特异性结合lmp2a胞外区第二位及第五位串联表位融合蛋白的单克隆抗体及应用
【专利说明】特异性结合LMP2A胞外区第二位及第五位串联表位融合蛋白的单克隆抗体及应用
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及生物医学和免疫靶向诊疗领域，具体涉及抗EBV潜伏膜蛋白LMP2A单克隆抗体的制备方法及其应用。
[0003]
【背景技术】
[0004]鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发生于鼻咽腔或者上咽喉部，发病率高，好发于中国华南地区。16?25岁前后与45?54岁是鼻咽癌好发的两个年龄段，发病对象主要为中青年。其发病原因与EBV感染密切相关，鼻咽癌病理检查多为低分化型鳞癌，目前治疗方案首选放疗、化疗，但是治疗后五年生存率约为50%?60%，易复发和转移，尤其复发后病人对放化疗的敏感性大大降低。因此分子靶向治疗为鼻咽癌的治疗提供了更好的思路与方案。
[0005]EB病毒(Epstein-Barr virus, H5V)属人类γ疱疫病毒，在全球广泛分布，约95%以上的成人所携带，呈潜伏感染状态，与鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤等多种肿瘤的发生、发展相关。在EBV潜伏感染的细胞中，表达十多种EBV基因产物，包括EBV核抗原(EB nuclearantigen，EBNA) 1、2、3A、3B、3C 和 LP，潜伏膜蛋白(latent membrane protein，LMP) I 和 2A、2B，EBV编码的小RNA(EBER) I和2以及的转录产物。近年许多关于LMP2A的研究报道指出，EBV潜伏感染的B细胞中均有LMP2A的表达，鼻咽癌和其他EBV相关恶性肿瘤中可持续检测到LMP2A的转录表达产物(mRNA)，LMP2A可在没有BCR提供信号的情况下促进B细胞的增殖和存活，并且LMP2A是鼻咽癌、淋巴瘤等肿瘤细胞稳定表达的EBV保守抗原，在维持病毒的潜伏感染状态和细胞转化过程中发挥重要作用，并参与调节跨膜信号的转导。目前认为LMP2A是鼻咽癌等EBV相关恶性肿瘤免疫治疗的理想靶抗原。
[0006]由于迄今为止，对容易发生转移的鼻咽癌没有找到一种行之有效的治疗方案，尽管多数患者采用放化疗等综合治疗后病情有所好转，但是5年后生存率仍然很不理想，并且极易复发与转移，尤其是复发后的病人对放化疗的敏感性大大降低。然而，鼻咽癌与其他头颈肿瘤最显著的区别在于与EBV高度相关，高转移性。几乎所有的鼻咽癌患者以及癌细胞都携带LMP2A mRNA, 50%以上的鼻咽癌肿瘤组织切片中检测到LMP2A蛋白的表达。
[0007]
【发明内容】
[0008]解决的技术问题:本发明提供一种特异性结合LMP2A胞外区第二位及第五位串联表位融合蛋白的单克隆抗体及应用，是一种能够特异性识别LMP2A抗原的鼠源性单克隆抗体，该抗体对LMP2A蛋白的选择性强。
[0009]技术方案:一种特异性结合LMP2A胞外区第二位及第五位串联表位融合蛋白的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC N0:C201504的杂交瘤细胞株产生，保藏日期为2015年I月29日，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学。
[0010]一种抗LMP2A杂交瘤细胞株5C12C4A6，其保藏编号为CCTCC NO: C201504，保藏日期为2015年I月29日，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学。
[0011]所述的单克隆抗体在制备用于检测LMP2A胞外区第二位及第五位串联表位融合蛋白的免疫检测工具中的应用。
[0012]所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
[0013]所述的单克隆抗体在制备用于诊断LMP2A胞外区第二位及第五位串联表位融合蛋白相关性肿瘤的病理诊断试剂盒中的应用。
[0014]所述相关肿瘤为鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌或T细胞淋巴瘤。
[0015]一种免疫组化试剂盒，包括上述的单克隆抗体。
[0016]有益效果:本发明的检测方法是利用单克隆抗体专一性，特异性强，灵敏度高的特征，基于研究证实LMP2A在鼻咽癌的转移和复发中的重要作用的基础上。运用LMP2A胞外区第二位第五位表位串联融合蛋白免疫小鼠，制备出单克隆抗体，可以特异性靶向结合鼻咽癌中LMP2A蛋白，结合病理诊断，可以预测病人的病情发展及预后，更重要的是将LMP2A作为靶点，在鼻咽癌治疗方面起到重要作用。同时，基于LMP2A在其它EBV相关肿瘤中的作用，例如Hodgkin淋巴瘤、胃癌、T细胞淋巴瘤等，对此类EBV相关肿瘤的检测，诊断以及治疗发挥一定作用。利用单克隆抗体特异性中和LMP2A从而抑制了肿瘤细胞的增殖，逆转其诱导的EMT转变，抑制了肿瘤的转移；利用单克隆抗体介导的靶向特性，连接化疗药物以及放疗增敏剂，达到了靶向治疗的目的。
[0017]
【附图说明】
[0018]图1为纯化后的抗LMP2A单克隆抗体的SDS-PAGE分析结果。
