一种多种淋巴细胞亚群的扩增方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学工程技术领域，具体地说涉及一种高效同时扩增多种淋巴细 胞亚群的方法及制备得到的细胞扩增试剂盒。
【背景技术】
[0002] 过继性免疫治疗是一种近期在治疗实体瘤和血液癌症临床试验中取得良好效果 的治疗方法，并且成为了发展迅速的医学研究领域。过继性免疫治疗的方法包括分离免疫 细胞，离体细胞扩增，及扩增后的免疫细胞回输入癌症患者。过继性免疫疗法成功根除癌症 的例子包括应用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞受体(TCR)修饰的T细胞和嵌合抗原受体 (CAR)修饰的Τ细胞。这些免疫细胞主要为αβΤ细胞。表达α和β链组成Τ细胞受体。除了αβΤ细 胞外，许多其他类型的免疫细胞，例如细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞、CD3CD56双阳性ΝΚΤ细 胞、CD3阴性CD56阳性的ΝΚ细胞和γ δΤ淋巴细胞，也可用于癌症的过继免疫治疗。
[0003] 上述细胞中，CIK细胞是一种体外用IFN γ、IL-2和抗⑶3抗体刺激3至4周生成的淋 巴细胞，是一种新型的免疫活性细胞。首先加入IFNy是CIK细胞扩增的关键一步，IFNy可 活化存在于PBMC中的单核细胞，提供接触依赖性因子⑶58/LFA-3和IL-12，这些因子有利于 获得的最终生成的淋巴细胞的Thl细胞表型和CIK细胞的细胞毒力。IFN-γ可直接抑制Th2 细胞的增殖，从而抑制CD4+细胞的生成，有利于CD8+和TH1细胞的生成。抗CD3抗体，如0KT3， 提供一个初始的有丝分裂信号，然后由IL-2作为一种强有力的T细胞有丝分裂原持续刺激T 细胞增殖和生长，在3至4周的刺激后，免疫细胞总数可扩增数百倍，甚至上千倍。
[0004] 扩增后产生的CIK细胞含有多种淋巴细胞亚群。大部分为⑶3+⑶4+T淋巴细胞和 ⑶3+⑶8+T淋巴细胞。虽然⑶3+⑶56+NKT淋巴细胞和⑶3-/⑶56+NK细胞只占一小部分，这些 免疫细胞，特别是NKT细胞，具有直接的肿瘤细胞杀伤作用。这些细胞表达天然杀伤细胞受 体NKG2D(CD314)，可以非MHC限制性的方式溶解肿瘤细胞，用CIK细胞进行临床实体瘤过继 免疫治疗呈现了很高的安全性。
[0005] 绝大多数T淋巴细胞属于αβΤ细胞，它们的T细胞受体由α和β链组成，一小部分T淋 巴细胞表达Τ细胞受体gamma和delta异二聚体（γ δ)链。αβΤ细胞的激活需要通过抗原加工 和抗原提呈细胞呈现的MHC限制肽。与αβΤ细胞不同，γ δΤ细胞通过γ δΤΟ?直接识别肿瘤抗 原，对微生物病原体和肿瘤具有强大的非MHC-限制性溶解活性，所以γ δΤ细胞在肿瘤和感 染的免疫监视方面起到重要作用。在人体血液中，γ ST细胞占 Τ淋巴细胞总数的2-10%，为 了有足够量的γ st细胞进行过继细胞免疫治疗，病人往往需要经过大容量白细胞单采术来 收集大量外周血单核细胞，单采术技术可收集1 X 1〇~9个外周血单核细胞，生产几十亿的γ ST细胞用于多次注射，ΙΡΡ(异戊烯焦磷酸)是人类γ δΤ细胞的天然抗原，已用于γ δΤ细胞的 扩增，异戊烯焦磷酸的合成类似物溴醇焦磷酸(BrHPP)及双膦酸盐唑来膦酸(Zometa)也可 以选择性地激活扩增γ δΤ细胞。
[0006] 现有技术中，临床试验广泛采用单独使用某一种免疫细胞成分进行癌症治疗，多 种免疫细胞亚群同时应用一起攻击一个肿瘤中的不同的目标的方式在临床上还没有得到 很好地探索。理论上，同时使用多种免疫细胞亚群的方法能通过攻击多个不同的肿瘤目标 扩大免疫反应的范围，可能会提供癌症治疗的协同作用。在这个方面，广泛研究已证实γδτ 细胞对多种免疫反应的独特和重要的贡献。γ st细胞和其他免疫细胞之间的相互作用已经 被证实在这些免疫反应中发挥核心作用。
