一种nk细胞体外扩增组合物及nk细胞扩增方法
【专利摘要】一种NK细胞体外扩增组合物及NK细胞扩增方法，涉及一种NK细胞扩增组合物及扩增方法。本发明是要解决目前NK细胞扩增倍数低、纯度低、扩增周期长、成本高的问题。该组合物包括NK扩增滋养细胞、IL?2、灭活的自体血浆和GT?T551 H3培养基。扩增方法：用GT?T551 H3培养基将PBMCs重悬后，接入培养瓶，加入IL?2、NK扩增滋养细胞及自体血浆，体外共培养15天，其中培养第7天时补加一次NK扩增滋养细胞，培养过程中补充培养基，培养13和15天收集细胞进行检测。该组合物可显著促进NK细胞的大量扩增，满足临床应用需求，获得的NK细胞纯度较高，节省了成本，提高杀伤活性。本发明用于扩增NK细胞。
【专利说明】
一种NK细胞体外扩増组合物及NK细胞扩増方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种NK细胞扩增组合物及扩增方法。
【背景技术】
[0002] 最新版的《世界癌症报告》对全球180多个国家的28种癌症的总体情况和流行趋势 进行了全面的描述和分析，报告预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，2012年全世界共 新增1400万癌症病例并有820万人死亡。其中，中国新增307万癌症患者并造成约220万人死 亡，分别占全球总量的21.9%和26.8%。其中，肺癌、胃癌、肝癌为发病率最尚的癌症，而乳 腺癌、结直肠癌、宫颈癌使女性健康受到威胁。
[0003] 肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗法，其中自体免疫细胞(T细 胞、NK细胞)治疗技术属国家卫生部首批允许临床应用的第三类医疗技术。近年来，自然杀 伤细胞(natural killer cell，NK)免疫治疗技术在世界范围内正在成为一种可靠的抗癌 疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗且副作用小，不损伤正常组织。NK于20世纪70年代进 入人们的视线，至今已有近40年的发展历史。NK细胞被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，是由 淋巴祖细胞分化而来，并与B淋巴细胞和T淋巴细胞构成了三大类免疫细胞，仅占外周血淋 巴细胞的5-10%。服细胞无需预先接触抗原即可杀伤靶细胞(如病毒感染的宿主细胞和肿 瘤细胞），由于NK细胞的杀伤活性无 MHC限制，因此称为自然杀伤活性，其在免疫监视和早期 抗感染免疫过程中起重要作用。NK细胞的肿瘤杀伤机制包括：（l)FasL与Fas相作用，最终启 动了靶细胞凋亡系统。（2)穿孔素/颗粒酶作用，激发凋亡相关酶系统致细胞发生凋亡。（3) NK细胞表面表达的CD16分子与肿瘤特异性IgG抗体发生结合，从而识别、杀伤与IgG抗体发 生特异性结合的肿瘤细胞。（4)TNF_a、IFN- γ等与靶细胞表面相应受体的结合，启动靶细胞 的凋亡系统。ΝΚ细胞除对靶细胞具有溶解杀伤作用外，ΝΚ细胞还在机体免疫反应中具有重 要功能。ΝΚ细胞可通过对ΜΦ、粒细胞、树突状细胞的调节作用而控制天然免疫力。ΝΚ细胞可 以作用于CD4+T细胞和CD8+T细胞以强化获得性免疫。
[0004] 目前，体外获取人ΝΚ细胞主要通过以下途径进行:一、采用免疫磁珠的方法从PBMC 中分离；二、采用刺激扩增培养的方法从PBMC中扩增ΝΚ细胞。前者可以快速获得ΝΚ细胞，但 只能获得少量ΝΚ细胞共研究用。后者则是以PBMC为原始材料，通过特定细胞因子的刺激，使 ΝΚ细胞在体外得到特异的扩增，通过体外的刺激培养可进行相对大规模的ΝΚ细胞制备，从 而更好地应用于临床。但是现有的体外方法只能使ΝΚ细胞在体外扩增数十到百倍，且CD3-⑶56+细胞比例较低。IL-2、IL-15、IL-18和IL-21等细胞因子对ΝΚ细胞的生长与扩增是非常 重要的，同时，4-1BBL与NK细胞表面受体结合后可介导的共刺激信号促进NK细胞增殖、细胞 因子的分泌等。研究证实IL-2等细胞因子是NK细胞扩增的必要条件，但是仅有细胞因子并 不能保证NK细胞持续和高效的扩增，大规模NK细胞的扩增还需要有更多信号系统的支持。 K562细胞系是从慢性髓细胞性白血病患者体内提取建立的细胞系，能激活NK细胞的扩增。
[0005] 目前，NK扩增的主要方法为单纯细胞因子刺激扩增法，其扩增效率及纯度较低，同 时存在重复性差的缺点。近年来，出现一些用表达了 IL-15和4-1BBL的滋养细胞刺激NK细胞 扩增方法，该方法扩增3周后细胞数可达277倍，纯度超过90 %，杀伤活性可达80 % (E: T = 10:1)。但该扩增方法培养的NK细胞数量需较长时间才能达到临床治疗所需数量，同时对应 的成本也相对较高。综上，现有NK细胞体外培养方法急需改进，同时也更有必要设计与之相 符的规范的试剂组合来保证培养方法的及时、准确、顺利进行。
