桥连的双特异性融合蛋白的制作方法

桥连的双特异性融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及桥连的双特异性融合蛋白，具体地，本发明涉及改良的拮抗血管新生诱导因子的融合蛋白及其用途，更具体地，本发明涉及VEGF受体和FGF受体的融合蛋白及其在治疗与血管新生相关的疾病中的用途。
【专利说明】
桥连的双特异性融合蛋白
技术领域
[0001] 本发明涉及桥连的双特异性融合蛋白，具体地，本发明涉及改良的拮抗血管新生 诱导因子的融合蛋白及其用途，更具体地，本发明涉及VEGF受体和FGF受体的融合蛋白及其 在治疗与血管新生相关的疾病中的用途。
【背景技术】
[0002] 血管新生(Angiogenesis)是导致恶性肿瘤生长和转移的基本要素之一 [1]。血管 新生过程受多种因子的调节，有些因子促进血管新生，有些因子抑制血管新生，目前已经知 道相当数目的血管新生刺激因子，例如血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)、肝细胞生 长因子（Hepatocyte growth factor，HGF)、DDR1、EphAl、EphA2、EphA8、EphBl、EphB4、EGFR、 HER-2、ErbB3、MET、RON、CSF1R、KIT、PDGFR-A、PDGFR-B、TEK、T i e-1 等，这些因子能刺激血管 内皮细胞的分裂、分化和血管的形态发生。其中，VEGF是目前所知对血管新生最特异、最有 效的生长因子[2,3]。
[0003] 在肿瘤组织内的缺氧环境中，肿瘤细胞分泌大量的VEGF，诱导血管内皮细胞的分 裂和迀移，最终建立肿瘤血管网络。众多动物试验证明，抑制VEGF能阻止血管新生，进而抑 制肿瘤的生长。正因为此，VEGF及其受体是抗血管新生药物最重要的靶标，目前在临床试验 中取得显著疗效的抗血管新生药物有贝伐单抗(Bevacizumab，商品名Avastin)，它能够直 接阻断VEGF，抑制肿瘤血管的新生，于2004年被美国FDA批准上市作为结直肠癌的一线用 药，是第一个被批准上市的通过抑制血管新生发挥抗癌作用的新药。
[0004] 除了Avastin，还有若干个抗VEGF信号的药物已获得批准上市。Regeneron研发的 针对VEGF的融合蛋白Aflibercept(或称VEGF-Trap)于2011年被FDA批准上市用于治疗年龄 相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)，又于2012年被批准用于治疗 结直肠癌。成都康弘研发的针对VEGF的融合蛋白KH902于2013年11月被CFDA批准上市。
[0005] 抗VEGF药物在肿瘤的临床治疗上取得了重大的进展，但是，临床试验也显示抗 VEGF治疗也存在相当大的局限。导致抗VEGF治疗失败或产生抗性的的根本原因可能在于肿 瘤血管新生是受到多种因子控制的，尽管VEGF在血管新生中起到重要作用，但它不是唯一 的血管新生刺激因子。
[0006] 成纤维细胞生长因子(FGF)是结合肝素的生长因子家族，在哺乳动物中其具有22 个家族成员（FGF 1-14,16-23) JGF在多种生物学功能上具有重要作用，例如细胞增殖、分 化、迀移、血管新生和肿瘤发生。其通过结合并活化细胞表面FGF受体(FGFR)发挥其多种生 物学功能。（参见，例如Eswarakumar et al. Cytokine Growth Factor Rev .16:139-149， 2005)。成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR)是与成纤 维细胞生长因子家族成员相结合的受体。成纤维细胞生长因子受体中的一部分参与疾病过 程。
[0007] 关于两个结合结构域在Fc的两端的报道，中国专利申请CN101490085A公开了一种 具有效应功能的单链多价结合蛋白，其中第一结合结构域与第二结合结构域均源自免疫球 蛋白，第一结合结构域与第二结合结构域分别在Fc的两端。除此之外，中国专利申请 CN104159926A公开了一种包含补体抑制结构域、VEGF抑制结构域的融合蛋白，补体抑制结 构域、VEGF抑制结构域可以在Fc的两端，也可以在Fc的一端。
[0008] 鉴于VEGF和FGF(尤其是FGF-2)在肿瘤血管新生中的重要作用，我们认为双重拮抗 VEGF和FGF(尤其是FGF-2)的大分子蛋白药物将能够更好地抑制肿瘤血管的新生，在临床上 得到更好的治疗效果。中国专利ZL201110131029.X公开了一种VEGFR和FGFR的双靶标融合 蛋白，将VEGFR和FGFR的血管新生抑制单元融合在一起，形成了抑制双重靶标进而抑制血管 新生的融合蛋白，获得了特别好的效果。
[0009] 尽管现有技术在本领域已经取得了上述进展，但是仍然需要稳定性更高、亲和力 更强的血管新生抑制剂。本发明人出人意料地发现，将血管新生抑制单元（例如VEGFR和 FGFR的结构域)放在融合蛋白的两端，可减少相互之间的影响，提高稳定性并且增强亲和 力，进一步改进血管新生抑制效果。

【发明内容】

[0010] 在一个方面中，本发明提供了一种双特异性融合蛋白，其从N端到C端依次包含:特 异性结合血管新生因子的第一靶向结合域、中间桥连结构域和特异性结合血管新生因子的 第二靶向结合域，其中：所述第一靶向结合域包含：一个或更多个VEGF受体或FGF受体的免 疫球蛋白样结构域;所述中间桥连结构域为免疫球蛋白Fc区；和所述第二靶向结合域包含： 一个或更多个VEGF受体或FGF受体的免疫球蛋白样结构域。
[0011]在一些实施方案中，所述一个或更多个VEGF受体的免疫球蛋白样结构域独立地选 自：VEGFR1或VEGFR2的第一免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第二免疫球 蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1 或VEGFR2第四免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第五免疫球蛋白样结构域 或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第六免疫球蛋白样结构域或其一部分、和VEGFR1或VEGFR2第 七免疫球蛋白样结构域或其一部分。