[0007] 在临床应用上，肿瘤过继性细胞免疫治疗可能需要高达10~11免疫细胞，所以开发 有效的大规模的免疫细胞扩增的方法是过继性免疫治疗成功的一个关键。一种称作"快速 扩增程序(REP)〃的方法已用于αβτ细胞的体外大量扩增。快速扩增程序是一种非特异性(抗 原非依赖性）的免疫细胞扩增方案，该方案采用过量的致死剂量伽玛辐照异体外周血单个 核细胞（PBMC)作为饲养层细胞，同时使用抗CD3抗体（0ΚΤ3)和外源重组人白细胞介素 (rhIL)-2。这种快速扩增程序可以致使Τ淋巴细胞在14天内扩增1000倍。
[0008] 虽然上述快速扩增程序是一种常用的方法，但它的应用受到材料和技术上的限 制。在临床应用快速扩增程序时，一个T细胞中通常会用200个外周血单核细胞来刺激。所以 快速扩增程序需要用血细胞分离机大容量白细胞单采术从多个健康的捐助者收集大量异 体外周血单核细胞。快速扩增方案中所收集的外周血单核细胞来自异体，需要经过大量的 实验室检测，以确认处于无菌状态，这可能既昂贵又费时。并且，由于外周血单核细胞来自 于多个捐助者，收集而来的外周血单个核细胞对T细胞扩增的维持作用在捐助者个体间可 能会表现出很大的差异性，所有这些问题都会对大型多中心随机临床试验有所妨碍。
【发明内容】
[0009] 为此，本发明所要解决的技术问题在于现有，现有扩增免疫细胞的方法昂贵费时、 且外周血单核细胞来自于多个捐助者，对T细胞的维持作用差异性较大，从而提出一种体外 刺激外周血高效同时扩增多种淋巴细胞亚群的方法及制备得到的细胞扩增试剂盒。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
[0011] 本发明提供一种多种淋巴细胞亚群的扩增方法，其包括如下步骤：
[0012] S1、在肿瘤病人血液中收集的PBMC的培养基中加入IFNy和唑来膦酸，培养后再加 入0KT3抗体和重组人白细胞介素-2，刺激所述PBMC，完成淋巴免疫细胞初步扩增;所述肿瘤 包括血液系统肿瘤和实体瘤细胞。S2、初步扩增完成后，淋巴免疫细胞与饲养层细胞混合， 并加入唑来膦酸、0KT3抗体和重组人白细胞介素-2后继续扩增。
[0013] 作为优选，所述饲养层细胞为正常人PBMC、人类红白血病细胞株K562或人成纤维 细胞中的一种，所述饲养层细胞与淋巴免疫细胞的混合比例为1:1-300:1。
[0014] 作为优选，所述饲养层细胞与淋巴免疫细胞的混合比例为50:1-200:1。
[0015] 作为优选，所述步骤S1中所述培养基中同时加入IL-15和IL-18。
[0016]作为优选，所述正常人PBMC、所述人类红白血病细胞株K562和所述人成纤维细胞 在使用前经100G的γ辐照或使用丝裂霉素 C处理。
[0017] 作为优选，所述人类红白血病细胞株Κ562细胞为经过基因工程改造过的人类红白 血病细胞株Κ562细胞，所述基因工程改造过的人类红白血病细胞株Κ562细胞为经过遗传修 饰的Κ562细胞，其可稳定表达⑶64高亲和力Fc受体基因，共刺激分子⑶86和分子⑶137L基 因。
[0018]作为优选，所述正常人PBMC是从身体健康，无肿瘤病史的捐献者的血液中收集的； 所述人成纤维细胞为人诱导多能干细胞分化成的人成纤维样细胞。
[0019] 作为优选，所述步骤S1中，所述IFNy浓度为500-1500IU/ml，所述唑来膦酸浓度为 2-10μΜ，所述0KT3抗体浓度为20-100ng/ml，所述重组人白细胞介素-2的浓度为100-600IU/ mL〇
[0020] 作为优选，所述IL-15的浓度为10ng/ml，所述IL-18的浓度为10ng/ml。
[0021] 本发明还提供了所述的多种淋巴细胞亚群的扩增方法在癌症的过继性免疫治疗 中的应用。
[0022] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0023] (1)本法明提供的多种淋巴细胞亚群的扩增方法，初步扩增完成后，免疫细胞总数 在这段时间可扩增约10到40倍，其中γ δτ细胞扩增可达600倍，⑶3⑶56双阳性NKT细胞扩增 约200倍，通常50%扩增后的细胞为γδΤ细胞，