【发明内容】
[0006] 本发明是要解决目前NK细胞扩增倍数低、纯度低、扩增周期长、成本高的问题，提 供一种NK细胞体外扩增组合物及NK细胞扩增方法。
[0007] 本发明NK细胞体外扩增组合物包括NK扩增滋养细胞、IL-2、灭活的自体血浆和GT-T551 H3培养基。其中每毫升GT-T551 H3培养基中加入0.65X 106个~1X106个NK扩增滋养 细胞，每毫升GT-T551 H3培养基中加入200-500IU的IL-2,灭活的自体血浆的体积为GT-T551 H3培养基体积的5%，所述NK扩增滋养细胞为K562-4-1BBL-IL-15-IL-21滋养细胞。
[0008] 本发明是将灭活的NK扩增滋养细胞先冻存，用的时候再进行复苏处理。
[0009] 所述K562-4-1BBL-IL-15-IL-21滋养细胞的获得方法为：
[0010] A、利用基因合成方法，获得4-1BBL-IL-15融合基因及IL-21基因的全长编码区序 列，两条基因上游均加入⑶8α信号肽，下游均加入⑶8α跨膜区；与此同时，CD8a信号肽上游 引入Nhe頂每切位点，⑶8α跨膜区引入Not頂每切位点。
[0011] B、构建重组慢病毒表达质粒 pCDH-CMV-MCS-4-lBBL-IL-15 和 pCDH-CMV-MCS-IL-21：
[0012] 将载体pCDH-CMV-MCS-Vector和步骤A所获得的基因分别用限制性内切酶Nhe I和 Not I双酶切，1%琼脂糖凝胶回收纯化后，分别利用T4DNALigase进行连接，获得的连接产 物分别命名为 PCDH-CMV-MCS-4-1BBL-IL-15 和 pCDH-CMV-MCS-IL-21，经酶切鉴定正确后，-20°C保存备用。其中所述p⑶H-CMV-MCS-Vector购买自上海吉然生物科技有限公司，载体名 称为pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro(货号：CD510B-1) 〇
[0013] C、慢病毒包装：
[0014] a.用235yL Opti-MEM稀释2.7yg步骤B获得的连接产物pCDH-CMV-MCS-4-lBBL-IL-15,再加入 1.76yg pLpl(Gal/Pol)、0.95yg pLpVSVG和0.68yg pLp2(pREV)，得到al溶液；用 235yL Opti-MEM稀释2 · 7yg步骤B获得的连接产物pCDH-CMV-MCS-IL-21，再加入 1 · 76yg pLpl(Gal/Pol)、0.95yg pLpVSVG和0.68yg pLp2(pREV)，得到a2溶液；
[0015] b ·用235yL Opti-MEM稀释15yL lipofectamine2000，得到b溶液；
[0016] c.5min后，将al溶液、a2溶液分别和b溶液混合，室温静止30min后分别滴加到接种 293-T细胞的6孔板中；
[0017] d. 6-10h后，去掉培养基，加入含有10 % (v/v)FBS的DMED培养基，于48h和72h各收 病毒一次，最终获得 PCDH-CMV-MCS-4-1BBL-IL-15 慢病毒和 pCDH-CMV-MCS-IL-21 慢病毒。 [0018] D.将收获的两种慢病毒浓缩到3E+8 TU/ml后，病毒以滴度比1:1混匀，以1000的 Μ0Ι值进行K562细胞系的感染，感染72h后通过流式细胞术和有限稀释法克隆出可以稳定遗 传的 K562-4-1BBL-IL-15-IL-21 工程细胞。
[0019] E.将工程细胞株进行100Gy放射线进行致死性照射，照射后混匀抽取1 X 106个进 行培养，每2天计算一次细胞活率，统计15天后未发现有存活细胞存在。
[0020] F.将灭活的K562-4-1BBL-IL-15-IL-21工程细胞株用冻存液进行冻存，每管lmL， 浓度为1 X 1〇7个/mL，用前37°C复苏去冻存液。所述冻存液的配方为90% (v/v)FBS+10% (v/ v)DMS0。
[0021] 利用上述NK细胞体外扩增组合物进行NK细胞扩增的方法，按以下步骤进行：
