一种单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐测序的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种单细胞简化代表性重亚硫酸氨盐测序文库的构建方法、建库试剂 盒、检测方法和检测试剂盒，属于基因测序领域。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化是最早发现的基因表观遗传学修饰方式之一，真核生物中的甲基化主 要发生于胞喀晚，即在DNA甲基化转移酶(面MTs)的作用下使CpG二核巧酸5'-端的胞喀晚 (C)转变为5'-甲基胞喀晚(5mC)。甲基化的主要功能是调控基因表达。在哺乳动物体内，DNA 甲基化在分化细胞中相对稳定;相比之下，在早期胚胎发育和原始生殖细胞发育过程中会 发生基因组范围的去甲基化和DNA甲基化谱式重新建立(Reme thy lat i on)的过程。
[0003] 全基因组亚硫酸盐测序可W全面地分析DNA甲基化情况，但由于它是对整个基因 组进行深度测序，需要较大的测序数据量。而简化代表性重亚硫酸氨盐测序(RRBS)技术提 供了一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法。运种方法首先采用特异性限制性核酸内 切酶(通常是MspI酶)来消化基因组DNA，然后通过片段选择进行启动子及CpG岛区域的特异 性富集，随后进行重亚硫酸氨盐处理并测序。RRBS通过测较少的数据量，就可W有效的覆盖 基因组大部分CpG位点，包括>70%的启动子，>80%的CpG岛和增强子、外显子、3/UTRs和重 复元件等。
[0004] 传统的RRBS技术包括如下步骤：（1)使用MspI酶对基因组DNA进行酶切；（2)对酶切 产物进行过膜纯化；（3)对纯化产物依次进行末端补平、加 A和甲基化接头反应；（4)对加接 头产物进行片段筛选；（5)对筛选后的产物进行重亚硫酸氨盐处理，使未甲基化的C转变为 U; (6)PCR反应，扩增得到测序文库。
[0005] 传统的RRBS方法对基因组DNA起始量的要求较高，约3~扣g，不适合微量样本或者 单细胞样本。单细胞本身所含有的基因组比传统样本低好多个数量级，任何降解、样品损失 或者污染都会对测序质量带来非常严重的影响，导致传统的RRBS方法无法应用于单细胞或 微量样本，比如对于临床上比较珍贵又稀少的样本或者单个细胞样本。
[0006] 为了实现对单细胞的甲基化测序，Sebastien等提出了单细胞全基因组重亚硫酸 盐测序技术，流程包括：（1)采集单细胞；（2)将采集的单细胞进行裂解，得到裂解后的单细 胞样本；（3)将所述裂解后的单细胞样本进行重亚硫酸氨盐处理，得到单链重亚硫酸氨盐处 理产物；（4) W上述单链的重亚硫酸氨盐处理产物为模板，使用含生物素标记的oligol引物 合成第一条链；（5)使用链亲和素磁珠调取生物素标记的第一条链；（6) W上述生物素标记 的第一条链为模板，使用〇lig〇2引物合成第二条链；W及(7) W所述第二条链作为模板进行 PCR扩增，从而构建二代测序用DNA文库。但是，该方法得到的实验分析结果对CpG岛的覆盖 率偏低。
[0007] 参考文献
[0008] Sebastien Smallwood,Heather J Lee,et al.2014. Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity.Nature methods,8, 11(8):817-820
【发明内容】
[0009]为了克服现有技术的不足，本发明改进了传统的RRBS技术，将PCR前的RRBS文库构 建步骤整合到单个反应管中完成，获得了合格的测序用RRBS文库，来绘制单碱基分辨率的 小鼠或人类CpG位点的甲基化图谱，能够更好的从单细胞水平上研究细胞之间的异质性。 [00 1日]本发明包括：