[0012] 在另一些实施方案中，所述一个或更多个FGF受体的免疫球蛋白样结构域独立地 选自：FGFR1第一免疫球蛋白样结构域或其一部分、FGFR1第二免疫球蛋白样结构域或其一 部分和FGFR1第三免疫球蛋白样结构域或其一部分。
[0013] 在又一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是人IgGl Fc区。
[0014] 在一些具体实施方案中，所述第一靶向结合域包含（优选地，从N端到C端依次包 含）：VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域和VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域，以及所述第二靶 向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含）：FGFR1第二免疫球蛋白样结构域和FGFR1第 三免疫球蛋白样结构域;或者
[0015] 所述第一靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含）:FGFR1第二免疫球蛋白 样结构域和FGFR1第三免疫球蛋白样结构域，以及所述第二靶向结合域包含(优选地，从N端 至丨JC端依次包含）：VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域和VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域。
[0016] 在一些具体实施方案中，所述第一靶向结合域包含（优选地，从N端到C端依次包 含)或由其组成:VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域和VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域，以及 所述第二靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含)或由其组成:源自FGFR免疫球蛋 白样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR1第二免疫球蛋白样结构域和FGFR1第三免疫球 蛋白样结构域;或者
[0017] 所述第一靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含）或由其组成：源自FGFR 免疫球蛋白样结构域中间功能性序列区的部分、FGFR1第二免疫球蛋白样结构域和FGFR1第 三免疫球蛋白样结构域，以及所述第二靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含)或 由其组成:VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域和VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域。
[0018] 特别地，本发明的融合蛋白中所述的源自FGFR免疫球蛋白样结构域中间功能性序 列区的部分之氨基酸序列对应于SEQ ID N0:3中起点为选自第119至151位的氨基酸至终点 为第162位氨基酸的氨基酸序列，优选为SEQ ID N0:3第134至162位、145至162位、148至162 位、149至162位或151至162位所示的氨基酸序列，更优选为SEQ ID N0:3第148至162位所示 的氨基酸序列。
[0019] 在另一些具体实施方案中，所述VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ ID NO: 1第151至214位相对应的氨基酸序列;所述VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域具有:与SEQ ID NO:2第224至320位相对应的氨基酸序列；所述FGFR1第二免疫球蛋白样结构域具有：与 SEQ ID N0:3第163至247位相对应的氨基酸序列；和所述FGFR1第三免疫球蛋白样结构域具 有:与SEQ ID N0:3第270至359位相对应的氨基酸序列。
[0020] 在一些实施方案中，本发明的融合蛋白具有抑制血管新生的活性。
[0021] 在另一些实施方案中，相比于Fc区在融合蛋白之C端的融合蛋白，本发明的融合蛋 白表现出提高的稳定性和/或提高的活性。例如，相比于Fc区在融合蛋白之C端的融合蛋白， 本发明的融合蛋白表现出稳定性提高至少10 %、20 %、30 %、40 %、或50 %和/或活性提高至 少 10%、20%、30%、40%、或 50%。
[0022] 在一些特定的实施方案中，本发明的融合蛋白包含或由其组成：
[0023] (l)SEQ ID N0:6、8、10和12中任一项所示氨基酸序列，或由SEQ ID N0:7、9、ll和 13中任一项所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；
[0024] (2)与SEQ ID N0:6、8、10和12中任一项所示氨基酸序列有至少70%同一性的氨基 酸序列，优选地至少80 %、90 %、93 %、95 %、97 %、98 %或99 %同一性;或者 [0025] (3)由与SEQ ID N0:7、9、ll和13中任一项所示核苷酸序列有至少70%同一性的核 苷酸序列所编码的氨基酸序列，优选地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一 性。
[0026] 在另一个方面，本发明提供了编码本发明融合蛋白的分离的核酸分子。
[0027] 在另一个方面，本发明提供了包含本发明核酸分子的载体。
[0028] 在又一个方面，本发明提供了用本发明的载体转染的细胞，优选CH0细胞。
[0029] 在又一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的融合蛋白，以及可 药用载体。
[0030] 在又一个方面，本发明提供了根据本发明的融合蛋白或药物组合物在制备用于在 哺乳动物中抑制血管新生的药物中的用途。