[0022] 用30mL GT-T551 H3培养基将2X107个~3X107个PBMCs重悬后，接入T75细胞培养 瓶，然后加入的IL-2、NK扩增滋养细胞及占培养基体积5 %的灭活的自体血浆，其中每毫升 GT-T551 H3培养基加入200-500IU的IL-2,每毫升GT-T551 H3培养基加入0.65X 106个~1 X 106个NK扩增滋养细胞，于37 °C 5 % C02条件下体外共培养15天，其中培养第7天时补加一 次NK扩增滋养细胞，补加前对培养液中的NK细胞进行计数，补加的NK扩增滋养细胞的数量 为NK细胞数量的1/5-1/4。培养过程中每天对NK细胞观察计数，当NK细胞密度超过2.5 X 106/mL必须补充培养基，补加的培养基为含有200-500IU/mL IL-2的GT-T551 H3培养基，补 液后NK细胞密度维持在0.8 X 106个/mL~1.0 X 106个/mL，培养13和15天收集细胞进行检测。 [0023] 所述NK扩增滋养细胞为K562-4-1BBL-IL-15-IL-21滋养细胞。
[0024]本发明的有益效果：
[0025] (1)本发明是通过慢病毒包装及感染K562细胞的方法进行4-lBBL、IL-15、IL-21基 因的转导，悬浮的血液细胞及肿瘤细胞属难转染细胞，脂质体转染方法效果极低，电穿孔方 法效率较高，但对细胞损伤较大，且死细胞很难去除，影响转染后的筛选工作。慢病毒感染 方法是一种对细胞较温和且转染效率较高的一种方法，解决了悬浮细胞转染所面临的上述 问题。
[0026] (2)本发明先用枣红素标记的IL-21抗体及IL-15抗体进行流式细胞仪分选，去除 阴性K562细胞，再将筛选的双阳性细胞群进行有限稀释法克隆出可以稳定遗传的K562-4-1BBL-IL-15-IL-21工程细胞，两种方法结合可以缩短筛选周期，使整个过程在1个月以内即 可以完成，同时节约了研发成本。
[0027] (3)本发明将工程细胞株进行lOOGy放射线进行致死性照射，照射后混匀抽取1 X 1〇6个进行培养，每2天计算一次细胞活率，统计15天后未发现有存活细胞存在，该方法可以 保证工程细胞株用于NK扩增的安全性。
[0028] (4)本发明采用自体血浆来促进细胞的增殖，外源因子只加入较低剂量的IL-2,避 免了外源性蛋白及病毒的污染的可能性，而且大大降低了生产成本；
[0029] (5)本发明NK细胞培养组合物可促进NK细胞的大量增殖，且纯度较高，可提高其细 胞的杀伤活性。其不仅可以用于肿瘤患者的体内肿瘤细胞的杀伤及免疫系统的调节，同时 可以应用于亚健康人群的保健。
[0030] 本发明在K562细胞膜表面表达IL-15与4-1BBL的同时，将IL-21也同时表达于K562 细胞表面，同时可溶状态加入IL-2,本发明将IL-15与IL-21组合，二者协同作用，显著提高 发明效果。该组合物可显著促进NK细胞的大量扩增，满足临床应用需求，K562细胞表达并镶 嵌于其表面的蛋白可以使NK细胞聚集于其表面而得到充分刺激，获得的NK细胞纯度较高， 同时该方法也避免了外源性蛋白及病毒的污染的可能性，节省了 NK细胞制备成本，并且提 高肿瘤细胞的杀伤活性。
[0031] 说明书附图
[0032] 图1为试验1扩增过程中的细胞增殖数量变化；
[0033] 图2为试验1中实验组培养13天时的细胞纯度；
[0034] 图3为试验1中实验组培养15天时的细胞纯度；
[0035] 图4为试验1中对照组1培养13天时的细胞纯度；
[0036] 图5为试验1中对照组1培养15天时的细胞纯度；
[0037] 图6为试验1中对照组2培养13天时的细胞纯度；
[0038] 图7为试验1中对照组2培养15天时的细胞纯度；
[0039]图8为试验1培养15天后对NK细胞A549的杀伤活性对比。
【具体实施方式】
[0040]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
[0041 ]【具体实施方式】一:本实施方式NK细胞体外扩增组合物包括NK扩增滋养细胞、IL-2、 灭活的自体血浆和GT-T551 H3培养基，其中每毫升GT-T551 H3培养基中加入0.65X 106个 ~1 X 106个NK扩增滋养细胞，每毫升GT-T551 H3培养基中加入200-500IU的IL-2，灭活的自 体血浆的体积为GT-T551 H3培养基体积的5%，所述NK扩增滋养细胞为K562-4-1BBL-IL-15-IL-21滋养细胞。
[0042]本发明所述NK细胞的体外扩增方法主要是将促进NK细胞活化增殖的因子镶嵌于 本身对NK细胞具有诱导作用的K562细胞表面，使NK细胞可以更好的活化和扩增，使其具有 更好的肿瘤细胞的杀伤活性；该方法花费时间短，安全性高，可以应用于临床细胞生物治 疗，包括肾癌、恶性黑色素瘤、白血病、乳腺癌、直肠癌、胃癌、肺癌、食管癌、宫颈癌、卵巢癌、 多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤(非T细胞淋巴瘤)等恶性肿瘤疾病，尤其可以应用于免疫系统研 究和肿瘤杀伤作用的研究。
