一种检测诊断遗传性心肌病致病基因的dna文库及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种通过祀向高通量半导体测序技术检测诊断遗传性屯、肌病致病基 因的DNA文库及其应用。具体说是根据遗传性屯、肌病致病基因，设计能覆盖上述基因外显子 及邮邻区域的超多重PCR引物，并对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通 量测序技术进行测序，寻找致病突变，明确遗传性屯、肌病的遗传学病因，为临床诊断提供遗 传学和分子生物学的理论依据，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。
【背景技术】
[0002] 遗传性屯、肌病是一组W屯、肌直接受累为主要特征的疾病，主要包括:肥厚型屯、肌 病、扩张型屯、肌病、致屯、律失常性右室屯、肌病、限制型屯、肌病和左室屯、肌致密化不全屯、肌病 五大类，其病程常伴随屯、力衰竭和屯、律失常。遗传性屯、肌病患者最终可能面临屯、脏移植、巧 死等重大风险，并且可能将疾病遗传给下一代，给家庭和社会带来巨大的精神压力和经济 负担。遗传性屯、肌病是遗传病，其发病是由于基因突变所导致，但是其设及致病基因数量 多，同一种疾病致病基因不同造成的预后差别悬殊，基因型与疾病表型之间异质性高，故早 期进行精确诊断，进而选择恰当治疗方案进行个性化治疗极为重要。
[0003] 目前，研究发现遗传性屯、肌病的众多致病基因中，只要任意一种基因发生功能性 突变，即可引起疾病表型，即：同一种遗传性屯、肌病可W由多种遗传因素所导致。并且，不同 基因的突变导致的同一种遗传性屯、肌病，其严重程度和预后有着较大差异。例如:MYBPC3基 因突变导致的仅W屯、肌轻度肥厚为特点的肥厚型屯、肌病患者预后较好，通常不会发生严重 屯、律失常或巧死的并发症，仅需药物治疗或随访观察即可;而PRKAG2基因突变导致的肥厚 型屯、肌病患者多伴发WPW综合征，有很高的巧死风险，应考虑行ICD植入术。除此之外，同一 患者如果携带了一个W上的致病基因突变，其临床表现和预后与只携带单一致病突变的患 者相比会有差异。因此，全面、快速、准确地筛查致病基因是遗传性屯、肌病精确诊断和个性 化治疗的必须前提条件。
[0004] 临床上现有的遗传性屯、肌病的常规诊断技术，主要包括影像学检查和实验室检查 两大类。影像学检查包括屯、脏彩超、屯、脏CT和屯、脏核磁共振。运些技术可W较为准确地判断 屯、室壁厚度，屯、腔大小和屯、肌运动情况等客观指标，粗略判断患者是否患有遗传性屯、肌病。 但是，影像学检查不能精确、特异地区别遗传性屯、肌病的具体种类，分子亚型，不能对患者 预后做确切判断，也不能在早期尚未表现出临床症状的情况下对患者进行诊断。实验室检 查主要包括传统生化指标的检测，如：屯、肌肌巧蛋白、屯、房钢尿肤等，仅能反映屯、脏损伤，不 能对遗传性屯、肌病的分类提供帮助。因此，目前仅结合临床症状、影像学及传统实验室检查 有时不能把遗传性屯、肌病很好区分。对于特殊类型的屯、肌病，如:糖原蓄积病或线粒体屯、肌 病可能需要进行屯、肌活检来进行确诊，患者所受痛苦较大。而使用基因诊断的方法来替代 穿刺活检进行鉴别诊断则可避免运种痛苦。同时，传统的基于Sanger测序的基因检测方法 存在通量低的弊端，一次反应只能检测一个扩增区域，无法满足庞大的基因检测区域和多 样本检测时效性的要求。
[000引因此，有必要寻求一种新的检测遗传性屯、肌病致病基因突变的方法，提高诊断准 确率，降低成本和劳动强度并提高时效性。
【发明内容】
[0006] 为实现上述目的，本发明提供一种覆盖肥厚型屯、肌病、扩张型屯、肌病、致屯、律失常 性右室屯、肌病、限制型屯、肌病和左室屯、肌致密化不全屯、肌病五大类遗传性屯、肌病，包含80 个遗传性屯、肌病致病相关基因的DNA文库。运80个基因选择基于基于国际已报道和公认的 临床致病基因数据库(0MIM数据库、HGMD数据库、C1 in化r数据库）W及发明者自己的课题研 究内容。运80个基因上的致病突变既可W单独致病，也可W联合致病导致更加严重和复杂 的临床表型，本发明首次做到可W-次性全面的对它们进行测序，是目前已知针对屯、肌病 致病基因覆盖最全面的一种祀向测序检测。其中80个基因如下：
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[0011] 本发明根据80个遗传性屯、肌病致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及邮邻调控 区域的适用于超多重PCR的引物池，进而对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利 用高通量半导体测序技术进行测序，寻找致病突变，明确屯、肌病的遗传学病因，为临床诊断 提供遗传学和分子生物学的理论依据。为此，本发明还提供W下技术方案：
[0012] 本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊 断遗传性屯、肌病。
[0013] 本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断装置中的应用，所述诊断装置用于诊 断遗传性屯、肌病。优选的，所述诊断装置是测序忍片。
[0014] 进一步，所述应用包括下列步骤：
[001引（1)提供受试者样本的基因组DNA;
[0016] (2)利用上述的DNA文库从Ion Torrent?高通量测序平台自动合成覆盖全部80个 致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
[0017] (3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
[001引（4)对步骤(3)得到的酶切产物加 Barcode接头;优选的，所述Barcode接头来自于 高通量测序建库试剂盒；
[0019 ] (5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
[0020] (6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增;优选的，该通用引物来 自于高通量测序建库试剂盒；
[0021] (7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区 域扩增文库；
[0022] (8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接 于ISP珠子，得到反应液；
[0023] (9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入忍片，上Ion Torrent?高通量测 序进行测序；
[0024] (10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关 的突变位点；
[002引（11)对步骤（10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
[0026] 优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。
[0027] 更优选的，所述应用进一步用于指导治疗，例如:通过发明者多年临床观察研究， 积累大数据得到的经验W及文献报道，总结出根据不同致病基因判断不同临床预后与选择 不同治疗方法。例如:通过基因检测鉴别类似临床表型的的肥厚型屯、肌病患者，恶性预后的 患者，（如:PRKAG2基因突变患者），随时有巧死风险，应积极考虑ICD植入术等治疗;而良性 预后患者，（如:MYBPC3基因突变患者），通常巧死风险较小，进展缓慢，可考虑单纯药物治 疗。
[0028] 本发明还提供一种诊断试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述包含80个遗传性屯、肌 病的致病基因的DNA文库。
[0029] 本发明还提供一种诊断装置，其中，所述装置包括上述包含80个遗传性屯、肌病的 致病基因的DNA文库。优选的，所述装置为测序忍片。
[0030] 本发明提供一种使用上述DNA文库、诊断试剂盒或诊断装置对患者进行诊断的方 法，所述方法包括下列步骤：
[0031] (1)提供受试者样本的基因组DNA;
[00创 （2)利用上述的DNA文库从Ion Torrent?高通量测序平台自动合成覆盖全部60个 致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
[0033] (3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
[0034] (4)对步骤(3)得到的酶切产物加 Barcode接头;优选的，所述Barcode接头来自于 高通量测序建库试剂盒；
[0035] (5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
[0036] (6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增，优选