重组成纤维细胞生长因子-8b的生产方法及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体设及重组成纤维细胞生长因子-8b的生产方法及 其用途。
【背景技术】
[0002] 成纤维细胞生长因子-8(fibroblastgrowthfactor8,FGF-8)属于成纤维细胞 生长因子家族成员，与已发现家族成员具有30%~40%同源性。FGW最早于雄激素依赖 的小鼠乳腺癌细胞株SC-3提取获得。人FGW基因位于染色体10q24区段，有6个外显子， 由233个氨基酸组成，成熟FGW是由去掉N端39个氨基酸信号肤的194个氨基酸残基组 成的多肤（分子量约为23kDa)，是等电点约为10. 5的碱性蛋白。人FGW具有a、b、e、f四 种亚型，FGF8b为其优势表达型，且其与FGF受体的结合能力最强。广泛的文献报道FGF8 与胚胎发育，细胞增殖、分化，肿瘤生长，组织损伤修复W及血管生成密切相关。研究表明 FGW是一种广谱神经营养因子，能维持神经细胞存活和促进神经干细胞定向分化成多己胺 值opamine，DA)神经元。基于W上特性，FGW有望能够直接用于治疗退行性神经性疾病，因 此受到学者的广泛关注。FGW在实验研究的需求将会大大增加。
[0003] 杆状病毒表达系统自20世纪80年代开始至今，已经成为基因工程四大表达系统 (即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一，重组杆状病毒载体具有重组 蛋白生产能力强、生产周期短，安全可靠和易扩大等优点，而且表达的蛋白与天然蛋白结构 和生物活性均非常相似，广泛用于基因治疗，疫苗生产，生物制药。
【发明内容】
[0004] 针对W上发现，本发明利用昆虫杆状病毒表达系统表达成熟的FGF8b蛋白，获得 具有生物活性的重组蛋白，为FGF8b的进一步研究开发奠定基础。 阳0化]本发明的目的之一是提供一种重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法，W解决能够大批量生产具有生物活性的FGF8b蛋白的问题，满足生产和可W对FGF8b蛋白的 需求。
[0006] 本发明的还有一个目的是重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白用于治疗帕金森疾 病的用途，通过帕金森细胞模型，能够看出本发明制备的FGF8b蛋白具有对帕金森细胞模 型具有保护作用。 阳007]为此，本发明提供的技术方案为：
[0008] 一种重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法，包括W下步骤：
[0009] 步骤一、利用昆虫杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中表达成纤维细胞生长因 子-8b蛋白，具体包括：
[0010] 1)获得重组杆状病毒Bacmid-FGF8b，其中FGF8b基因为成纤维细胞生长因子-8b 基因，其碱基序列如SEQIDNO: 1所示，
[0011] 2)用步骤1)得到的一定M0I的Bacmid-FGF8b重组杆状病毒侵染昆虫细胞，侵染 后于溫度25~29°C下震荡悬浮培养3化~12化后收获细胞液；W及，
[0012] 步骤二、从步骤一收获的细胞液中纯化得到成纤维细胞生长因子-8b蛋白。
[0013] 优选的是，所述的重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法中，所述步骤2) 中，使用M0I为8的Bacmid-FGF8b重组杆状病毒侵染昆虫细胞。
[0014] 优选的是，所述的重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法中，所述步骤2) 中，用Bacmid-FGF8b重组杆状病毒侵染昆虫细胞后于溫度26. 5~27. 5°C下震荡悬浮培养 6化后收获细胞。
[0015] 优选的是，所述的重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法中，所述步骤1) 中，获得的所述重组杆状病毒Bacmid-FGF8b为第四代重组杆状病毒。
[0016] 优选的是，所述的重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法中，所述步骤1) 中，获得重组杆状病毒Bacmid-FGF8b的具体方法包括：
[0017] 步骤1. 1)WpUC57-FGF8b载体为模板，利用如沈QIDNO: 2和沈QIDNO: 3所示 的引物序列通过PCR扩增得到如SEQIDN0:1所示的核巧酸序列的基因片段，并将其构建 到pFas巧ac质粒上W得到pFas巧ac-FGF8b重组载体；
[0018] 步骤1. 2)利用步骤1. 1)中得到的pFas巧ac-FGF8b重组载体转座含有Bacmid质 粒的E.Coli畑lOBac感受态细胞中，从而使其发生同源重组W得到Bacmid-FGF8b重组载 体；
[0019] 步骤1. 3)利用Bacmid--FGF8b重组质粒转染昆虫细胞W得到第一代重组杆状病 毒；