[0043]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:每毫升GT-T551 H3培 养基中加入0.7 X 106个~0.9 X 106个NK扩增滋养细胞。其它与【具体实施方式】一相同。
[0044]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一或二不同的是：每毫升GT-T551 H3培养基中加入0.8 X106个NK扩增滋养细胞。其它与【具体实施方式】一或二相同。
【具体实施方式】 [0045] 四：本实施方式与一至三之一不同的是:每毫升GT-T551H3培养基中加入300-400IU的IL-2。其它与一至三之一相同。
【具体实施方式】 [0046] 五：本实施方式与一至三之一不同的是:每毫升GT-T551H3培养基中加入350IU的IL-2。其它与一至三之一相同。
[0047]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一至五之一不同的是:所述K562-4-1BBL-IL-15-IL-21滋养细胞的获得方法为：
[0048] A、利用基因合成方法，获得4-1BBL基因与IL-15基因的融合基因4-1BBL-IL-15及 IL-21基因的全长编码区序列，两条基因上游均加入⑶8α信号肽，下游均加入⑶8α跨膜区； 与此同时，⑶8α信号肽上游引入Nhe頂每切位点，⑶8α跨膜区引入Not頂每切位点；
[0049] B、构建重组慢病毒表达质粒 pCDH-CMV-MCS-4-lBBL-IL-15 和 pCDH-CMV-MCS-IL-21：
[0050] 将pCDH-CMV-MCS-Vector和步骤A所获得的基因分别用限制性内切酶Nhe I和Not I双酶切，1 %琼脂糖凝胶回收纯化后，分别利用T4DNALigase进行连接，获得的连接产物分 别命名为 PCDH-CMV-MCS-4-1BBL-IL-15 和 pCDH-CMV-MCS-IL-21，经酶切鉴定正确后，-20°C 保存备用；
[0051 ] C、慢病毒包装：
[0052] a.用235yL Opti-MEM稀释2.7yg步骤B获得的连接产物pCDH-CMV-MCS-4-lBBL-IL-15,再加入 1.76yg pLpl(Gal/Pol)、0.95yg pLpVSVG和0.68yg pLp2(pREV)，得到al溶液；用 235yL Opti-MEM稀释2 · 7yg步骤B获得的连接产物pCDH-CMV-MCS-IL-21，再加入 1 · 76yg pLpl(Gal/Pol)、0.95yg pLpVSVG和0.68yg pLp2(pREV)，得到a2溶液；
[0053] b ·用235yL Opti-MEM稀释15yL lipofectamine2000，得到b溶液；
[0054] c. 5min后，将al溶液、a2溶液分别和b溶液混合，室温静止30min后分别滴加到接种 293-T细胞的6孔板中；
[0055] d. 6-10h后，去掉培养基，加入含有10 % (v/v)FBS的DMED培养基，于48h和72h各收 病毒一次，最终获得 PCDH-CMV-MCS-4-1BBL-IL-15 慢病毒和 pCDH-CMV-MCS-IL-21 慢病毒。 [0056] D.将收获的两种慢病毒浓缩到3E+8 TU/ml后，病毒以滴度比1:1混匀，以1000的 Μ0Ι值进行K562细胞系的感染，感染72h后通过流式细胞术和有限稀释法克隆出可以稳定遗 传的 K562-4-1BBL-IL-15-IL-21 工程细胞。
[0057] E.将工程细胞株进行lOOGy放射线进行致死性照射，照射后混匀抽取1 X 106个进 行培养，每2天计算一次细胞活率，统计15天后未发现有存活细胞存在。
[0058] F.将灭活的K562-4-1BBL-IL-15-IL-21工程细胞株用冻存液进行冻存，每管lmL， 浓度为1 X 1〇7个/mL，用前37°C复苏去冻存液。其它与【具体实施方式】一至五之一相同。
【具体实施方式】 [0059] 七:本实施方式与六不同的是:所述冻存液的配方为 90% (v/v)FBS+10% (v/v)DMS0。其它与六相同。
【具体实施方式】 [0060] 八:本实施方式NK细胞扩增方法，按以下步骤进行：
