专利名称：鉴别和富集细胞特异性靶结构的方法
技术领域：
本发明涉及鉴别和富集细胞特异性靶结构的方法，特别是鉴别细胞表面的细胞特异性蛋白组合模式和富集这种细胞的方法。
鉴别细胞特异性靶结构对于验证可能导致生物体内无法估计的作用的细胞—细胞相互作用是关键的。特别地，了解疾病特异性靶结构是开发有效的同时副作用很小的药物的决定性必要条件。
现有技术已知免疫细胞(淋巴细胞)表达特异组合的蛋白质，也称为蛋白质组合模式，简称PCP，其负责结合脑和肌肉组织中的血管的内皮样细胞。其他蛋白质组合却不导致与这种内皮样细胞的结合。令人惊奇地，这些特异的组合是个体间一致的，总是显示相同的结合功能。其结果是，所述特异性蛋白质组合模式似乎是细胞表面的个体间一致的淋巴细胞结合密码，用于结合存在细胞特异性靶结构的器官特异性内皮样细胞表面。细胞特异性靶结构因此可显示相当特异的蛋白质组合模式。
浸润性肿瘤细胞表面也显示特异性蛋白质组合模式，其将导致目的明确的即器官选择性浸润行为。为此，这种蛋白质组合模式组成了可能的药物的靶结构。
然而，开发这种高选择性药物的—不可避免的必要条件是这种靶结构的分子组成的知识。
现有技术中公开了鉴别靶结构的方法，其是基于分析疾病组织或细胞的基因表达模式，与健康组织或细胞的基因表达模式相比较，蛋白质表达模式和信使核糖核酸(mRNA)均意在提供新蛋白质的表观、疾病组织或细胞中失控的或异常修饰的蛋白质的信息(例如F.Lottspeich/H.Zorbas；Bioanalytik；Spektrum Analytischer Verlag；Heidelberg，1998)。
但是，这些方法均使用细胞匀浆物，其通常基于几千个或几百万个细胞，因为仅能通过这样大量的细胞才能产生上述的表达模式。在细胞匀浆物中，细胞以破碎的开放形式存在，从而可通过生物化学方法进行抽提和分离。
这些现有技术方法不适合鉴别蛋白质组合模式，因为这种蛋白质组合模式中的各个蛋白质组分由于产生细胞匀浆物和随后的抽提步骤而完全分离，由此丧失了其细胞和组织拓扑学位置的相关信息。另外，破坏细胞区室使得不能获得这些细胞区室内的蛋白质组合及其相关拓扑学相互关系的信息。
现有技术方法的另一缺点是制备组织或细胞的步骤从它们的取出或收集直至分离蛋白质的步骤可能受到各种可变的外部影响，不能控制和标准化。
另外，现有技术方法另一缺点是它们不能在一个细胞水平进行分析，从而不能指出各个细胞的不同方式的蛋白质组合模式。再者，仅以少量存在的蛋白质不能由现有技术方法检测。这在例如仅存在于少数致病性疾病特异性细胞中的蛋白质或特异性蛋白质组合的情况下尤其如此。
因此，本发明的目的在于提供能够鉴别和富集细胞特异性组合模式的方法，其克服了上述现有技术中的缺点。
本发明目的通过鉴别和富集细胞特异性靶结构、特别是鉴别细胞表面上的细胞特异性蛋白质组合模式以及富集这些细胞的创造性方法而实现，该方法具有权利要求1的特征。
本发明方法的优选实施方案在从属权利要求中描述。