[0031] 在又一个方面，本发明提供了根据本发明的融合蛋白或药物组合物在制备用于治 疗或预防肿瘤和/或眼科血管新生性疾病的药物中的用途，优选地所述肿瘤是实体瘤，所述 眼科血管新生性疾病选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等。
[0032] 在又一个方面，本发明提供了根据本发明的融合蛋白或药物组合物，其用于治疗 或预防肿瘤和/或眼科血管新生性疾病的药物中，优选地所述肿瘤是实体瘤，所述眼科血管 新生性疾病选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等。
[0033] 在又一个方面，本发明提供了治疗或预防肿瘤和/或眼科血管新生性疾病的方法， 其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的根据本发明的融合蛋白或药物组合物。优选地 所述肿瘤是实体瘤，所述眼科血管新生性疾病选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜 病变等。
[0034] 本发明涉及一种双靶标融合蛋白，其包含三个结构域，第一靶向结合域、中间桥连 结构域、第二靶向结合域。
[0035]在一些实施方案中，所述第一靶向结构域为衍生自VEGFR胞外区的部分或衍生自 FGFR胞外区的部分，第二靶向结合域为衍生自FGFR胞外区的部分或衍生自VEGFR胞外区的 部分。
[0036] 特别地，所述衍生自VEGFR胞外区的部分包括VEGFR1、VEGFR2和/或VEGFR3的胞外 区部分。
[0037] 特别地，所述衍生自FGFR胞外区的部分包括FGFR1和/或FGFR2和/或FGFR3和/或 FGFR4的胞外区部分。
[0038] 在又一些实施方案中，所述衍生自VEGFR胞外区的部分包含选自下列的一项或多 项或者由其组成:VEGFR的第一免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR的第二免疫球蛋白 样结构域或其一部分、VEGFR的第三免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR的第四免疫球 蛋白样结构域或其一部分、VEGFR的第五免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR的第六免 疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR的第七免疫球蛋白样结构域或其一部分。
[0039]在又一些实施方案中，所述衍生自FGFR胞外区的部分包含选自下列的一项或多项 或者由其组成:FGFR的第一免疫球蛋白样结构域或其一部分、源自FGFR免疫球蛋白样结构 域中间功能性序列区的部分、FGFR第二免疫球蛋白样结构域或其一部分、FGFR第三免疫球 蛋白样结构域或其一部分。特别地，本发明的融合蛋白所包含的结构域和/或区段等之间可 以直接连接和/或通过接头连接，在一个具体实施方案中，本发明的融合蛋白包含所述源自 FGFR免疫球蛋白样结构域中间功能性序列区的部分，优选地，所述源自FGFR免疫球蛋白样 结构域中间功能性序列区的部分不包括酸性盒(acidic box，AB)。
[0040] 具体地，所述衍生自VEGFR胞外区的部分包括VEGFR1和/或VEGFR2的第二免疫球蛋 白样结构域和VEGFR1和/或VEGFR2的第三免疫球蛋白样结构域。更具体地，所述衍生自 VEGFR胞外区的部分包括VEGFR1的第二免疫球蛋白样结构域和VEGFR2的第三免疫球蛋白样 结构域。
[0041 ]在一个实施方案中，本发明所述的VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ ID NO: 1第151至214位相对应的氨基酸序列，本发明所述的VEGFR1第三免疫球蛋白样结构 域具有:与SEQ ID NO: 1第230至327位相对应的氨基酸序列。
[0042]在一个实施方案中，本发明所述的VEGFR2第二免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ ID N0:2第141至207位相对应的氨基酸序列，本发明所述的VEGFR2第三免疫球蛋白样结构 域具有:与SEQ ID N0:2第224至320位相对应的氨基酸序列。
[0043]在一些具体实施方案中，所述衍生自VEGFR胞外区部分还包括VEGFR1的第一免疫 球蛋白样结构域。优选地，所述VEGFR1的第一免疫球蛋白样结构域具有与SEQ ID NO: 1第32 到123位相对应的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO: 1第32到123位的氨基酸序列有至少 70%同一性，优选地至少80%、90%、93%、95%、97%或99%同一性的氨基酸序列。
[0044]在一些实施方案中，所述衍生自FGFR胞外区部分包括FGFR1第二Ig样结构域或其 一部分、第三免疫球蛋白样结构域或其一部分、以及源自FGFR免疫球蛋白样结构域中间功 能性序列区的部分。
[0045]在一些实施方案中，本发明的融合蛋白中所述的源自FGFR免疫球蛋白样结构域中 间功能性序列区的部分之氨基酸序列对应于SEQ ID N0:3中起点为选自第119至151位的氨 基酸至终点为第162位氨基酸的氨基酸序列，优选为SEQ ID N0:3第134至162位、145至162 位、148至162位、149至162位或151至162位所示的氨基酸序列，更优选为SEQ ID N0:3第148 至162位所示的氨基酸序列。
[0046]在另一些实施方案中，所述的FGFR1第二免疫球蛋白样结构域具有与SEQ ID N0:3 第163至247位相对应的氨基酸序列，所述的FGFR1第三免疫球蛋白样结构域具有与SEQ ID NO: 3第270至359位相对应的氨基酸序列。
[0047]更具体地，衍生自FGFR胞外区部分还包括FGFR1的第一 Ig样结构域或一部分。其中 所述FGFR1的第一免疫球蛋白样结构域具有与SEQ ID N0:3第40至118位相对应的氨基酸序 列，或者与SEQ ID N0:3第40至118位的氨基酸序列有至少70%同一性，优选地至少为80%、 90%、93%、95%、97%或99%同一性的氨基酸序列。