[0061 ] 用30mL GT-T551 H3培养基将2X107个~3X107个PBMCs重悬后，接入T75细胞培养 瓶，然后加入的IL-2、NK扩增滋养细胞及占培养基体积5 %的灭活的自体血浆，其中每毫升 GT-T551 H3培养基加入200-500IU的IL-2,每毫升GT-T551 H3培养基加入0.65X 106个~1 X 106个NK扩增滋养细胞，于37 °C 5 % C02条件下体外共培养15天，其中培养第7天时补加一 次NK扩增滋养细胞，补加前对培养液中的NK细胞进行计数，补加的NK扩增滋养细胞的数量 为NK细胞数量的1/5-1/4。培养过程中每天对NK细胞观察计数，当NK细胞密度超过2.5 X 106/mL必须补充培养基，补加的培养基为含有200-500IU/mL IL-2的GT-T551 H3培养基，补 液后NK细胞密度维持在0.8 X 106个/mL~1.0 X 106个/mL，培养13和15天收集细胞进行检测。 [0062]【具体实施方式】九:本实施方式与【具体实施方式】八不同的是：用30mL GT-T551 H3培 养基将2.5 X 107个PBMCs重悬。其它与【具体实施方式】八相同。
[0063]【具体实施方式】十:本实施方式与【具体实施方式】八不同的是:每毫升GT-T551 H3培 养基加入300-400IU的IL-2。其它与【具体实施方式】八相同。
[0064]【具体实施方式】十:本实施方式与【具体实施方式】八不同的是:每毫升GT-T551 H3培 养基加入240IU的IL-2。其它与【具体实施方式】八相同。
[0065]【具体实施方式】^ :本实施方式与【具体实施方式】八不同的是:每毫升GT-T551 H3 培养基加入〇. 7 X 106个~0.9 X 106个NK扩增滋养细胞。其它与【具体实施方式】八相同。
[0066]【具体实施方式】十二:本实施方式与【具体实施方式】八不同的是:每毫升GT-T551 H3 培养基加入ο. 8 X 106个NK扩增滋养细胞。其它与【具体实施方式】八相同。
[0067]【具体实施方式】十三:本实施方式与【具体实施方式】八不同的是:所述NK扩增滋养细 胞为 K562-4-1BBL-IL-15-IL-21 滋养细胞，所述 K562-4-1BBL-IL-15-IL-21 滋养细胞的获得 方法为：
[0068] A、利用基因合成方法，获得4-1BBL基因与IL-15基因的融合基因4-1BBL-IL-15及 IL-21基因的全长编码区序列，两条基因上游均加入⑶8α信号肽，下游均加入⑶8α跨膜区； 与此同时，⑶8α信号肽上游引入Nhe頂每切位点，⑶8α跨膜区引入Not頂每切位点；
[0069] B、构建重组慢病毒表达质粒 pCDH-CMV-MCS-4-lBBL-IL-15 和 pCDH-CMV-MCS-IL-21：
[0070] 将pCDH-CMV-MCS-Vector和步骤A所获得的基因分别用限制性内切酶Nhe I和Not I双酶切，1 %琼脂糖凝胶回收纯化后，分别利用T4DNALigase进行连接，获得的连接产物分 别命名为 PCDH-CMV-MCS-4-1BBL-IL-15 和 pCDH-CMV-MCS-IL-21，经酶切鉴定正确后，-20°C 保存备用；
[0071] C、慢病毒包装：
[0072] a.用235yL Opti-MEM稀释2.7yg步骤B获得的连接产物pCDH-CMV-MCS-4-lBBL-IL-15,再加入 1.76yg pLpl(Gal/Pol)、0.95yg pLpVSVG和0.68yg pLp2(pREV)，得到al溶液；用 235yL Opti-MEM稀释2 · 7yg步骤B获得的连接产物pCDH-CMV-MCS-IL-21，再加入 1 · 76yg pLpl(Gal/Pol)、0.95yg pLpVSVG和0.68yg pLp2(pREV)，得到a2溶液；
[0073] b ·用235yL Opti-MEM稀释15yL lipofectamine2000，得到b溶液；
[0074] c. 5min后，将al溶液、a2溶液分别和b溶液混合，室温静止30min后分别滴加到接种 293-T细胞的6孔板中；
[0075] d. 6-10h后，去掉培养基，加入含有10 % (v/v)FBS的DMED培养基，于48h和72h各收 病毒一次，最终获得 PCDH-CMV-MCS-4-1BBL-IL-15 慢病毒和 pCDH-CMV-MCS-IL-21 慢病毒。 [0076] D.将收获的两种慢病毒浓缩到3E+8 TU/ml后，病毒以滴度比1:1混匀，以1000的 Μ0Ι值进行K562细胞系的感染，感染72h后通过流式细胞术和有限稀释法克隆出可以稳定遗 传的 K562-4-1BBL-IL-15-IL-21 工程细胞。
[0077] E.将工程细胞株进行100Gy放射线进行致死性照射，照射后混匀抽取1 X 106个进 行培养，每2天计算一次细胞活率，统计15天后未发现有存活细胞存在。
[0078] F.将灭活的K562-4-1BBL-IL-15-IL-21工程细胞株用冻存液进行冻存，每管lmL， 浓度为1 X 1〇7个/mL，用前37°C复苏去冻存液，所述冻存液的配方为90% (v/v)FBS+10% (v/ v)DMS0。其它与【具体实施方式】八相同。
