗肽用400ml水溶解后，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50X250mm反相C18柱，常规O. 2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到比伐卢定精肽4. 55g, HPLC 纯度 99. 3%。实施例46 比伐卢定粗肽纯化称取由实施例42肽树脂为载体制备得到的13. 35g比伐卢定粗肽用400ml水溶解后，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50X250mm反相C18柱，常规O. 2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到比伐卢定精肽4. 37g, HPLC 纯度 99. 2%。
对比例称取替代度为I. Ommol/g的Wang树脂12g (12mmol),加入固相反应柱中，用DMF洗涤 2 次，用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后，取 8. 5g Fmoc-Leu-OH,3. 9g HOBt,3. 6g DIC,O. 30gDMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。然后加入18. 9g吡啶和24. 5g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-Wang树脂15. Og,检测替代度为O. 502mmol/go称取替代度为O. 502mmol/g 的 Fmoc-Leu-Wang 树脂 3. 98g (2mmol),加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用20%DBLK溶液脱保护5+7分钟，用 DMF 洗涤 6 次。将 2. 76gFmoc-Tyr (tBu)-OH (3. Ommol),O. 97g HOBt (3. 6mmol),0. 99gDIC (3. 9mmol)溶于体积比为I: I的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应lh)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，依次完成 Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-0H> Fmoc-Phe-OH> Fmoc-Asp(OtBu)-0H>Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-Pro-OH 和 Fmoc-D-Phe-OH 的偶联，并脱除最后的Fmoc保护基团，用DMF洗6次，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得比伐卢定肽树脂8. 58g。将上述得到的比伐卢定肽树脂8. 58g置于裂解反应瓶中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA :苯酚苯甲硫醚=EDT :水TIS=82 5 5 4 3 1 (V/V))，室温搅拌2. 5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即比伐卢定粗肽4. 24g。重量收率为97. 2%，HPLC纯度为76. 5%。称取制备得到的比伐卢定粗肽4. 24g比伐卢定粗肽用120ml水溶解后，采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50X250_反相C18柱，常规O. 2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到比伐卢定精肽I. 48g，HPLC纯度 96. 54%,其中，bivalirudin-Gly 为 O. 62%, bivalirudin+Gly 为 O. 93%, bivalirudin(L-Phe)为I. 61%。谱图见图I。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种比伐卢定的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 步骤I :取甘氨酸与氯树脂经第一偶联获得甘氨酸-氯树脂，取氨基酸依次经第二偶联获得第一肽树脂，经第一裂解获得序列如SEQ ID No. I所示的第一片段； 步骤2 :取亮氨酸与固相载体经第三偶联获得亮氨酸-树脂，取氨基酸依次经第四偶联获得序列如SEQ ID No. 2所不的第_■妝树脂； 步骤3 :取所述第一片段与所述序列如SEQ ID No. 2所示的第二肽树脂固相偶联获得比伐卢定肽树脂，经第二裂解、纯化，即得； 所述第二偶联的偶联剂为HOBt与DIC的混合物，HOBt、PyBOP与DIPEA的混合物，HOAt、PyAOP与DIPEA的混合物，HBTU, HOBt与DIPEA的混合物，HATU, HOAt与DIPEA的混合物。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤I中所述第二偶联的偶联剂为HOBt、PyBOP 与 DIPEA 的混合物。
3.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述氯树脂为2-CTC-树脂。
4.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤I中所述第一裂解所用裂解剂为三氟乙醇和二氯甲烷的混合试剂，所述混合试剂中三氟乙醇与二氯甲烷的体积比为1:4。
5.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述固相偶联的偶联剂为DIC与HOBt的混合物，HBTU, HOBt与DIPEA的混合物或HATU、HOAt与DIPEA的混合物。
6.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述固相偶联的偶联剂为HATU, HOAt与DIPEA的混合物。
7.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述第二裂解的裂解剂为三氟乙酸、苯甲硫醚、苯酚、I，2-乙二硫醇、水和三异丙基硅烷的混合试剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，以体积百分数计，所述裂解剂中包括三氟乙酸81-89%，苯甲硫醚2-6%，苯酚2-6%，三异丙基硅烷1_3%，1，2-乙二硫醇2_6%，余量为水。
9.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤I中所述第一肽树脂替代度为O.5 L 0mmol/go
10.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述固相载体选自PAMResin> HMPA-AM Resin、HMPA-MBHA Resin 或者 Wang Resin。
11.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述亮氨酸-树脂的替代度为 O. 4 O. 8mmol/g0
12.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤I具体为取甘氨酸与氯树脂经第一偶联获得甘氨酸_氯树脂，去保护后，依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -0H> Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH,获得第一妝树脂，再经第一裂解获得序列如SEQ ID No. I所示的第一片段。
13.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤2具体为取亮氨酸与固相载体经第三偶联获得亮氨酸-树脂，去保护后，依次偶联Fmoc-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-0H> Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-0H>Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Asn (Trt) -OH 和 Fmoc-Gly-OH 获得序列如 SEQ ID No. 2 所不的第二妝树脂。
全文摘要
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种比伐卢定的制备方法。该方法采用固相合成的多肽片段Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH为原料，避免了Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly的问题；此外，本发明采用特定偶联试剂使该异构体L-Phe的量大大降低；同时提高了产品的收率和纯度，操作简便，条件温和，有利于实现规模化的制备。
文档编号C07K7/08GK102924575SQ20121042801
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者朱日成, 宓鹏程, 刘建, 马亚平, 袁建成 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司