[0011] 1. -种单细胞简化代表性重亚硫酸氨盐测序文库的构建方法，包括如下步骤：
[001 ^ A.将单个细胞进行裂解，得到单细胞基因组DNA;
[0013] B.将所述单细胞基因组DNA进行MspI酶切，得到酶切产物；
[0014] C.将所述酶切产物进行末端修复和3 '端加 A，得到3 '端加 A产物；
[0015] D.将所述3 '端加 A产物进行甲基化接头连接，得到加甲基化接头产物；
[0016] E.将所述加甲基化接头产物进行重亚硫酸氨盐处理，得到转化产物；
[0017] F.将所述转化产物进行PCR扩增，得到测序文库，
[001引 其中，
[0019] 所述步骤A~E在单个反应管中完成。
[0020] 2.根据项1所述的方法，在步骤E后包括步骤E1:在所述转化产物中加入tRNA进行 纯化。
[0021] 3.根据项1或2任一项所述的方法，所述单细胞来源于哺乳动物。
[0022] 4.根据项3所述的方法，所述哺乳动物为人和/或小鼠。
[0023] 5.根据项1~4任一项所述的方法，所述步骤A采用的裂解体系包括:裂解缓冲液和 蛋白酶。
[0024] 6.根据项1~4任一项所述的方法，所述步骤B采用的酶为MspI限制性内切酶。
[0025] 7.根据项1~4任一项所述的方法，所述步骤D采用的甲基化接头连接体系包括： T4DNA连接酶、甲基化接头、连接酶缓冲液。
[0026] 8.-种单细胞简化代表性重亚硫酸氨盐测序用文库的构建试剂盒，包括选自下述 试剂中的至少一种或全部：
[0027] 用于对单细胞进行裂解的试剂，用于对单细胞基因组DNA进行MspI酶切处理的试 剂，用于所述3'端加 A的试剂，用于将所述3'端加 A的DNA片段加甲基化接头的试剂，用于对 所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氨盐处理的试剂，用于对重亚硫酸氨盐处理产 物进行PCR扩增的试剂。
[00%] 9.-种单细胞简化代表性重亚硫酸氨盐测序方法，包括如下步骤：
[0029 ] A.将单个细胞进行裂解，得到基因组DNA;
[0030] B.将所述基因组DNA进行MspI酶切，得到酶切产物；
[0031 ] C.将所述酶切产物进行末端修复和3 '端加 A，得到3 '端加 A产物；
[0032] D.将所述3 '端加 A产物进行甲基化接头连接，得到加甲基化接头产物；
[0033] E.将所述加甲基化接头产物进行重亚硫酸氨盐处理，得到转化产物；
[0034] F.将所述转化产物进行PCR扩增，得到测序用文库；
[0035] G.对所述测序用文库进行二代测序，基于测序结果，对所述单细胞的甲基化情况 进行分析。
[0036] 10. -种单细胞简化代表性重亚硫酸氨盐的测序试剂盒，包括选自下述试剂中的 至少一种或全部：
[0037] 用于对单细胞进行裂解的试剂，用于对单细胞基因组DNA进行MspI酶切处理的试 剂，用于所述3'端加 A的试剂，用于将所述3'端加 A的DNA片段加甲基化接头的试剂，用于对 所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氨盐处理的试剂，用于对重亚硫酸氨盐处理产 物进行PCR扩增的试剂。
[0038] 与现有技术相比，本发明的有益效果是:适用于起始量低样本的建库，特别是单细 胞样本，能够W单碱基分辨率绘制小鼠或人类细胞内约100万CpG位点的甲基化图谱。相较 于单细胞重亚硫酸氨盐测序(scBS)技术，scRRBS能够更好地覆盖CpG岛。
【附图说明】
[0039] 图1是用安捷伦2100生物分析仪对单个卵母细胞的scRRBS文库进行文库质控的结 果；