[0048]在又一个实施方案中，所述衍生自VEGFR胞外区的部分为图3 VR M1-M5所示的氨 基酸序列，或者与图3VR M1-M5所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。 [0049]在又一个实施方案中，所述衍生自FGFR胞外区的部分为图4 FR M1-M10所示的氨 基酸序列，或者与图4FR M1-M10所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。 [0050] 中间桥连结构域
[0051 ]在本发明的一些实施方案中，所述中间桥连结构域包括免疫球蛋白结构域、亮氨 酸拉链(Leucine zipper)等。特别地，所述免疫球蛋白结构域为免疫球蛋白Fc结构域，优选 人IgG Fc区，更优选地是人IgG 1的Fc区，再优选地其具有:与SEQ ID N0:4相对应的氨基酸 序列，或者与SEQ ID N0:4的氨基酸序列有至少70%同一性，优选地至少80%、90%、93%、 95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；或者与SEQ ID N0:5相对应的核苷酸序列所 编码的氨基酸序列，或者与SEQ ID N0:5的核苷酸序列有至少70%同一性，优选地至少 80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
[0052] 接头
[0053]在一些实施方案中，所述第一靶向结合域、所述第二靶向结合域直接或通过接头 融合到所述中间桥连结构域的N端或C端。
[0054]在本发明的一些具体实施方案中，本发明的融合蛋白从N端到C端可包含:第一靶 向结合域-接头-中间桥连结构域-第二靶向结合域，第一靶向结合域一中间桥连结构域-接 头-第二靶向结合域，第一靶向结合域-接头-中间桥连结构域-接头-第二靶向结合域，或者 第一靶向结合域一中间桥连结构域-第二靶向结合域。
[0055] 在一些实施方案中，所述接头为短肽接头，例如可选自：GS、PPP、SGGGGSE、DKTHTS、 (GGGGS)η(其中η为 1-19)、AAAGSGGASAS、AAAGS、GXaaGGGSGASAS(其中Xaa为任意氨基酸）、 AAAGSGXaaSGASAS(其中Xaa为任意氨基酸）、ASGGGGSGGGGA、GGGGSGGGGA、ASGA、和GGGGGG。优 选地，所述接头可选自：ASGGGGSGGGGA、（GGGGS)n(其中 n 为1-19,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或其任意区间）、666656666厶、厶56厶和666666。
[0056]本发明人出人意料地发现，仅仅通过调整靶向结合域与中间桥连结构域(例如Fc 区）的顺序，就出人意料地使得本发明的融合蛋白在稳定性和结合亲和力方面得到了显著 的改善。具体地，本发明的融合蛋白在37°C放置15天后，纯度下降不超过1.5%，与对照下降 了约12 %相比，稳定性有意料不到的改善。
【附图说明】：
[0057]图1 ELISA法测融合蛋白与FGF-2的结合能力。
[0058]图2融合蛋白的VEGF端细胞活性测定结果。
[0059]图3所示为VEGFR胞外区M1-M5的氨基酸序列。"......"表示与Ml所示序列一致， 表示不含该序列。
[0060]图4所示为FGFR胞外区M1-M10的氨基酸序列。"......"表示与Ml所示序列一致， 表示不含该序列。
[0061 ]图5所示为SDS-PAGE法测S1融合蛋白的稳定性。
【具体实施方式】
[0062] 定义：
[0063] 除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同 含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标 准3字母和/或1字母代码。特别地，本文所使用术语的含义还可参见中国专利申请 201110131029.X。
[0064] 尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的 数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自 的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何 和所有子范围。例如记载的"1至10"的范围应认为包含最小值1和最大值10之间（包含端点） 的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以 最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为"并入本文"的参考文献应理 解为以其整体并入。
[0065] 另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非 清楚且明确的限于一个所指对象。术语"或"可与术语"和/或"互换使用，除非上下文另有清 楚指明。
[0066]本文使用的术语"Fc"、"Fc区"、"Fc片段"或"免疫球蛋白Fc区"等表示免疫球蛋白 的可结晶片段，在本发明中，所述Fc区优选人IgGl的Fc区。
[0067]本文使用的术语"可溶性"蛋白是指在生物学相关的温度、pH水平和渗透压下可溶 于水溶液的蛋白。在某些实施方案中，本发明的融合蛋白是可溶性蛋白。本文使用的"可溶 性融合蛋白"表示该融合蛋白不包含跨膜区和胞内区。
[0068]如本文所用，术语"分离的"是指以下物质和/或实体，（1)与起初产生时(在天然环 境中和/或在试验设置中）和其相关联的至少一些组分相分离和/或(2)通过人工生产、制备 和/或制造。分离的物质和/或实体可与至少约10 %、约20%、约30%、约40 %、约50%、约 60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约98%、约99%、基本100%或100%的其初始相关联 的其他组分相分离。在某些实施方案中，本发明的融合蛋白是分离的融合蛋白。
[0069]术语"部分"和"片段"可互换的指代多肽、核酸或其它分子构建物的一部分。
