Cyp2c19基因分型检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种用于诊断CYP2C19基因的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]细胞色素P450( CYP)是一组结构和功能相关的超家族基因编码的同工酶。哺乳动物组织中P450在药物和异型生物的代谢、类固醇激素合成、脂溶性维生素代谢以及多未饱和脂肪酸转化为生物活性分子的过程中都起着重要作用。因其在外源性化合物(包括药物和毒物)的生物转化中起着十分重要的作用，所以它的活性决定药物的代谢速率，与药物的清除率有着直接关系，是药物代谢的第一相酶，因而又称药物代谢酶。P450酶系组成复杂，由基因多样性控制，称为P450基因超家族。在P450超家族中，人类编码细胞色素P450基因分属于17个基因家族的42个家族。其中涉及体内大多数药物代谢的主要有3个基因家族(CYP1、CYP2、CYP3)。
[0003]CYP2C19 是细胞色素 P450 (Cytochrome P450，CYP)酶系的重要一员，CYP2C19 基因cDNA全长1940，含有9个外显子，编码区为1473bp。CYP2C19是S-MP4-羟化酶，在MP代谢中起着重要作用。S-MP羟化代谢主要是由单基因CYP2C19编码表达的CYP2C19酶蛋白介导，且其羟化代谢不仅存在个体差异、种族差异及性别差异，还具有多态性，即快代谢型和慢代谢型。白种人中的PM发生率为3%5%，东方人中PM发生率为13%23%，黑人介于白种人和东方人之间。在中国人中，CYP2C19等位基因主要是*1，*2，*3型。*2、*3等位基因编码的酶无活性，由此导致的慢代谢在中国人中的发生率约为35%。其他一些通过CYP2C19代谢的药物(如氯吡格雷、美芬妥英、奥美拉唑、普萘洛尔、地西泮、去甲地西泮、舍曲林等)随患者基因型不同，其疗效和副作用也有明显不同。因此根据检测CYP2C19基因型的多态性来选择用药或者选择最小有效剂量治疗方案有重要的临床意义。
[0004]有研宄指出CYP2C19基因的遗传多态性还与多种肿瘤癌症的发生有关。研宄表明，CYP2C19可能参与食管癌、胃癌、肺癌、急性白血病鳞状细胞肺癌、肝癌等前致癌物的活化，即CYP2C19基因的突变将增加患食管癌、胃癌、肺癌、急性白血病鳞状细胞肺癌、肝癌的危险性。因此，对人群中CYP2C19基因进行分型检测，能为临床上对某些肿瘤的易感性预测以及早期癌变预警提供重要的理论依据，有助于肿瘤癌症的前期预防。
[0005]根据CYP2C19基因型改变而引起酶代谢活性的改变，可将人群根据对药物代谢能力分为三大类:药物强代谢型(EM，extensive metabolisers)CYP2C19野生型，CYP2C19杂合型代表的是中间代谢型(頂)，弱代谢型(PM)为突变型纯合子。CYP2C19*2在中国人中发生率是30%，CYP2C19*3是5%.CYP2C19*17等位基因为超快代谢型，在中国人中约4%携带率。而这几种突变几乎涵盖了中国人所有的弱代谢型(PM)。
[0006]目前对于CYP2C19基因突变点的常用检测方法有:(I)PCR-RFLP基于突变的发生而形成的限制性内切酶酶切位点的消失或增加的原理。是目前最简单、最常见的一种检测点突变的技术，操作简单，特异性较高。但无法分辨杂合子，只能识别有限的多态性。(2)PCR-SSCP法，扩增的DNA片段在非变性凝胶电泳中，因电泳迀移率不同，因而可将突变基因和正常基因区分开来。具有简便快速的优点，适于大批量筛选，但检出率受DNA长度影响大。(3)DNA测序法是检测点突变的金标准，与上述方法相比，最大的优点就在于能够直接显示已知突变位点的位置和类型，此外还能发现新的突变位点。但是，这种方法操作步骤繁琐，试剂和仪器昂贵，影响结果的因素多，对操作人员水平和实验室条件要求高。
[0007]因此研制和开发一种特异性强、敏感性高且又快速、经济，能同时检验多个位点突变的CYP2C19基因检测方法显得尤为重要，对CYP2C19基因突变检测起着重要的作用。
【发明内容】
