用于检测cyp2c19基因分型的引物对、荧光探针、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明设及等位基因分型领域，特别设及一种用于检测CYP2C19基因 CYP2C19*2、 CYP2C19*3基因分型的引物对、巧光探针、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 随着医学科技的发展，新药层出不穷，然而用药问题也越来越多，临床上使用的许 多药物如抑制剂-奥美拉挫、抗抑郁药-氣西汀、抗癒痛药-苯妥英钢、抗肿瘤药-环憐酷胺 等，其用药及药物代谢存在个体化差异，例如同一种药同一剂量用在不同病人身上，疗效却 可能完全不同，有的痊愈，有的却可能发生严重的药物不良反应甚至致死，据世界卫生组织 统计，全世界每年因药物不良反应致死1900万人左右。
[0003] 研究表明药物代谢的个体化差异主要源于遗传因素。体内药物代谢主要通过细胞 色素 P450(切tochrome P450，CYP450)同功酶完成。CYP2C19(S-美芬妥英径化酶)是CYP450 的主要组成之一，代谢一系列临床上使用的药物如奥美拉挫、氯化格雷、氣西汀、依替挫仑、 苯己比妥、苯妥英钢、环憐酷胺等。
[0004] CYP2C19具有很多SNP位点，最常见的是CYP2C19*2(681G〉A)和CYP2C19*3(636G〉 A)，CYP2C19巧会导致转录蛋白的剪切突变失活，而CYP2C19*3能构成一个终止子，破坏转录 蛋白的活性。因而，CYP2C19等位基因突变可能导致S-美芬妥英径化酶的活性下降，代谢底 物的能力减弱，从而导致药物代谢的表型差异。有研究报告指出，CYP2C19对药物代谢的能 力随着等位基因的不同组合而呈现出规律性，CYP2C19*1/*1野生纯合子代表强代谢型 化M)，CYP2C19*l/*2或CYP2C19*l/*3突变杂合子代表中间代谢型（IM)，CYP2C19*2/*2或 CYP2C19*3/*3突变纯合子W及CYP2C19*2/*3突变杂合子代表弱代谢型(PM)。
[0005] 通过对CYP2C19基因型与奥美拉挫临床疗效的研究发现，奥美拉挫与阿莫西林等 抗生素联用治疗幽口螺旋杆菌感染性消化道溃瘍，PM和IM患者愈合率明显高于EM患者；而 对氯化格雷的研究显示，氯化格雷口服后必须在体内经CYP2C19代谢为有效产物才能发挥 抗血小板凝集作用，因此，IM患者需通过增加药量达到抗血小板凝集效果，而PM患者却需加 用或改用其它抗凝血药物。
[0006] 因此，研究CYP2C19基因分型对于预测药物给药条件、毒副作用的强弱和药物疗效 是极为重要的。通过CYP2C19基因分型检测，区分不同药物代谢能力的基因型个体，检测其 CYP2C19酶对相关药物代谢速率的快慢，可W指导临床合理选择药物类型、调整药物剂量， 并制定个体化用药方案。
[0007] 目前，对于CYP2C19基因分型的检测的方法有很多种，常规的方法包括：（1)直接测 序法，通过抽取人外周静脉血，提取基因组DNA，扩增后进行DNA直接测序，从而判断基因型； 该方法能够直接显示已知突变位点的位置和类型，然而，其操作步骤繁琐，试剂和仪器昂 贵，检测周期长且成本较高。（2)酶切序列分析，基于突变的发生而形成的限制性内切酶酶 切位点的消失或增加的原理进行分析;该方法虽然简便、经济，然而，难W实现高通量平行 分析，且无法分辨杂合子。（3)忍片法，应用已知的核巧酸序列作为探针与标记的祀核巧酸 序列进行杂交，通过对信号的检测进行定性与定量分析;该方法可进行高通量分析，然而， 其技术成本高、检测步骤复杂、且分析泛围较窄。上述方法难W满足临床检验对CYP2C19基 因分型检测的需求。
[0008] 针对上述问题，本发明设计了一种简单、快速、价格低廉、特异性高的CYP2C19检测 产品和方法，W用于临床检测。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的之一是提供一种新的、快速简便、特异性高的用于检测CYP2C19基因 分型的产品。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种操作简单、能够快速、准确检测CYP2C19基因分型 的方法。
[0011] 为了实现本发明的目的，本发明一方面提供了一种用于检测CYP2C19基因分型的 引物对，所述引物对包括用于扩增CYP2C19巧基因的特异性引物对和/或用于扩增CYP2C19* 3基因的特异性引物对；