[0079]为验证本发明的有益效果，进行以下试验：
[0080]试验1:本试验NK细胞体外扩增组合物及NK细胞扩增方法 [0081 ] 一、制备 K562-4-1BBL-IL-15-IL-21 滋养细胞
[0082] A、利用基因合成方法，获得4-1BBL基因与IL-15基因的融合基因4-lBBL-IL-15、4-1BBL基因与IL-21基因的融合基因4-1BBL-IL-21及IL-21基因的全长编码区序列，两条基因 上游均加入⑶8α信号肽，下游均加入⑶8α跨膜区；与此同时，CD8a信号肽上游引入Nhe I酶 切位点，⑶8α跨膜区引入Not頂每切位点；
[0083] B、构建重组慢病毒表达质粒 pCDH-CMV-MCS-4-lBBL-IL-15、pCDH-CMV-MCS-4- 1BBL-IL-21和pCDH-CMV-MCS-IL-21:
[0084] 将pCDH-CMV-MCS-Vector和步骤A所获得的基因分别用限制性内切酶Nhe I和Not I双酶切，1 %琼脂糖凝胶回收纯化后，分别利用T4DNALigase进行连接，获得的连接产物分 别命名为pCDH-CMV-MCS-4-1BBL-IL-15、pCDH-CMV-MCS-4-1BBL-IL-21 和pCDH-CMV-MCS-I L-21，经酶切鉴定正确后，-20 °C保存备用；
[0085] C、慢病毒包装：
[0086] a.用235yL Opti-MEM稀释2.7yg步骤B获得的连接产物pCDH-CMV-MCS-4-lBBL-IL-15,再加入 1.76yg pLpl(Gal/Pol)、0.95yg pLpVSVG和0.68yg pLp2(pREV)，得到al溶液；用 235yL Opti-MEM稀释2 · 7yg步骤B获得的连接产物pCDH-CMV-MCS-IL-21，再加入 1 · 76yg pLpl(Gal/Pol)、0.95yg pLpVSVG和0.68yg pLp2(pREV)，得到a2溶液；用235yL Opti-MEM稀 释2 · 7yg步骤B获得的连接产物pCDH-CMV-MCS-4-lBBL-IL-21，再加入 1 · 76yg pLpl (Gal/ Pol)、0.95yg pLpVSVG和0.68yg pLp2(pREV)，得到a3溶液；
[0087] b ·用235yL Opti-MEM稀释15yL lipofectamine2000，得到b溶液；
[0088] c.5min后，将al溶液、a2溶液、a3溶液分别和b溶液混合，室温静止30min后分别滴 加到接种293-T细胞的6孔板中；
[0089] d. 6-10h后，去掉培养基，加入含有10 % (v/v)FBS的DMED培养基，于48h和72h各收 病毒一次，最终获得 PCDH-CMV-MCS-4-1BBL-IL-15 慢病毒、pCDH-CMV-MCS-4-lBBL-IL-21 慢 病毒和 pCDH_CMV_MCS_IL_21 慢病毒。
[0090] D.实验组将收获的两种慢病毒浓缩到3E+8 TU/ml后，将pCDH-CMV-MCS-4-lBBL-IL-15慢病毒和pCDH-CMV-MCS-IL-21慢病毒以滴度比1:1混匀，以1000的Μ0Ι值进行K562细 胞系的感染，对照组1将PCDH-CMV-MCS-4-1BBL-IL-15慢病毒以500的Μ0Ι值进行K562细胞感 染，对照组2将PCDH-CMV-MCS-4-1BBL-IL-21慢病毒以500的Μ0Ι值进行K562细胞感染，感染 72h后通过流式细胞术和有限稀释法克隆出可以稳定遗传的K562-4_1BBL-IL-15(对照组 1)、K562-4_1BBL-IL-21(对照组 2)和 K562-4-lBBL-IL-15-IL-21(实验组）工程细胞。
[0091] 本发明先用枣红素标记的IL-21抗体及IL-15抗体进行流式细胞仪分选，去除阴性 K562细胞，再将筛选的双阳性细胞群进行有限稀释法克隆出可以稳定遗传的K562-4-1BBL-IL-15-IL-21工程细胞，两种方法结合可以缩短筛选周期，使整个过程在1个月以内即可以 完成，同时节约了研发成本。
[0092] E.将工程细胞株进行100Gy放射线进行致死性照射，照射后混匀抽取1 X 106个进 行培养，每2天计算一次细胞活率，统计15天后未发现有存活细胞存在。
[0093] F.将灭活的K562-4-1BBL-IL-15-IL-21工程细胞株进行冻存（冻存液配方为90% FBS+10%DMS0)，每管1 X 107个/ml，用前37°C复苏去冻存液。