[0020] 步骤1. 4)将步骤1. 3)中得到的第一代重组杆状病毒转染昆虫细胞W表达得到第 二代重组杆状病毒，之后再利用同样的方法侵染昆虫细胞直到得到第四代重组杆状病毒。
[0021] 优选的是，所述的重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法中，所述步骤二 中，从步骤一中收获的细胞液中纯化得到成纤维细胞生长因子-8b蛋白的具体过程包括：
[0022] 收集昆虫细胞液后，首先于500g离屯、5min收集细胞沉淀，之后向所述细胞沉淀 中加入20倍昆虫细胞液体积的憐酸缓冲液重悬细胞沉淀，冰上超声破碎5min，然后再于 14000g离屯、20min收集上清液，再将上清液经0. 22μm滤膜抽滤后W0. 5ml/min的流速上 样于肝素亲和层析柱，最后依次用含质量体积浓度0. 6mol/L和1. 2mol/L化C1的憐酸缓冲 液对所述肝素亲和层析柱进行梯度洗脱，即得到重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白。
[0023] 优选的是，所述的重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法中，所述憐酸缓 冲液的质量体积浓度为50mmol/L。
[0024] 优选的是，所述的重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法中，进行所述梯 度洗脱时，首先使用含质量体积浓度〇.6mol/L化C1的憐酸缓冲液对所述肝素亲和层析柱 W速率洗脱时间，然后再使用含质量体积浓度和1. 2mol/L化C1的憐酸缓冲液对所述肝素 亲和层析柱W速率洗脱时间。
[00巧]优选的是，所述的重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白的生产方法中，所述昆虫细 胞为S巧细胞。
[00%] 重组成纤维细胞生长因子-8b蛋白用于治疗帕金森疾病的用途。
[0027] 本发明的有益效果为：
[0028] 本发明成功在杆状病毒表达系统中表达了FGF8b，纯化后蛋白纯度达90%W上， 蛋白产量约为2. 78mg/l，能够在短时间获得大量的纯化蛋白，且不需要再对蛋白进行翻译 后加工，获得方式快速方便，能够满足生产和研究的需要。并且，纯化蛋白明显促进NIH3T3 细胞增殖，且在0. 5ng/ml~64ng/ml之间有剂量依赖性。在帕金森细胞模型促增殖实验， FGF8b蛋白起到明显的保护作用，且对帕金森疾病也具有一定的抑制作用，本发明对帕金森 疾病的治疗奠定了基础。
【附图说明】
[0029] 图1为FGF8b基因片段和pFas忧ac载体双酶切凝胶电泳鉴定图。
[0030] 图2为pFas巧ac-FGF8b双酶切凝胶电泳鉴定图。
[0031] 图3为PCR鉴定重组杆状病毒DNA凝胶电泳图。
[0032] 图4a为Westernblot检测不同时间蛋白表达情况图。
[0033] 图4b为Westernblot检测不同病毒滴度蛋白表达图。
[0034] 图5为FGF8b蛋白纯化的SDS-PAGE分析图。
[0035] 图6为FGF8b蛋白纯化的Westernblot鉴定图。
[0036] 图7为不同浓度的FGF8b和bFGF蛋白对NI册T3细胞增殖活性分析图。
[0037] 图8为不同浓度MPP+对PC12细胞的毒性作用结果示意图。 阳03引 图9a为正常PC12细胞（100μπι)示意图。
[0039] 图9b为帕金森造模后的PC12细胞（100μm)示意图。 W40] 图10为不同浓度FGF8b和bFGF蛋白对帕金森细胞模型的细胞增殖作用的结果示 意图。
[0041] 图11a为空白对照处理的帕金森细胞模型的细胞调亡率的流失细胞检测图。 阳0创图1化为MPP+处理的帕金森细胞模型的细胞调亡率的流失细胞检测图。 阳0创图11c为MPP++FGF8b处理的帕金森细胞模型的细胞调亡率的流失细胞检测图。W44] 图lid为MPP++bFGF处理的帕金森细胞模型的细胞调亡率的流失细胞检测图。 W45] 图1le为流式细胞仪检测FGF8b和bFGF对帕金森细胞模型的抗调亡作用的结果 示意图。
【具体实施方式】
[0046] 根据本发明，可采用本领域技能中的常规分子生物学、微生物学、细胞学和DNA重 组技术。如果出现于本文下来术语的定义如下。
[0047] "DNA分子"指脱氧核糖核巧酸（胸腺喀晚、胞喀晚、腺嚷岭或鸟嚷岭）的聚合形式， 是染色体主要组成成分，同时也是组成基因的材料。运一术语只指分子的一级和二级结构， 不限制其任何具体的Ξ级形式。本术语包括特别是在线性DNA分子、病毒、染色体、质粒中 国发现的双链DNA。运里讨论的结构，按照习惯上给出的只是DNA正义链的5'到3'方向的 序列。
[0048] "载体"是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子，一种类型的载体是"质 粒"，质粒是其他的DNA片段可与其连接的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体， 其可将其他的DNA片段连接至病毒基因组。某些载体整合至宿主细胞基因组中，并得W与 宿主基因组一起复制。并且，某些载体能指导与其可操作连接的基因的表达，一般使用的运 样的表达载体为质粒形式。