[0070]本文使用的术语"Ig样结构域"或者"免疫球蛋白样结构域"可互换使用，其表示本 发明的蛋白中与免疫球蛋白结构类似的结构域。所述Ig样结构域可见于多种蛋白质家族， 参与多种生物学功能，包括细胞-细胞识别、细胞表面受体、免疫功能等等。
[0071] 本文使用的术语"FGFR"表示成纤维细胞生长因子受体，其可以是FGFR1、FGFR2、 FGFR3和/或FGFR4。优选地，本发明中的FGFR是FGFR1，更优选人FGFR1。例如"FGFR1"表示成 纤维细胞生长因子受体1。
[0072]本文使用的术语"FGFR Ig样结构域中间功能性序列区"或"FGFR Ig样结构域中间 功能性序列"或"IFS"表示FGFR蛋白中第一Ig样结构域和第二Ig样结构域之间的序列。优选 地，IFS序列具有对应于SEQ ID N0:3第119至162位的氨基酸序列。本发明人出乎意料地发 现，所述中间功能性序列区对于Ig样结构域的功能具有显著的影响。在一些实施方案中，本 发明提供了FGFR融合蛋白，其包含多种不同长度的源自所述中间功能性序列区的部分，特 别优选地源自所述中间功能性序列区的部分不包含酸性盒。更优选地，所述源自IFS的部分 具有与SEQ ID N0:3第134至162位、145至162位、148至162位、149至162位或151至162位对 应的氨基酸序列。所述FGFR蛋白优选FGFR1(SEQ ID从):3)，特别是人?6?1?1蛋白。
[0073] 本文使用的术语"酸性盒(acidic box)"表示在上述IFS中由8个酸性氨基酸组成 的区段，即序列为EDDDDDDD的区段。具体地，其为FGFR1 (SEQ ID N0:3)的127到133位序列。
[0074] 本文所使用的术语"对象"是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如家养动 物(如狗、猫等），家畜(如牛、羊、猪、马等)或实验动物(如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等）。
[0075] 本文使用的术语"一致性"、"百分比一致性"、"同源性"或"同一性"指两个氨基酸 序列之间或者核酸序列之间的序列同一性。可以通过比对两个序列来确定百分比一致性， 百分比一致性指所比较的序列共有位置相同残基（即氨基酸或核苷酸)的数量。可使用本领 域的标准算法（例如Smith和Waterman，1981，Adv.Appl .Math· 2:482;Needleman和Wunsch， 1970，J.MoI.Biol.48:443;Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad·Sci·，USA，85:2444) 或者通过这些算法的计算机化版本(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，WI)进行序列比对和比较， 所述计算机化版本公开可用为BLAST和FASTA。另外，通过美国国家卫生研究院（Bethesda MD)可用的ENTREZ可用于序列比较。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各个程序(例 如BLASTN，在美国国家生物技术信息中心的因特网站点上可用）的缺省参数。在一个实施方 案中，可使用缺口权重为1的GCG来确定两个序列的百分比同一性，使得每个氨基酸缺口给 予权重如同它是两个序列间的单氨基酸不匹配。或者，可使用ALIGN程序（2.0版），其是GCG (Aceelrys，San Diego，CA)序列比对软件包的一部分。
[0076]下面给出hFGFRl的部分序列，阴影部分依次表示各个Ig样结构域，可参见http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAH15035.1
[0077] MffSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEYES
[0078] FGFR1的氨基酸序列可参见SEQ ID N0:3。
[0079] 本文使用的术语"VEGFR"表示血管内皮细胞生长因子受体，其可以是VEGFR1、 VEGFR2和/或VEGFR3。优选地，本发明中的VEGFR是VEGFR1和/或VEGFR2,优选人的VEGFR。例 如"VEGFR1"表示血管内皮细胞生长因子受体1。
[0080] 下面给出hVEGFRl的部分序列，阴影部分依次表示各个Ig样结构域，各结构域之间 为天然连接序列。hVEGFRl 的具体序列可参见 http: //www · uniprot · org/uniprot/P17948:
[0082] VEGFR1的氨基酸序列可参见SEQ ID N0:1。
[0083] 下面给出hVEGFR2的部分序列，阴影部分依次表示各个Ig样结构域，各结构域之间 为天然连接序列。hVEGFR2的具体序列可参见http: //www · uniprot · org/uniprot/P35968
[0084]

[0085] VEGFR2的氨基酸序列可参见SEQ ID N0:2。
[0086] 本文使用的术语融合蛋白或部分或结构域"与SEQ ID Ν0:Ν对应的氨基酸序列"表 示，所述融合蛋白或部分或结构域具有基本上如SEQ ID Ν0:Ν所示的氨基酸序列，优选地其 中含有不超过1、2、3、4、5、10或20个氨基酸替换、添加或缺失，又优选地所述融合蛋白或部 分或结构域具有与SEQ ID勵4所示氨基酸序列至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或 99%的同一性，更优选地，所述融合蛋白或部分或结构域具有SEQ ID N04所示氨基酸序 列。
[0087] 本发明的所述的"接头"可以是本文公开的任意融合蛋白的成分的接头。在一些实 施方案中，该接头用在第一靶向结合域和桥连结构域之间或第二靶向结合域和桥连结构域 之间。在一些实施方案中，融合多肽包含至少一个接头，但不超过两个接头，例如，融合多肽 可以从N端到C端按以下顺序排列：1)第一靶向结合域-接头-桥连结构域-第二靶向结合域； 2)第一靶向结合域-接头-桥连结构域-接头-第二靶向结合域;3)第一靶向结合域-桥连结 构域-接头-第二靶向结合域。