[0040] 图2是用安捷伦2100生物分析仪对阴性对照样本的scRRBS文库进行文库质控的结 果。
【具体实施方式】
[0041] 在一个方面，本发明提供了一种构建测序用单细胞简化代表性重亚硫酸氨盐文库 的方法，包括如下步骤：
[0042] A.将单个细胞进行裂解，得到单细胞基因组DNA;
[0043] B.将所述单细胞基因组DNA进行MspI酶切，得到酶切产物；
[0044] C.将所述酶切产物进行末端修复和3 '端加 A，得到3 '端加 A产物；
[0045] D.将所述3 '端加 A产物进行甲基化接头连接，得到加甲基化接头产物；
[0046] E.将所述加甲基化接头产物进行重亚硫酸氨盐处理，得到转化产物；
[0047] F.将所述转化产物进行PCR扩增，得到测序用文库，
[0048] 其中，所述步骤A~E在单个反应管中完成。
[0049] 本发明创造性地将构建单细胞简化代表性重亚硫酸氨盐文库的程序在一个反应 管中完成，极大地降低了分步纯化和片段筛选导致的降解和污染等对样品造成的损失。
[0050] 对于所述步骤E中采用的重亚硫酸氨盐处理的体系及反应条件没有特殊限制，本 领域技术人员可W适宜选择能够在重亚硫酸氨盐处理过程中使用的那些成份体系及反应 条件。
[0051] 作为优选，本发明在步骤E后进行步骤E1:将所述转化产物中加入tRNA进行纯化。 在纯化步骤中加入tRNA，极大地提高了纯化效率，使得纯化步骤得W在一步完成，降低了现 有技术中采用分步纯化对单细胞样本造成的损失。
[0052] 作为优选，本发明所述单细胞来源于哺乳动物、植物和/微生物中的至少一种。更 优选地，所述哺乳动物为人和/或小鼠。
[0053] 作为优选，所述步骤A采用的裂解体系包括:裂解缓冲液和蛋白酶。
[0054] 作为优选，所述步骤B采用的酶为MspI限制性内切酶。
[005引作为优选，所述步骤D采用的甲基化接头连接体系包括：T4DNA连接酶、甲基化接 头、连接酶缓冲液。
[0056] 在另一个方面，本发明提供了一种构建测序用单细胞简化代表性重亚硫酸氨盐文 库的试剂盒，包括选自下述试剂中的至少一种或全部：
[0057] 用于对单细胞进行裂解的试剂，用于对单细胞基因组DNA进行MspI酶切处理的试 剂，用于所述3'端加 A的试剂，用于将所述3'端加 A的DNA片段加甲基化接头的试剂，用于对 所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氨盐处理的试剂，用于对重亚硫酸氨盐处理产 物进行PCR扩增的试剂。
[0058] 用于对单细胞进行裂解的试剂，例如蛋白酶及相应的反应缓冲液等；
[0059] 用于对所述基因组DNA进行Msp I限制性内切酶处理的试剂，例如Msp I酶及相应的 酶切反应缓冲液等；
[0060] 用于所述3'端加 A的试剂，例如缺失外切酶活性的Klenow片段及相应的反应缓冲 液等，可W与所述的用于对所述酶切产物进行末端修复的试剂相同；
[0061] 用于将所述3'端加 A的DNA片段加甲基化接头的试剂，例如甲基化接头、T4DNA连接 酶及相应的连接反应缓冲液；
[0062] 用于对所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氨盐(Bisulfite)处理的试剂， 例如EZ Methylation(Zymo公司产品）等；
[0063] 用于对重亚硫酸氨盐处理产物进行PCR扩增的试剂，例如ΚΑΡΑ HiFi HotStart 化acil+Ready Mix、Index引物等；
[0064] 通过对所得测序用DNA文库进行二代测序，并基于测序结果进行分析，可W获得所 述基因组DNA的甲基化的信息。
[0065] 本发明还提供了一种单细胞的简化代表性重亚硫酸氨盐测序方法，其在包括上述 本发明的建库方法的各步骤的基础上，还包括步骤G:对所述测序用文库进行