中国儿童矮小症易感基因snp分型用试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域中SNP分型检测领域，具体涉及一种中国儿童矮小 症易感基因SNP分型试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 儿童矮小症（shortstature，SS)的发生率为3%，是儿科医生最常见的临床难题 之一，并严重影响着儿童今后的发育状况、心理状态以及未来的社会、工作竞争。身材矮小 儿童学习和未来的工作均会受到不同程度的影响，因而近几年该问题在国内外日趋受到社 会和家庭的关注，临床就诊患者也随之增多，故对其病因的探索有着特殊的意义。矮小症 具有复杂的遗传背景。对该病染色体上易感基因的探究仍然是目前的研究热点和努力方 向。特发性身材矮小是目前儿科内分泌专业医生日益关注的问题，了解这一病症的基本概 念、诊治、病因和发病机制的研究进展有助于指导临床工作，提高研究水平，使更多的身材 矮小儿童得到更明确的诊断和更恰当的治疗。随着分子遗传学的进展，人们发现矮小症是 多基因遗传病，许多国家都在开展矮小症候选基因研究，到目前为止已经发现500余种基 因位点与矮小症的发生有关，得到广泛证实的与身高密切相关的基因主要包括生长激素 受体（6??基因、胰岛素样促生长因子受体（/67^-/们基因、基因、精子相关的抗原17 (7)基因、M7SZ堪因、"份7基因、"/577份/?因、乂厂崩基因等。
[0003] 目前国内常规用于矮小症基因变异的主要检测方法是限制性片段长度多态性法 (RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)，其原理是当变异影响到某一限制 性内切酶的酶切位点时，简单地通过酶切处理患者的PCR产物继而电泳检测是否有变异的 方法。但是这种方法存在耗时长，操作繁琐，准确度不高等缺点。也有利用PCR结合DNA测 序方法进行基因多态性位点的检测，但是这种方法在大规模人群筛查或检测多个基因多个 位点的应用受到一定限制。因此有必要建立一种高通量、高效能、低成本的矮小症肥胖易感 基因SNP分型方法，以实现临床快速检测或规模化人群筛查。
[0004] SNaPshot技术是一种基于单碱基延伸原理的SNP分型新方法，包括三个基本步 骤：扩增、引物延伸和分析。
[0005] 用单一PCR或多重PCR扩增包括SNP位点在内的区域，然后向最初反应管或板孔 中直接加入核酸外切酶（Exonuclease，Exo)消化单链引物，以及奸-碱性磷酸酶（Shrimp AlkalinePhosphatase，SAP)消化未结合的dNTP底物。去除引物和dNTP，可有效避免其在 随后引物反应中的干扰。在ExoSAP酶处理后的PCR产物中加入SNP延伸产物、四种荧光标 记的ddNTP混合物以及聚合酶共同完成引物延伸，最后用GeneMapper软件进行等位基因自 动化分析。电泳检测的峰高受延伸引物的浓度影响，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延 伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色。SNPs作为第三代遗传标记应用于疾病基因的定位、 克隆和鉴定，具有快速、简便、高通量的特点。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对目前中国儿童矮小症易感基因SNP位点的特点，选择有密切 相关性的12个SNP位点作为筛查目标，弥补目前现有SNP分型筛查方法的不足，提供一种 简单、高通量、高效能、低成本的适合中国儿童矮小症易感基因SNP位点分型试剂盒及其使 用方法。
[0007] 解决上述技术问题的技术方案是：一种中国儿童矮小症易感基因SNP分型用试剂 盒，该试剂盒包括以下内容： (1) PCR反应试剂：包括10XPCR缓冲液、Mg2+离子、底物dNTP、FastTaq酶，SNaPshot 混合液； (2) 按一定比例混合的针对8个矮小症易感基因12个区段进行多重PCR扩增的正向引 物和反向引物； (3) 按一定比例混合的针对8个矮小症易感基因12个SNP位点的PCR延伸引物； (4) PCR产物纯化试剂：包括核酸外切酶、虾-碱性磷酸酶及其配套的缓冲液； (5) 对照标本：包括单个SNP位点纯合、杂合突变的阳性对照标本、阴性对照标本； 所述试剂盒以57你?77基因rsl7038182位点、M7SZ堪因rsl378850位点、基因 rsl812175 位点、"/577份基因rsl0946808 位点、说基因rs8041863 位点、6S?基因rs6182 位点、6??基因rs6184 位点、6S?基因rs4410646 位点、6??基因rsl2515480 位点、 6??基因rs2940913位点、基因rsl976667位点和/猫基因rs3099位点为检测对 象，针对每个SNP位点的突变分别设计出扩增引物和延伸引物，针对各个SNP位点进行多重 PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，同时获得12个SNP位点的基因型； 所述57你?7堪因rsl7038182位点扩增的正向引物和反向引物是5'-CATGCAGATTCCTC CTGAGAAC-3' 和 5' -CATGGCCAGGTGTGTCTTGA-3' ； 所述M7SZ堪因rsl378850位点扩增的正向引物和反向引物是5'-GCTTTTCCCTCCCCAA ATG-3' 和 5' -CAGCTGGGCAAGACCATTAAC-3' ； 所述基因rs181217 5位点扩增的正向引物和反向引物是5'-GGCAACCGTGACCTATT CTACT-3' 和 5' -GGCAAAGTCGCACACAAATC-3' ； 所述"/577份/?