[0088] 在所述方法的一些实施方案中，可一起（同时)或在不同时间（依次地)施用一种或 多种VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白。另外，所述融合蛋白可与另一类治疗癌症或抑制血管新生的 药物一起施用。
[0089] 在一些实施方案中，本公开的主题方法可单独使用。或者，可将所述主题方法与其 它用于治疗或预防增殖性疾病(例如肿瘤）的常规抗癌治疗法组合使用。例如，这些方法可 用于预防癌症、预防癌症复发和手术后转移，以及作为其它癌症治疗的辅助手段。本公开表 明，可通过使用目标多肽治疗剂来增强常规癌症治疗(例如，化疗、放疗、光疗、免疫疗法和 手术)的有效性。
[0090] 施用
[0091 ]本发明中的融合蛋白可以单独施用，但优选地作为药物组合物施用，其通常包括 根据施用的计划方式所选的适合的药物赋形剂、稀释剂或载体。融合蛋白可以通过任何适 合的方式适用于需要治疗的患者。精确的计量将取决于多个因素，包括该融合蛋白精确的 性质。
[0092] -些合适的使用方式包括(但不限于）口服、直肠、鼻部、局部(包括口腔和舌下）、 皮下、阴道或胃肠外的(包括皮下、肌肉、静脉、皮内、鞘内和硬脑膜外)施用。
[0093]对于静脉注射和在病痛位置的注射，活性成分将为一种胃肠外接受的水溶液形 式，其不含热源并具有合适的pH值、等张性和稳定性。
[0094] 本领域中相关技术人员可使用适当的溶剂或制剂配制融合蛋白，例如：等张赋形 剂如氯化钠注射液、林格氏注射液，乳酸林格氏注射液。根据要求，可以加入防腐剂、稳定 剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它一些添加剂。口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉 剂或口服液等形式。片剂可以包括固体载体，如明胶或辅剂。液体药物组合物通常包括液体 载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。也可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其 它糖溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
[0095] 以上所提到的技术和方案的例子以及其它一些根据本发明所使用的技术和方案 可以在Remingtor/s Pharmaceutical Sciences，16th edition，0slo，A.(ed)，1980.中找 到。
[0096] 实施例1双靶标融合蛋白重组表达质粒的构建
[0097] 1 ·制备VEGFR和FGFR的DNA片段
[0098] VEGF受体和FGF受体cDNA片段通过合成而获得（由南京金斯瑞生物科技有限公司 合成），序列见SEQ ID N0:14，SEQ IN勵：16。合成的〇0嫩片段是直接合成至?1^57-载体上 (所述载体可购自南京金斯瑞生物科技有限公司）。
[0099] 2 ·制备长接头Fc的DNA片段
[0100]合成Fc-cDNA序列，所合成的Fc前后均带有接头（由南京金斯瑞生物科技有限公司 合成），其合成至载体HX1上(所述载体可购自南京金斯瑞生物科技有限公司），从而得到带 有长接头的Fc DNA片段，在本文中也被称为Fc long。具体地，前后接头分别为： ASGGGGSGGGGA和GGGGSGGGGAJc的cDNA序列参见SEQ ID N0:5。
[0101] 3.制备短接头Fc的DNA片段
[0102] 以Fc long为模板，设置不同的引物进行PCR扩增可获得带有不同接头的Fc片段， 从而构建出带有不同接头的中间桥连结构域。
[0103] 以合成的Fc long为模板，使用下表1中所示引物(如SEQ ID N0:18和19所示)进行 PCR扩增，从而得到短接头Fc的DNA序列，即-ASGA-Fc-ASGA-片段，其在本文中也被称为Fc short。
[0104] 表1
[0105]

[0106] PCR扩增的条件为:98°C预变性5min，98°C变性15s，然后于72°C退火lmin，72°C延 伸5min，共进行32个循环。扩增完成后，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN公司）纯化回 收PCR扩增片段。用Nhel/Nael同时酶切PCR产物和HX1表达载体，置37°C进行酶切反应1小时 以上，使用QIAquick胶提取试剂盒(QIAGEN公司）回收目的片段。将回收的目的片段使用连 接酶(New England BioLabs)于室温连接1小时，将连接产物通过热激转化的方法转入大肠 杆菌感受态细胞中。挑菌进行DNA测序验证，证实得到了上述片段。
[0107] 4.引入第一靶向结合域
[0108] 将第3步获得的质粒与第1步合成的PUC57-FGFR或者PUC57-FltKdr(即，VEGFR)同 时用Nhel和BSPQI进行酶切。酶切体系为质粒lyg/μL 40yl，10Xcutsmart 5yl，NheI-HF 1.5 μL，加水至50μ1，置37°C进行酶切反应1小时以上，再加1.5μ1的BSPQI反应1小时以上。用1% 的琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化，并用QIAquick胶提取试剂盒(QIAGEN公司）回收目的片 段。将回收的目的片段使用连接酶(New England BioLabs)于室温连接1小时，将连接产物 通过热击转化的方法转入大肠杆菌感受态中。挑菌进行DNA测序验证，证实得到了Fc分别与 FGFR或者VEGFR相连的片段。
[0109] 5.引入第二靶向结合域
[0110] 以HJC57-FGFR，PUC57-FltKdr为模板，使用下表中所示引物（如SEQ ID N0:20、21、 22和23所示），进行PCR扩增，PCR引物中引入了酶切位点，PspoMI和Nael。
[0111] 表2
[0112]
[0113] PCR反应条件与第3步相同。PCR反应完成后，用1 %的琼脂糖凝胶电泳进行分离纯 化，并用QIAquick胶提取试剂盒(QIAGEN公司）回收目的片段。