[0008]本发明目的主要是为了弥补现有CYP2C19基因检测在分型方面的不足，提供一种可以同时检测多种CYP2C19基因突变位点的检测试剂盒。
[0009]本发明的一种CYP2C19基因分型检测试剂盒，包括:
(I)一个基因芯片，其上带有:
(1)CYP2C19基因的4个突变位点及其正常对照互补的核苷酸序列探针(共8条探针)，其中探针为SEQ ID Nos:1-8或与SEQ ID Nos: 1_8互补的序列，具体序列如下:
名称序列号序列
Cl肿2NSEQ ID N0.1ATTTCCCGGGAACCCATAAC
C19*2MSEQ ID N0.2TTGTTATGGGTTCCCGG
Cl肿3NSEQ ID N0.3AAGCACCCCCTGGATCCA
C19*3MSEQ ID N0.4GCCTTACCTGGATTCAG
C19*17-3402N SEQ ID N0.5AAGGCGGTCTCTGGCGTCGCCC
C19*17-3402M SEQ ID N0.6AACAATACCAGAAATATCC
Cl肿17-806N SEQ ID N0.7GTTCTCAAAGCATCTCTG
C19*17-806M SEQ ID N0.8GTTCTCAAAGTATCTCTG
(ii)标记有生物素点的DNA序列(B1)，用于监控杂交是否成功，序列为SEQ IDN0.9:
B1 CGTCCAAGGGGAAACTGATCT SEQ ID N0.9 ；
(2)各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，其特异性扩增引物的DNA序列为SEQID Nos.10-17，具体序列如下:
名称序列号序列
C19*2-FSEQ ID N0.10AAAATTTCCCCATCAAGATATAC
C19*2-RSEQ ID N0.11CCCGAGGGTTGTTGATGT
C19*3-FSEQ ID N0.12AGCAATTTCTTAACTTGATGGA
C19*3-RSEQ ID N0.13CATGGCTGTCTAGGCAAGA
C19*17-3402-F SEQ ID N0.14ATGACAAGACACAGACTGGGA
C19*17-3402-R SEQ ID N0.15CTTGCCAGTGTTTGGTTCTAT
C19*17-806-F SEQ ID N0.16ATGAACAGGATGAATGTGGTAT
Cl肿17-806-R SEQ ID N0.17CTGGGATTTGAGCTGAGGT
本发明针对各种探针的长度一般在14-25个碱基左右，探针5'或3'端进行胺基化处理。本发明设计的探针有着合理的碱基成分、Tm值相近，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。
[0010]本发明上述的试剂盒，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。
[0011]本发明上述的试剂盒，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。
[0012]本发明上述的试剂盒，所述引物的5'端标记有生物素。
[0013]本发明所述基因芯片的制备方法，包括如下步骤:
(I )DNA探针的制备:合成与CYP2C19基因DNA互补的Y或:V末端经过胺基化的DNA
片段
从DNA中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计并合成5'或3'末端经过胺基化的DNA片段；
(2)固定探针:将上述探针固定在活化处理好的尼龙膜上
先对尼龙膜进行活化处理，然后将探针点到膜上，通过探针末端的氨基与活化膜上的羧基形成共价结合，牢固地将探针固定在膜上；
(3)制备基因芯片:利用氢氧化钠停止反应，制得基因芯片。
[0014]利用本发明所述的试剂盒检测CYP2C19基因分型的方法包括以下步骤:利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA ;对扩增后的DNA进行杂交；检测基因芯片表面上结合的DNA。
[0015]具体步骤如下:
第一步:扩增样品