因rsl0946808位点扩增的正向引物和反向引物是5'-GAGCCAGAGGC TATGATGAACT-3' 和 5' -CCAGCGTCTCCAGGACTTATT-3' ； 所述基因rs8041863位点扩增的正向引物和反向引物是5'-GGCCATCCTAACAACC TCATC-3' 和 5' -AGCCAGGCAACCATGAACTT-3' ； 所述6??基因rs6182位点扩增的正向引物和反向引物是5'-AGAGGTTGCTCAGCCACAGA-3 '和 5' -GACCACACTACCTGCTGGTGTAA-3' ； 所述6??基因rs6184位点扩增的正向引物和反向引物是δ'-Ο^ΤΟΟσΚΧ??ΑΟΑ??ΑΑ-β'和 5' -GCAAGGCAGTCGCATTGAG-3' ； 所述6S?基因rs4410646位点扩增的正向引物和反向引物是5'-ACTTCGTGGAAGGCATA GGA-3' 和 5' -CTGCAAGCCACACCTCACTG-3' ； 所述6??基因rsl2515480位点扩增的正向引物和反向引物是5'-CCATGGTGAATGGGAGC TTA-3' 和 5' -CCGTGCATCCATGCATTG-3' ； 所述6??基因rs2940913位点扩增的正向引物和反向引物是5'-GAGGCAGCAGGTGTCTCT GTAG-3' 和 5' -TTCTACTCTTGCGGCTCTGTG-3' ； 所述/67^-7#基因rs1976667位点扩增的正向引物和反向引物是5'-GTGCCATCCAGCAA CTATAGG-3' 和 5' -TCTACAGCGTCCTCTGCATTCT-3' ； 所述/猫基因rs3099位点扩增的正向引物和反向引物是5'-ACACTGGCTCCTGCCATCTC-3' 和 5' -CATCAACTGAGGCGCAAGC-3' ； 所述 57^^77 基因rsl7038182 位点的延伸引物是（T)16GGGCTCCAGTTGGAGTTCT; 所述M7SZ堪因rsl378850位点的延伸引物是⑴22GCTGGGCAAAAGCTAAAT; 所述 基因rsl812175 位点的延伸引物是（T)26AAGAACCGTAGAATGCACC; 所述基因rsl0946808 位点的延伸引物是（T)33AGCCCTACTGGCAACTG; 所述基因rs8041863位点的延伸引物序列是（T)34GGCAGGTTGAGTAGAAAGTGT; 所述 6S?基因rs6182 位点的延伸引物是（T)3SAACTCACCTTATCATGATGCTT; 所述6??基因rs6184位点的延伸引物是（T)45ACATGTTCTCCTGTCCCAG; 所述 6S?基因rs4410646 位点的延伸引物是（T)1SAAGTGTATGCCATATCCAGC; 所述 6??基因rsl2515480 位点的延伸引物是（T) 34CTTTGTGTTCTAAATGAAAGTGTC; 所述6??基因rs2940913位点的延伸引物是⑴32GGACAAAGACATAGGCATCAG; 所述 /67^-7# 基因rsl976667 位点的延伸引物是（T)56ACGGGCAGGGGAGCA; 所述/猫基因rs3099位点的延伸引物是⑴44CTATGACTACACCACGACG。
[0008] 本发明的进一步技术方案是：所述针对8个矮小症易感基因12个区段进行多重 PCR扩增的正向引物和反向引物的终浓度为0. 1μΜ。
[0009] 所述针对8个矮小症易感基因12个SNP位点的PCR延伸引物的终浓度分别为： 57你?77 基因rsl7038182 位点为 0· 10μΜ堪因rsl378850 位点为 0· 10μΜ;β?/75 基因rsl812175位点为0· 15μΜ;"/577份基因rsl0946808位点为0· 20μΜ;说基因 rs8041863 位点为 0.15 基因rs6182 位点为 0.15 基因rs6184 位点为 0.10 基因rs4410646 位点为 0.20 基因rsl2515480 位点为 0.10μΜ; 6??基因rs2940913 位点为(λ10μΜ; 基因rsl976667 位点为(λ10μΜ;/猫基因 『83099位点为0.15以]?。
[0010] 本发明的另一技术方案是：上述中国儿童矮小症易感基因SNP分型用试剂盒的使 用方法，包括以下步骤： (1) 8个矮小症易感基因12个SNP位点进行单对引物PCR扩增； (2) 8个矮小症易感基因12个SNP位点分为2组进行多重PCR扩增； (3) 多重PCR扩增产物纯化； (4) 进行SNaPshot延伸反应优化； (5) 延伸产物纯化； (6) 在ABI3730测序仪上进行扫板分析和GeneMapperID-XVersion1.4软件数据分 析。
[0011] 本发明使用PrimerPremier5引物设计程序(加拿大PREMIER生物软件公司提 供软件）协助设计引物，通过多重PCR扩增，使被检测样本的12个SNP位点得到扩增富集。 PC