[0094] 二、实验组用30mL GT-T551 H3培养基将2X107个~3X107个PBMCs重悬后，接入 T75细胞培养瓶，然后加入的IL-2、NK扩增滋养细胞及占培养基体积5 %的灭活的自体血浆， 其中每毫升GT-T551 H3培养基加入200-500IU的IL-2,每毫升GT-T551 H3培养基加入0.65 X 106个~1 X 106个NK扩增滋养细胞，于37°C 5%C02条件下体外共培养15天，其中培养第7 天时补加一次NK扩增滋养细胞，补加前对培养液中的NK细胞进行计数，补加的NK扩增滋养 细胞的数量为NK细胞数量的1/4。培养过程中每天对NK细胞观察计数，当NK细胞密度超过 2.5 X 106/mL必须补充培养基，补加的培养基为含有240IU/mLIL-2的GT-T551 H3培养基，补 液后NK细胞密度维持在1.0 X106个/mL，分别于培养第5天、7天、9天、11天、13和15天收集细 胞进行检测。
[0095] 对照组1、对照组2与实验组的操作相同，只是对照组1将滋养细胞更换为K562-4-1BBL-IL-15,对照组2将滋养细胞更换为K562-4-1BBL-IL-21。
[0096] 检测结果如下：
[0097](一)扩增的NK细胞数量(亿）
[0098] 各组起始接种的PBMCs数量为3 X 107cells，即第0天细胞数为0.30±0.00亿
[0099] 表 1
[0100]
[0101 ]图1为扩增过程中的细胞增殖数量变化，图1中?表示实验组，表示对照组1，▲ 表示对照组2。细胞扩增15d时，实验组细胞数量为114.00 ± 12.37，对照组1细胞数量为68.4 ± 9.75，对照组2细胞数量为59.6 ± 8.67。实验组扩增的细胞数量显著高于对照组1及对照 组2(?1=0.0037〈0.01，？2 = 0.0034〈0.01)，对照组1与对照组2扩增的细胞数量无显著差异 (P = 0.1538>0.05)，说明4-lBBL、IL-15及IL-21同时表达于细胞表面对NK细胞的扩增效果 优于只含 4-1BBL、IL-15 或 4-1BBL、IL-21 的作用。
[0102](二)活率、纯度：
[0103] 表2
[0104]
[0105] 图2为实验组培养13天时的细胞纯度;图3为实验组培养15天时的细胞纯度；图4为 对照组1培养13天时的细胞纯度；图5为对照组1培养15天时的细胞纯度；图6为对照组2培养 13天时的细胞纯度;图7为对照组2培养15天时的细胞纯度。
[0106] 由图可知，实验组细胞中⑶3_，⑶56+比例显著高于实验组1和实验组2,且对照组1 和对照组2无显著差异，说明4-lBBL、IL-15及IL-21同时表达于细胞表面较只表达4-1BBL、 IL-15或4-lBBL、IL-21对NK细胞的扩增纯度影响作用更为明显。各组细胞扩增13天和15天 的⑶3-，⑶56+细胞纯度变化不明显，说明13天时NK细胞已经成熟。
[0107] (三)收获的NK细胞对A549细胞的杀伤活性
[0108] A549细胞接种量为lOOOOcells/孔，效靶比为10:1，时时观察NK细胞对A549细胞的 杀伤效果。接种约19h时加入NK细胞，约90h时达到最大杀伤效果，实验组、对照组1及对照组 2NK杀伤效率分别为:90.64%、82·61 %、73·33%。
[0109]图8为培养15天后对NK细胞A549的杀伤活性对比，图8中曲线1、2表示空白对照组 (即不添加免疫细胞），曲线3、4表示对照组1，曲线5、6表示对照组2,曲线7、8表示实验组。 A549细胞接种量为lOOOOcells/孔，效靶比为10:1，时时观察NK细胞对A549细胞的杀伤效 果。接种约19h时加入NK细胞，约90h时达到最大杀伤效果，实验组、对照组1及对照组2NK杀 伤效率均值分别为:90.64%、82.61 %、73.33，各组均具有很好的肿瘤抑制活性，且实验组 的肿瘤杀伤作用更为明显。
【主权项】
1. 一种NK细胞体外扩增组合物，其特征在于该组合物包括NK扩增滋养细胞、IL-2、灭活 的自体血浆和GT-T551 H3培养基，其中每毫升GT-T551 H3培养基中加入0.65X 106个~IX 106个NK扩增滋养细胞，每毫升GT-T551 H3培养基中加入200-500IU的IL-2,灭活的自体血 浆的体积为GT-T551 H3培养基体积的5%，所述NK扩增滋养细胞为K562-4-1BBL-IL-15-IL-21滋养细胞。2. 根据权利要求1所述的一种NK细胞体外扩增组合物，其特征在于每毫升GT-T551 H3 培养基中加入〇. 7 X 106个~0.9 X 106个NK扩增滋养细胞。3. 根据权利要求1所述的一种NK细胞体外扩增组合物，其特征在于每毫升GT-T551 H3 培养基中加入〇. 8 X 106个NK扩增滋养细胞。4. 根据权利要求1所述的一种NK细胞体外扩增组合物，其特征在于每毫升GT-T551 H3 培养基中加入300-400IU的IL-2。