[0012] 其中，所述用于扩增CYP2C19*2基因的特异性引物对包括一条正向引物CYP2C19* 2-F和一条反向引物CYP2C19*2-R，所述正向引物CYP2C19*2-F具有序列表中SEQ ID NO: 1所 示的核巧酸序列（SEQ ID N0:l:5'-TCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCA-3')，所述反向 引物CYP2C19*2-R具有序列表中的SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列（SEQ ID N0:2:5/-TCCAAAATATCACTTTCCATAAAAGCAAGG-3^)；
[0013] 所述用于扩增CYP2C19*3基因的特异性引物对包括一条正向引物CYP2C19*3-F和 一条反向引物CYP2C19*3-R，所述正向引物CYP2C19*3-F具有序列表中SEQ ID N0:3所示的 核巧酸序列（SEQ ID N0:3:5'-GAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCC-3')，所述反向引物 CYP2C19*3-R具有序列表中的SEQ ID N0:4所示的核巧酸序列（SEQ ID N0:4:5/-AGACTGTAAGTGGTTTCTCAGGAAGCAA-3')。
[0014] 本发明引物对也可为本发明上述核巧酸序列SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:4的互补 序列。
[0015] 本发明还提供了 一种用于检测CYP2C19基因分型的巧光探针，包括用于检测 CYP2C19*2基因的巧光探针CYP2C19*2-P和/或用于检测CYP2C19*3基因的巧光探针 CYP2C19*3-P；
[0016] 其中，所述巧光探针CYP2C19*2-P具有序列表中的SEQ ID N0:5所示的核巧酸序列 (SEQ ID NO:5:5' -TTCCCAGGAACCCATAACA-3');
[0017] 所述巧光探针CYP2C19*3-P具有序列表中的SEQ ID N0:6所示的核巧酸序列（SEQ ID NO:6:5^-ACCCCCTGAATCCAGGT-3')。
[001引本发明所述巧光探针也可为上述核巧酸序列SEQ ID N0:5至SEQ ID N0:6的互补 序列。
[0019] 所述巧光探针为在5/末端区域具有巧光基团，在y末端区域具有泽灭基团的双标 记探针。
[0020] 本发明所述巧光探针的巧光基团可选择通用的探针标记基团，泽灭基团可选择通 用的探针标记泽灭剂;优选的，所述5 '末端区域具有W下巧光基团之一:FAM、TET、VIC、肥X、 ROX、JOE、ALEX、CAL、Fluor、CY3或CY5等；所述3 '末端区域具有W下泽灭基团之一：BHQl、 B册 2、DABCTL或 TAMRA 等。
[0021] 优选的，当所述巧光探针同时包括用于检测CYP2C19*2基因的巧光探针CYP2C19* 2-P和用于检测CYP2C19*3基因的巧光探针CYP2C19*3-P时，5/末端区域具有不同的巧光基 团。
[0022] 本发明另一方面提供了一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒，所述试剂盒包 括本发明所述引物对W及巧光探针。
[0023] 进一步的，本发明所述试剂盒还包括PCR缓冲液。
[0024] 其中，在本发明【具体实施方式】中，本发明试剂盒中PCR缓冲液含有Mgh。
[0025] 优选的，本发明所述试剂盒还可包括阴性对照品和/或阳性对照品。
[0026] 在本发明【具体实施方式】中，所述阴性对照品为水。
[0027] 在本发明【具体实施方式】中，所述阳性对照品包括携带CYP2C19*2(681G〉A)纯合野 生型或纯合突变型基因片段的载体，和携带CYP2C19*3(636G〉A)纯合野生型或纯合突变型 基因片段的载体的两种或多种的混合物，可分别组合成如下6种基因型：
[0028] CYP2C19*l/*l、CYP2C19*l/*2、CYP2C19*2/*2、CYP2C19*l/*3、CYP2C19*3/*3和 CYP2C19巧/*3。