[0114] 使用内切酶PspoMI和Nael同时酶切PCR反应产物和上一步获得的质粒，于室温反 应lh，跑胶纯化，并用QIAquick胶提取试剂盒(QIAGEN公司）回收目的片段。将回收的目的片 段使用连接酶(New England BioLabs)于室温连接1小时，将连接产物通过热击转化的方法 转入大肠杆菌感受态中。挑菌进行DNA测序验证，证实得到了Fc的两端分别与FGFR或者 VEGFR相连的片段。
[0115] 根据以上方法分别构建得到融合蛋白31，52,53,54，其所对应的氨基酸序列和核 苷酸序列见下表3a，其结构如表3b所示。
[0116] 表3a融合蛋白对应的序列
[0117]
[0118]
[0119] 表3b融合蛋白的结构
[0120]
[0121] 实施例2融合蛋白的瞬时表达
[0122] 用MAX质粒提纯试剂盒(QIAGEN)提纯相应融合蛋白质粒DNA，用紫外分光光度计确 定质粒DNA的浓度，将重组质粒lyg和6yL脂质体(FuGENE 6 Transfection Reagent，Roche 公司）于100yL新鲜頂DM培养液(GIBC0公司）中混匀，静置15分钟后加入按细胞密度3 X 105/ mL接种于6孔板过夜培养的CH0细胞(ATCC)中，细胞完全培养液含88%MDM、10%的FBS、1 % HT和1 %谷氨酰胺（均为GIBC0公司产品），于37°C，5%⑶2培养箱中培养48小时后收集上清， 用人IgG ELISA蛋白定量试剂盒(BETHYL公司）确定CH0分泌表达融合蛋白的相对含量。 [0123]实施例3融合蛋白的结合亲和力测定
[0124] 使用ELISA法检测以上构建的融合蛋白与VEGF和FGF-2的结合能力。用20ng/孔的 VEGF或50ng/孔FGF-2包板，100μ1/孔，2-8°C过夜。洗板机洗板3次。3 % BSA-PBST溶液封闭， 37度2h。洗板机洗板3次。加样：用PBST溶液稀释标线从10000ng/ml(VEGF包板时）或 50000ng/ml (FGF包板时)起梯度稀释9个点，100μ1/孔，37度lh。洗板机洗板3次。用PBST溶液 稀释二抗（Goat anti-human IgG-Fc-HRP)5000倍，。加入TMB显色液显色，室温避光显色 5min。用2M H2S〇4终止试验，450nm酶标仪读取光密度吸收值。其中，以VEGFR-FGFR-Fc融合蛋 白构建体作为对照，即中国专利CN102219859B中的#28构建体。
[0125] 本发明的融合蛋白与VEGF的结合能力见下表5。结果显示，本发明的融合蛋白与 VEGF的结合能力均显著好于对照。
[0126] 表5与VEGF的结合能力
[0127]
[0128] 本发明融合蛋白与FGF-2的结合能力见下表6及图1。由结果可知，本发明的融合蛋 白SI、S3与FGF-2的结合能力均好于对照(#28构建体）。
[0129] 表6与FGF-2的结合能力
[0130]
[0131] 实施例4融合蛋白的细胞活性试验
[0132] 人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)分裂试验检验融合蛋白抑制血管内皮细胞的分 裂能力。
[0133] 使用HUVEC完全培养基(购自上海澳赛尔斯生物技术有限公司）于37°C，5%C02培 养箱中培养HUVEC细胞(购自上海澳赛尔斯生物技术有限公司）至细胞对数生长期。用胰酶 消化计数HUVEC细胞，将HUVEC细胞悬液分别用含VEGF 40ng/mL稀释至70000个/mL。将稀释 好的细胞悬液以每孔l〇〇yL加入到96孔板中（每孔细胞数为7000个）。37°〇、0)2培养箱孵育 过夜。
[0134] 按下表7中的药物浓度进行稀释，以lOOyL/孔的量加入到96孔板中，每个浓度3个 复孔，设置空白对照(加等量培养基）。置于37°C二氧化碳恒温培养箱中培养72h。药物作用 72h后，加入含CCK-810 %的无血清1640培养基(D0JIND0公司）100μL7孔。37°C、C02培养箱孵 育lh，使用酶标仪测450nm处0D值。根据吸光度的差异确定融合蛋白抑制VEGF或FGF-2诱导 的血管内皮细胞分裂的能力。
[0135] 表7 VEGF端测活药物加样浓度梯度
[0136]
[0137] 结果见图2，S3VEGF端的细胞活性要明显高于对照。
[0138] 实施例5融合蛋白的稳定性试验
[0139] a)HPLC 法检测
[0140] 将制备好的样品放置在37°C中进行加速稳定性试验，分别加速0天、1天、3天、7天、 15天，加速样品取出后置于_80°C保存待检。然后用HPLC(安捷伦1200液相色谱仪)检测融合 蛋白的纯度，色谱柱为TSK-G3000。
[0141] 具体操作步骤如下：1)流动相配制20mM磷酸钠溶液，0.3M NaCl，pH6.8，0.45μπι微 孔过滤膜滤过，待用。2)样品准备样品稀释至lmg/mL，上样量25μΜ3)色谱条件见表8,按峰 面积归一化法进行计算，结果见下表9。
[0142] 表8 HPLC色谱条件
[0143]
[0144] 表9 HPLC法测得的样品纯度
[0145]
[0146] 由表9可知，对照样品37°C放置15天后，纯度下降非常明显。不论是下降幅度还是 最终纯度，本发明的融合蛋白均显著优于对照。具体地，对照的纯度下降了12.3%(95%_ 82.7% = 12.3%)，而本发明制备的样品S1-S4在37°C放置15天后，纯度下降非常轻微，仅为 约0.5%-1.5%。由此可知，本发明制备的样品稳定性得到了极大的改善。
[0147] b)SDS_PAGE 法检测
[0148] 将制备好的S1样品与对照样品同时放在-80°c、4°C、25°C、37°C中进行加速，14天 后取出，SDS-PAGE法检测。检测结果见图5。
[0149] 由图5可知，S1样品明显比对照样品稳定，降解条带少，特别是在25°C、37°C放置14 天后，对照样品降解非常明显，而S1样品仍非常稳定，几乎无降解。由此可知，本发明制备的 S1样品稳定性得到了极大的改善。
[0150] 本发明已通过各个具体实施例作了举例说明。但是，本领域普通技术人员能够理 解，本发明并不限于各个【具体实施方式】，普通技术人员在本发明的范围内可以作出各种改 动或变型，并且在本说明书中各处提及的各个技术特征可以相互组合，而仍不背离本发明 的精神和范围。这样的改动和变型均在本发明的范围之内。
[0151] 参考文献
[0152] [l]Hanahan D?ffeinberg RA.The hallmarks of cancer.Cell?2000?100(1)：57-70.