5. 根据权利要求1所述的一种NK细胞体外扩增组合物，其特征在于每毫升GT-T551 H3 培养基中加入350IU的IL-2。6. 根据权利要求1所述的一种NK细胞体外扩增组合物，其特征在于所述K562-4-1BBL-IL-15-IL-21滋养细胞的获得方法为： A、 利用基因合成方法，获得4-1BBL基因与IL-15基因的融合基因4-1BBL-IL-15及IL-21 基因的全长编码区序列，两条基因上游均加入CD8a信号肽，下游均加入CD8a跨膜区；与此同 时，⑶8α信号肽上游引入Nhe頂每切位点，⑶8α跨膜区引入Not頂每切位点； B、 构建重组慢病毒表达质粒 PCDH-CMV-MCS-4-1BBL-IL-15 和 pCDH-CMV-MCS-IL-21: 将pCDH-CMV-MCS-Vector和步骤A所获得的基因分别用限制性内切酶Nhe I和Not I双 酶切，1%琼脂糖凝胶回收纯化后，分别利用T4DNALigase进行连接，获得的连接产物分别命 名为 PCDH-CMV-MCS-4-1BBL-IL-15 和 pCDH-CMV-MCS-IL-21，经酶切鉴定正确后，-20°C 保存 备用； C、 慢病毒包装： a. 用235yL Opti-MEM稀释2.7yg步骤B获得的连接产物pCDH-CMV-MCS-4-lBBL-IL-15， 再加入 1.76yg pLpl、0.95yg pLpVSVG和0.68yg pLp2,得到al溶液；用235yL Opti-MEM稀释 2·7yg步骤B获得的连接产物pCDH-CMV-MCS-IL-21，再加入 1 ·76yg pLpl、0·95yg pLpVSVG和 0.68yg pLp2,得到a2溶液； b. 用235yL Opti-MEM稀释 15yL lipofectamine2000,得到b溶液； c. 5min后，将al溶液、a2溶液分别和b溶液混合，室温静止30min后分别滴加到接种293-T细胞的6孔板中； d. 6-10h后，去掉培养基，加入含有10% (v/v)FBS的DMED培养基，于48h和72h各收病毒 一次，最终获得 PCDH-CMV-MCS-4-1BBL-IL-15 慢病毒和 pCDH-CMV-MCS-IL-21 慢病毒。 D. 将收获的两种慢病毒浓缩到3E+8TU/ml后，病毒以滴度比1:1混匀，以1000的M0I值进 行K562细胞系的感染，感染72h后通过流式细胞术和有限稀释法克隆出可以稳定遗传的 K562-4-1BBL-IL-15-IL-21 工程细胞。 E. 将工程细胞株进行100Gy放射线进行致死性照射，照射后混匀抽取IX 106个进行培 养，每2天计算一次细胞活率，统计15天后未发现有存活细胞存在。 F. 将灭活的K562-4-1BBL-IL-15-IL-21工程细胞株用冻存液进行冻存，每管lmL，浓度 为1\107个/11^，用前37°(：复苏去冻存液。7. 根据权利要求6所述的一种NK细胞体外扩增组合物，其特征在于所述冻存液的配方 为90% (v/v)FBS+10% (v/v)DMSO。 8. NK细胞扩增方法，其特征在于该方法按以下步骤进行： 用30mL GT-T551 H3培养基将2X107个~3X107个PBMCs重悬后，接入T75细胞培养瓶， 然后加入的IL-2、NK扩增滋养细胞及占培养基体积5%的灭活的自体血浆，其中每毫升GT-T551 H3培养基加入200-500IU的IL-2,每毫升GT-T551 H3培养基加入0.65X 106个~1 X 106 个NK扩增滋养细胞，于37 °C 5 % C02条件下体外共培养15天，其中培养第7天时补加一次NK扩 增滋养细胞，补加前对培养液中的NK细胞进行计数，补加的NK扩增滋养细胞的数量为NK细 胞数量的1/5-1/4，培养过程中每天对NK细胞观察计数，当NK细胞密度超过2.5 X 106/mL必 须补充培养基，补加的培养基为含有200-500IU/mL IL-2的GT-T551 H3培养基，补液后NK细 胞密度维持在0.8 X 106个/mL~1.0 X 106个/mL，培养13和15天收集细胞进行检测。9. 根据权利要求1所述的NK细胞扩增方法，其特征在于用30mL GT-T551 H3培养基将 2.5\107个?81?^重悬。10. 根据权利要求1所述的NK细胞扩增方法，其特征在于每毫升GT-T551 H3培养基加入 240IU的IL-2。
【文档编号】C12N5/0783GK105985931SQ201610451780
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】张怡, 刘春香, 芦慧颖, 李琳, 王浩宇, 车彦川, 刘艳青
【申请人】黑龙江天晴干细胞股份有限公司