本发明的用于鉴别和富集细胞特异性靶结构、特别是鉴别细胞表面上的细胞特异性蛋白质组合模式以及富集这些细胞的方法包括如下步骤(a)将不均一细胞混合物沉积在具有预定结构的—或多个表面上，使具有相应靶结构的细胞与这种表面结合；(b)从所述表面除去所述细胞混合物中任何未结合的细胞；(c)鉴别负责细胞与所述表面结合的细胞特异性靶结构；(d)在所述表面上选择并富集具有相同细胞特异性靶结构的细胞；以及(e)生物化学鉴定步骤(d)中选择的靶结构。这一方法使得可以鉴别那些负责与预定结构结合的细胞特异性靶结构，特别是细胞表面的蛋白质组合。另外，可以富集这些细胞特异性靶结构如均匀细胞表面，从而随后使之进行生物化学分析方法分析。这例如也可使得仅以少量存在的蛋白质得以富集和分析。这在例如仅存在于少数致病性疾病特异性细胞中的蛋白质或特异性蛋白质组合的情况下尤其如此。因此，以这种方式，可以提供高度选择性结合的一种相同功能类型的细胞，以进一步分析由它们表达的蛋白质。有利地，所选择和富集的靶结构在步骤(e)中经分子或分子复合物分离方法如蛋白质分离方法，特别是2D凝胶电泳而生物化学鉴定。
进行本发明的步骤(a)至(b)的一个实施方案包括下述部分方法1)将液体不均一细胞混合物导入或施加入分析装置的管道中和具有含预定结构的固定表面的样品玻片上；2)经所述管道的缝隙除去任何未结合的细胞并将所述物质收集在一容器中；3)经样品玻片温度调节装置冷却样品玻片，和4)固定结合在所述样品玻片上的细胞。
在本发明方法的一个有利的实施方案中，不均一细胞混合物分离自人或动物组织或者人或动物体液，或者其由培养的细胞组成，所述的表面是人或动物组织切片和/或内皮样细胞和/或蛋白质晶片和/或一片培养的人或动物组织。这能够保证细胞特异性靶结构的快速而有目的的鉴别，以用于开发药物。
在本发明方法的另一个有利的实施方案中，细胞特异性靶结构通过包括如下步骤的方法鉴别(I)将包括至少一种标记分子的试剂溶液Y1自动沉积在所述细胞特异性靶结构上；(II)使试剂溶液Y1反应，并自动检测用试剂溶液Y1标记的靶结构的至少一种标记模式；(III)在检测该标记模式之前或之后除去所述试剂溶液Y1，并用其他试剂溶液Yn(n＝2，3，...，N)重复步骤(I)和(II)，每种试剂溶液均含有所述的至少一种标记分子和/或至少另一种标记分子；以及(IV)组合步骤(II)中检测的标记模式以得到细胞特异性靶结构的复合分子组合模式。这一鉴别方法使得能够快速而有目的的鉴别细胞特异性靶结构如细胞表面上的蛋白质组合模式。
在本发明的另一个有利的实施方案中，在步骤(d)后进行如下步骤(d1)针对步骤(d)中选择的细胞特异性靶结构的一或多个成分进行抑制实验，以检测所述成分的结合层次，所述成分是细胞特异性蛋白质组合模式的单一或多个蛋白质。这使得能够确定蛋白质层次中的哪些蛋白质对于这种选择性结合是特别相关的，而哪些蛋白质不是特别相关的。相关的蛋白质组成了开发高选择性药物的靶。
在本发明的另一个有利的实施方案中，以下述步骤替换步骤(e)(f)将包括至少一种标记分子的试剂溶液Y1自动沉积在所述的所选择和富集的细胞特异性靶结构上；(g)使试剂溶液Y1反应，并自动检测用试剂溶液Y1标记的靶结构的至少一种标记模式；(h)在检测该标记模式之前或之后除去所述试剂溶液Y1，并用其他试剂溶液Yn(n＝2，3，...，N)重复步骤(f)和(g)，每种试剂溶液均含有所述的至少一种标记分子和/或至少另一种标记分子；以及(i)组合步骤(g)中检测的标记模式以得到所选择和富集的细胞特异性靶结构的复合分子组合模式。已根据本发明富集和选择的相同类型的细胞随后使得能更详细地检查由步骤(f)至(i)制备的细胞特异性靶结构。
总之，本发明方法使得能通过生物学选择性机制鉴别靶结构以有效地发现相关活性靶结构，用以开发药物。
