b.油包水PCR反应完成后，连接有测序模板的Ion PGM Template 0T2 200Ion Sphere Particles经过Ion Onetouch ES纯化，加入测序引物及DM聚合酶：
[0092]
[0093] 室溫5min后，将得到的包含ISP珠子的反应液点入忍片，上Ion TorrentTM高通量 测序进行测序。
[0094] (4)数据分析：测序数据经过coverage analysis和variant caller分析，得到碱 基序列和突变位点，突变位点经过Ion Repoder在线注释后，得到对遗传性屯、肌病诊断有 意义的突变位点。
[0095] (5) Sange法验证:对于得到的突变位点，采用Sanger测序法进行验证。
[0096] 结果说明及分析
[0097] 通过本发明中设及的高通量测序技术一次性对6个标本的目标区域进行检测（如 图1)，得到的总数据量为861M(Total Base),能够总共得到6250299的片段读长数据(Total Reads),每个片段的中位读长为14%9。6个标本平均能够被测到1034072(952609-1129226) 个片段读长Reads(如图2)，W上测序结果为下一步的序列分析提供了充足的数据量。测序 结果经过variant化ller分析，每个标本平均有119个变异(Variants)被读出（如图3)。检 测区域的变异通过Ion R邱OTter在线注释后，与疾病相关的突变位点经过Sanger测序法验 证(如图4)，如图4所例举的那样，图4箭头所指处显示PRKAG2基因 c.905G〉A(p.Arg302Gln) 杂合突变，最终明确患者的遗传缺陷类型，为临床提供诊断依据。提示患者属于肥厚型屯、肌 病中的恶性预后者，有很高的巧死风险，除了常规的肥厚型屯、肌病人的药物治疗外，还应积 极考虑进行手术植入ICDW防止巧死的发生。同时该基因遗传模式是常染色体显性遗传，患 者的同胞兄弟姐妹及其子女有50%的概率与患者一样携带了该致病突变，也面临巧死风 险，应进行该致病位点的筛查，W决定后续治疗方案。
[0098] 本发明的临床应用例证
[0099] 利用本发明所提供的方法，对200名患有遗传性屯、肌病但病因不明确的患者进行 了基因检测。共诊断出肥厚型屯、肌病75例，扩张型屯、肌病68例，致屯、律失常性右室屯、肌病20 例，限制性屯、肌病8例，左室致密化不全屯、肌病11例。该方法对遗传性屯、肌病检出的总阳性 率达到91%，结合临床影像学检查，屯、电图，实验室检查及医生最终诊断结果，本方法的假 阳性率为0,即所有经本方法确认的携带致病突变患者均符合相关遗传疾病的临床特征，并 能够给予明确的临床诊断。本发明设及的检测方法是利用高通量测序技术为突变快速筛选 工具，WSanger测序法为最终确定突变的金标准，因此具有快速，准确的特征。W高通量测 序平均深度100 X为例，所覆盖的95.51 %的目标区域都能够被测序，且筛选得到的点突变 能够被Sanger测序法验证，因此对W上区域检测的准确度为100%。根据200名受测患者的 临床诊疗结果分析，受测患者未出现假阴性率。基于本发明设及的检测方法给出的诊断报 告得到临床医生的认可和采纳。本发明设及的检测方法具有准确，快速，低成本的特点，对 遗传性屯、肌病的鉴别诊断有着重要意义和实用价值。
[0100] 实施例2:
[0101] 本发明中引物池里包含发明者新发现的屯、肌病致病基因8个，如下表：
[0102]
[0103] ~新发现的8个屯、肌病致病基因来自于发明者多年来的研究积累和家系调查。发明胃 者首先在已知的屯、肌病致病基因中通过KEGG信号通路检索，同源基因库，寻找已知致病基 因的同源基因及相同致病通路上的关键基因。然后在多年积累的中国汉族病人大样本量病 例样本库中对候选的致病基因进行祀向高通量测序，并进行生物信息学分析，筛选和寻找 致病突变。对筛选到致病突变的病例进行随访和进一步的家系分析，对患者的整个家族进 行致病位点测序验证，计算致病突变的共分离系数。当发现候选基因的致病突变在两个及 W上无关联的家系中完全共分离时，即可初步判断该候选致病基因为新的致病基因。本发 明发现，上述8个基因的致病突变在两个及W上无关联的家系中均出现完全共分离。
[0104] 对一系列的筛选到的新致病基因及其致病突变进行功能学实验，对相关致病通路 进行功能学检测，对部分重要受累基因进行大鼠基因敲除建模，观察疾病在动物模型中的 再现情况，从而进一步对候选基因的致病性进行评估。本发明发现，患者的白细胞W及转染 上述突变基因的H9C2屯、肌细胞系或NIH3T3成纤维细胞系细胞中上述8个基因的表达和功能 均降低。最终，筛选出了运8个新的国际上尚未报道的致病基因，并在汉族大样本病例中对 其致病性进行了初步评估。同时，建立了 600名汉族正常对照人群的所有致病基因的非致病 多态性位点库，弥补了国际上通用数据库中汉族人样本少，非致病多态性位点严重不全的 漏桐，对未来的基因检测和数据分析提供了坚实基础。
【主权项】
1. 一种基于Ion Torrent?高通量测序技术诊断遗传性心肌病的DNA文库，其特征在于， 该文库包括80个遗传性心肌病相关的致病基因。2. 权利要求1所述的DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒用 于诊断遗传性心肌病。3. 权利要求1所述的DNA文库在制备诊断装置中的应用，其特征在于，所述诊断装置用 于诊断遗传性心肌病。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断装置是测序芯片。5. 如权利要求2-4任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述应用包括下列步骤： (1) 提供受试者样本的基因组DNA; (2) 利用权利要求1所述的DNA文库从Ion Torrent?高通量测序平台自动合成覆盖全部 80个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增； (3) 对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切； (4) 对步骤(3)得到的酶切产物加 Barcode接头； (5) 对步骤(4)得到的连接产物进行纯化； (6) 对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增； (7) 对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩 增文库； (8) 对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP 珠子，得到反应液； (9) 将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion Torrent?高通量测序进 行测序； (10) 将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突 变位点； (11) 对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器 官样本。7. 如权利要求2-6任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述应用进一步用于指导治 疗。8. -种诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的DNA文库。9. 一种诊断装置，其特征在于，所述装置包括权利要求1所述的DNA文库。10. 如权利要求9的诊断装置，其特征在于，所述诊断装置是测序芯片。
【专利摘要】本发明公开一种通过靶向高通量半导体测序技术检测遗传性心肌病致病基因突变的DNA文库及其应用。具体来说，根据80个遗传性心肌病致病基因，设计引物池，对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量半导体测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的80个基因检测区域能够检测肥厚型心肌病、扩张型心肌病、致心律失常性右室心肌病、限制型心肌病、左室心肌致密化不全心肌病五大类常见的遗传性心肌病，对遗传性心肌病的诊断和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105506115
【申请号】CN201610004044
【发明人】汪道文, 李宗哲
【申请人】华中科技大学同济医学院附属同济医院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月5日