一株特异性拮抗黄单胞菌的变棕溶杆菌oh21的分离鉴定的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一株对植物病原黄单胞菌具有特异性拮抗活性 的生防细菌菌株的分离鉴定。 (二）
【背景技术】
[0002] 黄单胞菌是一类重要的植物病原细菌，能侵染400多种植物，包括许多重要的农 作物和经济作物，如水稻、棉花、大豆、十字花科植物、柑橘、香蕉和木薯等。其中水稻白叶 枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae)、野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pathovars)和地毯草黄单胞菌（Xanthomonas axonopodis pathovars)在全球前十位最重 要的植物病原细菌中分别排在第四位、第五位和第六位。
[0003] 目前，生产上对黄单胞菌病害的防治主要依靠抗病品种和化学防治。化学防治所 用的农药包括一些农用抗生素（如农用链霉素）、铜制剂（如络氨铜、喹啉铜）和一些保护 性杀菌剂（如叶枯灵、叶枯净）等。总体来说，防治黄单胞菌病害的农药种类较少，而且这 些农药有些使用受到限制，有些防治效果一般，因此，生产上迫切需要开发更多新型、高效、 安全的农药品种。
[0004] 溶杆菌（Lysobacter spp.)属于y-变形菌门，黄单胞科，溶杆菌属。该细菌属 的一些种能产生不同的小分子抗菌次生代谢物质，并具有高效抗菌活性和植物病害生防潜 力，是一类新型植物病害生防细菌。因此，分离鉴定对黄单胞菌具有特异性拮抗活性的溶杆 菌菌株，从中获得其合成的特异性抗菌活性物质，可为新型农用抗生素的开发和黄单胞菌 病害的防治提供新的手断和途径。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明利用稀释涂布的方法，以野油菜黄单胞菌野油菜致病变种作为靶标菌， 从植物根际土壤中筛选到一株对黄单胞菌具有特异性拮抗活性的菌株0H21，经形态学、 16SrDNA等方法鉴定为变棕溶杆菌（Lysobacter brunescens)。该菌对黄单胞菌具有特异 的拮抗活性。
[0006] 本发明提供的拮抗细菌0H21，已于2013年12月27日保藏在位于北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心（简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 8650,分类命名为变棕溶杆菌Lysobacter brunescens〇 (四）
【附图说明】
[0007] 图10H21在不同培养基上的菌落形态
[0008] 图20H21的电镜观察图片（0H21在电镜下菌体形态如图2所示）
[0009] 图30H21对黄单胞菌拮抗效果图（0H21对病原细菌的拮抗活性测定如图3所示）
[0010] 图40H21的16S rDNA PCR电泳图（0H21 16S rDNA序列PCR扩增的电泳图如图4 所示）
[0011] 图50H21的系统发育树 (五）【具体实施方式】
[0012] 以下通过具体实施对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
[0013] 1材料和方法
[0014] 1. 1试验菌株、培养基
[0015] 试验菌株：野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv. campestris)、水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae)PX099A 菌株、水 稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)RS105菌株、水稻白叶枯病菌 (Xanthomonas oryzae pv.oryzae)KACC菌株、地毯草黄单胞菌大豆致病变种（Xanthomonas axonopodis pv. glycines)、丁香假单胞菌大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv. glycinea);嗜酸菌西瓜亚种（Acidovorax citrulli) ;丁香假单胞杆菌黄瓜角斑致病 变种（Pseudomonas syringae pv. lachrymans);梨火疫病菌（Erwinia amylovora);大肠杆 菌（E.coli)、抗生素溶杆菌（Lysobacter antibioticus)0H13(见专利 CN 103667136 A)〇
[0016] 培养基：
[0017] NA培养基：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，Yeast extract lg，鹿糖10g，蒸馏水1L， pH7. 2,固体培养基分装后另加琼脂1. 5g/100mL。
[0018] 10% TSA :胰蛋白胨大豆肉汤培养基（Tryptic-Soytone-Broth-Medium)3g，蒸馏 水1L，分装后另加琼脂1. 88g/100mL。
[0019] TSA :胰蛋白胨大豆肉汤培养基（Tryptic-Soytone-Broth_Medium)30g，蒸馏水 1L，分装后另加琼脂1. 88g/100mL。
[0020] LB :Tryptone 10g，NaCl 10g，Yeast Extract 5g/L，加入水溶解，最后定容至 1L， 调节pH = 7. 0-7. 2,分装后，LB固体培养基另加琼脂粉1. 5g/100mL。
[0021] 1. 2根际土壤细菌的分离
[0022] 取作物根际土样10份，将采集的土样经2mm 土壤筛过筛，称取10g于装有90mL无 菌水的三角瓶中，摇床振荡30min后10倍梯度稀释5次。吸取稀释液100 y 1于NA平板上 涂布，每个稀释度重复涂布于3块平板，28°C培养2天。稀释度以每个平板上菌落数100-300 个为宜，挑取不同类型的菌落于NA平板进行纯化，纯化3次后-70°C保存。
[0023] 1. 3拮抗细菌对病原细菌拮抗活性的测定
[0024] 挑取单菌落在NA液体培养基中培养24_48h，获得0D_= 1. 0的细菌菌液。取 50 y 1病原菌菌液，稀释100倍后铺于NA平板上，将多余菌液吸出，吹干待用。吸取3 y 1拮 抗细菌菌液（〇D_= 1.0)滴于铺有病原菌的平板上，三次重复，以0H13菌株作对照。28°C 培养2-5d，观察并拍照。