权利要求
1.一种用于鉴别和富集细胞特异性靶结构、特别是鉴别细胞表面上的细胞特异性蛋白质组合模式并富集这些细胞的方法，其中所述方法包括如下步骤(a)将不均一细胞混合物沉积在具有预定结构的一或多个表面上，使具有相应靶结构的细胞与这种表面结合；(b)从所述表面除去所述细胞混合物中任何未结合的细胞；(c)鉴别负责细胞与所述表面结合的细胞特异性靶结构；(d)在所述表面上选择并富集具有相同细胞特异性靶结构的细胞；以及(e)经生物化学鉴定步骤(d)中选择的靶结构。
2.权利要求1的方法，其中所述不均一细胞混合物分离自人或动物组织或者人或动物体液，或者其由培养的细胞组成。
3.前述任一项权利要求的方法，其中所述的表面是人或动物组织切片和/或内皮样细胞和/或蛋白质晶片和/或一片培养的人或动物组织。
4.前述任一项权利要求的方法，其中细胞特异性靶结构通过包括如下步骤的方法鉴别(I)将包括至少一种标记分子的试剂溶液Y1自动沉积在所述细胞特异性靶结构上；(II)使试剂溶液Y1反应，并自动检测用试剂溶液Y1标记的靶结构的至少一种标记模式；(III)在检测该标记模式之前或之后除去所述试剂溶液Y1，并用其他试剂溶液Yn(n＝2，3，...，N)重复步骤(I)和(II)，每种试剂溶液均含有所述的至少一种标记分子和/或至少另一种标记分子；以及(IV)组合步骤(II)中检测的标记模式以得到细胞特异性靶结构的复合分子组合模式。
5.前述任一项权利要求的方法，其中在步骤e)中所选择的靶结构经分子或分子复合物分离方法特别是蛋白质分离方法而生物化学鉴定。
6.权利要求5的方法，其中所述的蛋白质分离方法是2D凝胶电泳。
7.前述任一项权利要求的方法，其中在步骤(d)后进行如下步骤(d1)针对步骤(d)中选择的细胞特异性靶结构的一或多个成分进行抑制实验，以检测所述成分的结合层次。
8.权利要求7的方法，其中所述成分是细胞特异性蛋白质组合模式的单一或多个蛋白质。
9.权利要求1的方法，其中进行以下述步骤替换步骤(e)(f)将包括至少一种标记分子的试剂溶液Y1自动沉积在所述的所选择和富集的细胞特异性靶结构上；(g)使试剂溶液Y1反应，并自动检测用试剂溶液Y1标记的靶结构的至少一种标记模式；(h)在检测该标记模式之前或之后除去所述试剂溶液Y1，并用其他试剂溶液Yn(n＝2，3，...，N)重复步骤(f)和(g)，每种试剂溶液均含有所述的至少一种标记分子和/或至少另一种标记分子；以及(i)组合步骤(g)中检测的标记模式以得到所选择和富集的细胞特异性靶结构的复合分子组合模式。
全文摘要
一种用于鉴别和富集细胞特异性靶结构、特别是鉴别细胞表面上的细胞特异性蛋白质组合模式并富集这些细胞的方法,其中所述方法包括如下步骤:(a)将不均一细胞混合物沉积在具有预定结构的一或多个表面上,使具有相应靶结构的细胞与这种表面结合;(b)从所述表面除去所述细胞混合物中任何未结合的细胞;(c)鉴别负责细胞与所述表面结合的细胞特异性靶结构;(d)在所述表面上选择并富集具有相同细胞特异性靶结构的细胞;以及(e)经生物化学鉴定步骤(d)中选择的靶结构。
文档编号G01N33/68GK1332375SQ0110972
公开日2002年1月23日 申请日期2001年3月23日 优先权日2000年3月24日
发明者瓦尔特·舒伯特 申请人:瓦尔特·舒伯特