一种具备增殖能力的自体表皮细胞apg凝胶的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种具备增殖能力的自体表皮细胞APG凝胶的制作方法。
【背景技术】
[0002]大面积烧伤病人、皮肤难愈性创面病人常因创面条件差，皮源有限而致治疗棘手。如何寻求一种为既能提供大量生长因子和细胞因子，刺激血管生成，促进成纤维细胞增殖又能提供上皮细胞促进创面上皮化的研究是主流研究方向，目前这方面的研究尚不多。以往的研究只有单一的方法，比如，烧伤病人通过植皮修复创面，对皮源不足的病人则通过自体皮浆混合其它异体皮或真皮移植解决。但多因为烧伤创面缺乏各类生长因子而致成活率低。为了追求创面中富含人体各类生长因子，有学者研究通过离心自体全血获得的高浓度血小板血浆(PRP)13PRP中含有高浓度的血小板、白细胞和纤维蛋白，为创面愈合提供roGF、TGF-β、VEGF等促伤口愈合因子、白细胞，具有抗菌、收缩创面的作用。也有研究为了防止PRP中的有效因子丢失，将提炼出的PRP通过与凝血酶与钙剂结合形成的富血小板血浆(APG)凝胶可以防止血小板的流失，使血小板在局部长时间分泌生长因子。由于PRP是自源性的，不会出现免疫排斥及传播疾病的危险之虞，是临床上治疗皮肤缺损创面的有效手段。但仅仅有生长因子而没有可以爬行的上皮是不够的。在已有的研究中，多数学者常用的方法是将单一的APG凝胶直接喷洒于创面后用凡士林纱布包扎，或者用医用薄膜封闭创面，前者的不足常直接浸湿纱布而致血小板丢失，后者虽然保证血小板不丢失，但缺乏透气性，往往导致厌氧菌生长，引流不畅导致感染、积液而失败。人表皮细胞是最好的组织覆盖，但它的生长需要良好的肉芽创面及各种生长因子参与调控。而皮片存活依赖与皮片下毛细血管网的建立，在APG中加入人上皮细胞及构建让细胞生长的组织工程支架的研究国内外尚没人报导。国内外也未见有将APG与自体表皮细胞混合成可以简单喷洒操作的凝胶的研究与报导。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的问题是提供一种操作简单、使用方便、效果明显的具备增殖能力的自体表皮细胞APG凝胶的制作方法。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种具备增殖能力的自体表皮细胞APG凝胶的制作方法，其特征在于，包括以下步骤:
步骤1:抽取患者的外周静脉血，置于I号离心试管中；
步骤2:将步骤I中I号离心试管中的外周静脉血在离心速率为800 X g以下离心4min，然后在离心速率为529 Xg以下再一次离心4min;
步骤3:通过巴氏管吸取步骤2中离心后I号离心试管中的上部血浆及靠近界面Imm的RBC转移至2号离心试管中；
步骤4:将步骤3中的2号离心试管中的RBC在离心速率为854*g下离心6min;
步骤5:用巴氏管吸取步骤4中离心后2号离心试管中的上层血浆，并置于3号离心试管内备用； 步骤6:将步骤5中2号离心试管静置30min后振摇，让剩余的红细胞和血小板重悬于剩余的血浆中，即制得PRP;将制备好的PRP放入三腔喷枪的I号管中；
步骤7:催化剂的制取:取Iml 10%的氯化钙溶液与100U凝血酶按照Iml: 200u混合，然后放入三腔喷枪的2号管中；
步骤8:无菌条件下取口腔粘膜2cm Xlcm,将所述口腔粘膜用PBS漂洗，去除皮下组织，剪成0.2cm X 0.2cm小块，加Dipase I溶液，4°C消化24小时；
步骤9:用尖镊从消化过夜后的口腔粘膜小块中分离出表皮细胞，经过PBS漂洗，然后剪碎加入0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的混合液，37°C消化1min，最后加入血清终止消化；步骤10:用吸管反复吹打步骤9中终止消化后的表皮细胞，再用100目的尼龙筛网过滤去除没有完全消化的细胞膜片，离心弃上清液，加入含有15%胎牛血清、表皮生长因子10ug/L的MEM培养液，然后置于37°C、5 %饱和湿度的恒温培养箱中培养，隔日换液I次；
步骤11:当步骤10中恒温培养箱中培养的细胞密度达60 % -70 %时，再次经离心洗涤2次，用血细胞计数板将表皮细胞浓度调整为7 X 10e/ml，即制得表皮细胞悬液；
步骤12:将步骤5中3号离心试管内的上层血浆和步骤11的表皮细胞悬液置入三腔喷枪中的3号管中；
步骤13:将三腔喷枪的1、2、3号管内的物品同时对着皮肤缺损创面喷洒。
[0005]本发明的技术效果主要体现在:将PRP的提取和表皮细胞的培养二者结合起来，填补了市场的空白；表皮细胞改传统的皮肤为口腔粘膜，作成的细胞更易爬行与生长，制作过程漂洗更彻底，消化时间更快;通过催化剂将PRP，表皮细胞悬液混合成凝胶，使得本发明的效果更佳明显，病人恢复的更快;其中的催化剂将表皮细胞与PRP、PPP混成凝胶，既可提供皮表细胞生长必须的生长因子和体液环境，又能有效保护各种细胞因子与表皮细胞不流失;使用三腔喷枪可同时将三种物质在需要时临时配制，避免了活性消失，同时达到喷洒更均匀的效果，而且操作简单，使用方便。
【具体实施方式】
[0006]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0007]一种具备增殖能力的自体表细胞APG凝胶的制作方法，包括以下步骤:
步骤1:抽取患者的外周静脉血，置于I号离心试管中；