[0025] 1. 4拮抗细菌菌株的鉴定
[0026] 1. 4. 1菌落形态观察与电镜观察
[0027]菌落形态：取0H21菌液3 y 1分别点于10% TSA、TSA、NA、LB培养基中央，28°C培 养2-4d，观察形态。在NA培养基上，菌落由嫩黄色变为金黄色，最后变成棕褐色，表面平坦， 边缘光滑；在10% TSA上，菌落金黄色，菌体表面凹陷，边缘呈扩散状；在100% TSA上，菌落 金黄色，边缘不扩散；在LB上基本不生长。
[0028] 电镜观察：
[0029] (1)将OH21划线于NA培养基（菌龄不能过大），在菌落生长新鲜处，用少量灭菌 水，冲洗菌落，并轻轻晃动培养皿，使灭菌水在新鲜菌落周围反复冲洗，配制成菌悬液。
[0030] (2)在石蜡板上滴加1~2滴新鲜的PTA负染液。
[0031] (3)取新的铜网片吸附菌悬液，置于干净的滤纸上晾干。
[0032] (4)待铜网片上的菌悬液七八成干时，将铜网片吸附菌悬液的一面接触负染液，漂 浮染色15s (时间过长则染色颜色深）。
[0033] (5)从负染液中取出铜网片，用滤纸吸干多余的负染液，日光灯下烤45s，使其干 燥。
[0034] (6)将制作好的样品，放置于透射电镜日立H-650中，在80千伏下观察细胞形态。
[0035] OH21呈现杆状，无鞭毛。
[0036] 1. 4. 2 16S rDNA 鉴定
[0037] 利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取OH21的DNA，作为16S rDNA扩 增的模板。应用Primer5. 0软件设计引物，上游引物16S-F :AGAGITTGATCATGGCTCAG，下 游引物16S-R :ACGGTTACCTTGTTACGACTT，引物序列由英潍捷基（上海）贸易有限公司合 成，扩增条带约 1500bp。PCR 反应体系（25yl) :10Xbuffer2.5yL;Mg2+(25mM)2yL; dNTP (1. 25mM) 2 y L ;正向引物（20pmol/ y L) 0? 5 y L ;反向引物（20pmol/ y L) 0? 5 y L ; 1'四118-了39聚合酶0.31^出0嫩（10叩/1^)0.51^;(1(111 2016.711匕？0?反应条件：95。预 变性5min，94°变性30s、55。退火30s、72。延伸lmin 30s、30个循环，72°后延伸8min。 PCR反应产物经1%琼脂糖凝聚电泳检测，与DL2000marker比较，片段大小正确，为目的片 段，见图4。
[0038] 含有目的片段的PCR产物利用AXYGEN PCR clean up试剂盒进行纯化回收，将纯 化产物送往英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，所得序列长度为1463bp。
[0039] 将所得序列与NCBI核酸数据库进行同源性比对分析，结果显示，与该菌株16S rDNA序列相近的菌株多为已知的Lysobacter brunescens菌株，基本无其他种属菌株，表 明该种属序列较为特殊，很少有其他种属菌株与之相似。在这些Lysobacter brunescens 菌株中，Lysobacter brunescens KCTC 12130菌株与菌株0H21的16S rDNA序列相似性高 达99%。挑选部分相似性高的菌株与0H21菌株进行系统发育分析，用MEGA软件中的邻接 法（Neighbor-Joining)构建系统发育树，见图5,由图可知0H21与Lysobacter brunescens 遗传距离最近，根据同源性比对和系统发育分析结果表明，0H21为变棕溶杆菌。
[0040] 0H21 16S rDNA 序列，长度为 1463bp :
[0041]
[0042]
【主权项】
1. 一株对植物病原黄单胞菌具有特异性拮抗活性的生防细菌菌株，其特征在于该细菌 是变棕溶杆菌，保藏登记号为：CGMCC No. 8650,命名为Lysobacter brunescens 0H21〇
2. 权利要求1所述的细菌的应用，其特征在于对测试的野油菜黄单胞菌野油菜致病 变种（Xanthomonas campestris pv. campestris)、水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae)PX099A 菌株、水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)RS 105菌株、水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae)KACC菌株、地毯草黄单胞菌 大豆致病变种（Xanthomonas axonopodis pv. glycines)等植物黄单胞菌具有较强的措抗 活性，而对测试的丁香假单胞菌大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv.glycinea);嗜 酸菌西瓜亚种（Acidovoraxcitrulli) ;丁香假单胞杆菌黄瓜角斑致病变种（Pseudomonas syringae pv. lachrymans);梨火疫病菌（Erwinia amylovora);大肠杆菌（E. coli)没有措 抗活性。
【专利摘要】本发明涉及一株对植物病原黄单胞菌具有特异性拮抗活性的生防细菌菌株OH21。该菌株的特征在于：所述菌株为变棕溶杆菌(Lysobacter brunescens)，属于黄单胞科(Xanthomonadaceae)、溶杆菌属(Lysobacter)，CGMCC No.8650。菌落形态：在不同培养基上呈现不同形态，在NA培养基上，菌落由嫩黄色变为金黄色，最后变成棕褐色，表面平坦，边缘光滑；在10％TSA上，菌落金黄色，菌体表面凹陷，边缘呈扩散状；在100％TSA上，菌落金黄色，边缘不扩散；在LB上基本不生长。生理特征：革兰氏阴性，杆状，无鞭毛；最适生长温度：28℃。该菌株对植物病原黄单胞菌具有特异性拮抗活性。
【IPC分类】A01P1-00, C12N1-20, C12R1-01
【公开号】CN104651265
【申请号】CN201410814500
【发明人】刘凤权, 钱国良, 胡逸群
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2014年12月22日