[0153] [2]Ferrara N?Gerber HP?LeCouter J.The biology of VEGF and its receptors.Nat Med.2003?9：669-76.
[0154] [3]Ferrara N.Vascular endothelial growth factor as a target for anticancer therapy.Oncologist.2004?1：2-10.
【主权项】
1. 双特异性融合蛋白，其从N端到C端依次包含:特异性结合血管新生因子的第一靶向 结合域、中间桥连结构域和特异性结合血管新生因子的第二靶向结合域，其中 所述第一靶向结合域包含:一个或更多个VEGF受体或FGF受体的免疫球蛋白样结构域； 所述中间桥连结构域为免疫球蛋白Fc区；和 所述第二靶向结合域包含:一个或更多个VEGF受体或FGF受体的免疫球蛋白样结构域。2. 权利要求1的融合蛋白，其中所述一个或更多个VEGF受体的免疫球蛋白样结构域独 立地选自：VEGFR1或VEGFR2的第一免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第二 免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域或其一部分、 VEGFR1或VEGFR2第四免疫球蛋白样结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第五免疫球蛋白样 结构域或其一部分、VEGFR1或VEGFR2第六免疫球蛋白样结构域或其一部分、和VEGFR1或 VEGFR2第七免疫球蛋白样结构域或其一部分。3. 权利要求1的融合蛋白，其中所述一个或更多个FGF受体的免疫球蛋白样结构域独立 地选自：FGFR1第一免疫球蛋白样结构域或其一部分、FGFR1第二免疫球蛋白样结构域或其 一部分和FGFR1第三免疫球蛋白样结构域或其一部分。4. 权利要求1的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是人I gG 1 Fc区。5. 权利要求1-4中任一项的融合蛋白，其中 所述第一靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含）：VEGFR1第二免疫球蛋白样 结构域和VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域，以及所述第二靶向结合域包含(优选地，从N端 至丨JC端依次包含）：FGFR1第二免疫球蛋白样结构域和FGFR1第三免疫球蛋白样结构域； 或者 所述第一靶向结合域包含(优选地，从N端到C端依次包含）：FGFR1第二免疫球蛋白样结 构域和FGFR1第三免疫球蛋白样结构域，以及所述第二靶向结合域包含(优选地，从N端到C 端依次包含）:VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域和VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域。6. 权利要求5的融合蛋白，其中： 所述VEGFR1第二免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ ID NO: 1第151至214位相对应的氨 基酸序列， 所述VEGFR2第三免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ ID NO:2第224至320位相对应的氨 基酸序列， 所述FGFR1第二免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ ID NO:3第163至247位相对应的氨基 酸序列，和 所述FGFR1第三免疫球蛋白样结构域具有：与SEQ ID NO:3第270至359位相对应的氨基 酸序列。7. 前述任一项权利要求的融合蛋白，所述蛋白具有抑制血管新生的活性。8. 前述任一项权利要求的融合蛋白，所述蛋白包含或由其组成： (1) SEQ ID N0:6、8、10和12中任一项所示氨基酸序列，或由SEQ ID N0:7、9、ll和13中 任一项所示核苷酸序列编码的氨基酸序列； (2) 与SEQ ID N0:6、8、10和12中任一项所示氨基酸序列有至少70%同一性的氨基酸序 列，优选地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性;或者 (3) 由与SEQ ID N0:7、9、ll和13中任一项所示核苷酸序列有至少70%同一性的核苷酸 序列所编码的氨基酸序列，优选地至少80 %、90 %、93 %、95 %、97 %、98 %或99 %同一性。9. 编码前述任一项权利要求的融合蛋白的分离的核酸分子。10. 包含权利要求9的核酸分子的载体。11. 用权利要求10的载体转染的细胞，优选CHO细胞。12. -种药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项的融合蛋白，以及可药用载体。13. 权利要求1-8中任一项的融合蛋白或权利要求12的药物组合物在制备用于在哺乳 动物中抑制血管新生的药物中的用途。14. 权利要求1-8中任一项的融合蛋白或权利要求12的药物组合物在制备用于治疗或 预防肿瘤和/或眼科血管新生性疾病的药物中的用途，优选地所述肿瘤是实体瘤，所述眼科 血管新生性疾病选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等。
【文档编号】C07K16/46GK106084062SQ201610144347
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年3月14日 公开号201610144347.2, CN 106084062 A, CN 106084062A, CN 201610144347, CN-A-106084062, CN106084062 A, CN106084062A, CN201610144347, CN201610144347.2
【发明人】房健民, 姜静, 李伟伟
【申请人】烟台荣昌生物工程有限公司