步骤2:将步骤I中I号离心试管中的外周静脉血在离心速率为800 X g以下离心4min，然后在离心速率为529 Xg以下再一次离心4min;
步骤3:通过巴氏管吸取步骤2中离心后I号离心试管中的上部血浆及靠近界面Imm的RBC转移至2号离心试管中；
步骤4:将步骤3中的2号离心试管中的RBC在离心速率为854*g下离心6min;
步骤5:用巴氏管吸取步骤4中离心后2号离心试管中的上层血浆，并置于3号离心试管内备用；
步骤6:将步骤5中2号离心试管静置30min后振摇，让剩余的红细胞和血小板重悬于剩余的血浆中，即制得PRP;将制备好的PRP放入三腔喷枪的I号管中； 步骤7:催化剂的制取:取Iml 10%的氯化钙溶液与100U凝血酶按照Iml: 200u混合，然后放入三腔喷枪的2号管中；
步骤8:无菌条件下取口腔粘膜2cm Xlcm,将所述口腔粘膜用PBS漂洗，去除皮下组织，剪成0.2cm X 0.2cm小块，加Dipase I溶液，4°C消化24小时；
步骤9:用尖镊从消化过夜后的口腔粘膜小块中分离出表皮细胞，经过PBS漂洗，然后剪碎加入0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的混合液，37°C消化1min，最后加入血清终止消化；步骤10:用吸管反复吹打步骤9中终止消化后的表皮细胞，再用100目的尼龙筛网过滤去除没有完全消化的细胞膜片，离心弃上清液，加入含有15%胎牛血清、表皮生长因子10ug/L的MEM培养液，然后置于37°C、5 %饱和湿度的恒温培养箱中培养，隔日换液I次；
步骤11:当步骤10中恒温培养箱中培养的细胞密度达60 % -70 %时，再次经离心洗涤2次，用血细胞计数板将表皮细胞浓度调整为7 X 10e/ml，即制得表皮细胞悬液；
步骤12:将步骤5中3号离心试管内的上层血浆和步骤11的表皮细胞悬液置入三腔喷枪中的3号管中；
步骤13:将三腔喷枪的1、2、3号管内的物品同时对着皮肤缺损创面喷洒。
[0008]上面所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定。在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入到本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。
【主权项】
1.一种具备增殖能力的自体表皮细胞APG凝胶的制作方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1:抽取患者的外周静脉血，置于I号离心试管中； 步骤2:将步骤I中I号离心试管中的外周静脉血在离心速率为800 X g以下离心4min，然后在离心速率为529 Xg以下再一次离心4min; 步骤3:通过巴氏管吸取步骤2中离心后I号离心试管中的上部血浆及靠近界面Imm的RBC转移至2号离心试管中； 步骤4:将步骤3中的2号离心试管中的RBC在离心速率为854*g下离心6min ； 步骤5:用巴氏管吸取步骤4中离心后2号离心试管中的上层血浆，并置于3号离心试管内备用； 步骤6:将步骤5中2号离心试管静置30min后振摇，让剩余的红细胞和血小板重悬于剩余的血浆中，即制得PRP;将制备好的PRP放入三腔喷枪的I号管中； 步骤7:催化剂的制取:取Iml 10%的氯化钙溶液与100U凝血酶按照Iml: 200u混合，然后放入三腔喷枪的2号管中； 步骤8:无菌条件下取口腔粘膜2cmX Icm，将所述口腔粘膜用PBS漂洗，去除皮下组织，剪成0.2cm X 0.2cm小块，加Dipase I溶液，4°C消化24小时；步骤9:用尖镊从消化过夜后的口腔粘膜小块中分离出表皮细胞，经过PBS漂洗，然后剪碎加入0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的混合液，37°C消化1min，最后加入血清终止消化；步骤10:用吸管反复吹打步骤9中终止消化后的表皮细胞，再用100目的尼龙筛网过滤去除没有完全消化的细胞膜片，离心弃上清液，加入含有15%胎牛血清、表皮生长因子10ug/L的MEM培养液，然后置于37°C、5 %饱和湿度的恒温培养箱中培养，隔日换液I次； 步骤11:当步骤10中恒温培养箱中培养的细胞密度达60 % -70 %时，再次经离心洗涤2次，用血细胞计数板将表皮细胞浓度调整为7 X 10e/ml，即制得表皮细胞悬液； 步骤12:将步骤5中3号离心试管内的上层血浆和步骤11的表皮细胞悬液置入三腔喷枪中的3号管中； 步骤13:将三腔喷枪的1、2、3号管内的物品同时对着皮肤缺损创面喷洒。
【专利摘要】本发明公开了一种具备增殖能力的自体表皮细胞APG凝胶的制作方法，包括以下步骤：上层血浆、PRP的制取；催化剂的制取；表皮细胞悬液的制取；通过三腔喷枪将上层血浆、PRP、催化剂、表皮细胞悬液同时对着皮肤缺损创面喷洒。其有益效果是：操作简单、使用方便、效果明显。
【IPC分类】C07K14/475, C12N5/071, A61L27/52, A61L27/38, A61L27/60, C12N5/078, A61L27/54
【公开号】CN105505855
【申请号】CN201610078856
【发明人】关志广
【申请人】关志广
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年2月4日