[0019]图2为间接ELISA测定抗LMP2A单克隆抗体效价结果。
[0020]图3为抗LMP2A单克隆抗体Western blot免疫印迹结果。
[0021]图4为抗LMP2A单克隆抗体流式细胞术结果。
[0022]图5为抗LMP2A单克隆抗体细胞免疫荧光分析结果。
[0023]图6为抗LMP2A单克隆抗体免疫组化分析结果。A.鼻咽癌病例I ;B.鼻咽癌病例2;C.鼻咽癌病例3; D.无关抗体；E.SP2/0细胞腹水；F.PBS阴性对照
【具体实施方式】:
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0024]实施例1
抗LMP2A单克隆抗体的制备与鉴定:
1.抗原免疫抗原乳化:弗氏完全佐剂预先微加热，用注射器吸200 μ L移入I mL灭菌EP管，滴入200 μ L纯化后的LMP2A胞外区表位串联融合蛋白，边滴边摇至乳化完全，接种小鼠。初次免疫小鼠使用弗氏完全佐剂，之后免疫均使用弗氏不完全佐剂。其中佐剂和蛋白的量是1:1。
[0025]初次免疫:200 μ L LMP2A抗原(100 μ g)与等量福氏完全佐剂混合后，200 μ L/只颈背部皮下多点注射BALB/c小鼠并做好标记；
加强免疫:同剂量的抗原与福氏不完全佐剂混合，隔周免疫，免疫方法同上，加强两次；
末次免疫:融合前三天，眼眶取血，测定小鼠血清抗体效价，对效价高的小鼠进行再次加强免疫，取等量抗原不加佐剂腹腔加强免疫。
[0026]2.骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞的准备
骨髓瘤细胞:融合前两周复苏骨髓瘤细胞SP2/0，用20%FBS的PRM1-1640培养基培养细胞并即时传代，待骨髓瘤细胞处于对数生长期、形态良好时可进行细胞融合。
[0027]小鼠脾细胞:
I)末次免疫后三天的小鼠，对其眼眶取血，保留血清样本。
[0028]2)断颈处死小鼠，泡入75%酒精中待用。
[0029]3)事先准备好的高压灭菌的手术剪刀，在超净台内将小鼠固定，剪开小鼠腹膜，取出脾脏后放置于已加入1mL不完全培养基的平皿中，洗涤脾脏，并小心剥去周围结缔组织。
[0030]4)将洗涤后的脾脏置入另一个平皿中，加入1mL不完全培养基，用弯头镊子轻轻挤压脾脏，使得脾细胞溢出，将溢出的脾细胞溶液吸入离心管中。
[0031]5)再将脾脏置于铜网上，用注射器内柄挤压研磨脾细胞，并用不完全培养基冲洗铜网，制成单细胞悬液，与之前的脾细胞溶液合并转移至50 mL离心管中。
[0032]6)将细胞悬液离心，转速为1000 rpm离心5 min，弃去上清，1640培养基重悬洗涤后再次离心，转速为1000 rpm离心5 min。
[0033]7)脾细胞沉淀用10 mL培养基重悬，取脾细胞悬液，计数后备用。
[0034]
3.小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合
I)分别取I X 18个脾细胞与2X10 7个SP2/0细胞于两个离心管中，再将它们一起转入另一个50 mL离心管中混合，用1640培养基洗涤细胞，I 000 rpm离心5 min，重复两次，
上清尽量弃干净。
[0035]2)离心管底部轻轻击打手掌，使沉淀在离心管底部的细胞松散均匀。
[0036]3)取出事先放在37°C孵育箱中的PEG，用胶头吸管在60 s内向离心管中加入0.7mL PEG，注意边加边均匀转动离心管，动作轻柔。
[0037]4)置入37°C孵育箱中静置90 s后，取出，30 s内加入I mL 1640培养基，边加边轻轻摇晃；再加入3 mL培养基，边加边轻晃；再在5min内加入10 mL培养基，边加边轻轻转动离心管。
[0038]5)用培养基补至40 mL，静置5 min后，800 rpm 5 min，弃上清。用含20%新生牛血清以及I X HAT的选择培养基10 mL重悬沉淀，100 μ L /孔滴加入96孔板中，共铺10块板。置于37 °C，5% CO2细胞培养箱内培养。
[0039]6)每隔3至4天HAT培养基用量减半换液，培养10天以后改用HT培养基，2周后改用含20%新生牛血清的1640培养基培养。
[0040]7)每天观察杂交瘤细胞生长情况。
[0041]
4.阳性杂交瘤细胞的筛选
I)待克隆形成10~14天后对细胞上清进行整板间接ELISA检测，从而快速从大量ESLISA板中筛选阳性克隆。
[0042]2)PBS稀释LMP2A融合蛋白为I yg/mL包板，4 °C过夜，第二天甩去包被液，用PBST清洗ELISA板3次，切勿对准孔底冲洗；
3)新鲜配制5%脱脂奶粉，0.3mL/孔室温封闭2 h，甩去孔中封闭液，PBST清洗两遍；
4)加入待测细胞培养上清，阳性小鼠血清作为阳性对照，培养基作为阴性对照。37°C培养箱2 h ；
5)PBST 清洗 3 遍，3 min/ 遍；
6)加入HRP标记的山羊抗小鼠二抗(1:2000稀释)，37°C培养箱Ih;
7)PBST 清洗 6 遍，3 min/遍，加入 TMB-H2O2底物，室温显色 5-10 min, 0.2 mol/L H2SO4终止；
8)酶标仪450nm读数，保存数据。
[0043]9)取两次筛选均为阳性的杂交瘤细胞孔，继续克隆化培养。
[0044]
5.有限稀释法
I)将待亚克隆孔的杂交瘤细胞消化，收集在离心管中用胶头滴管制成细胞悬液，细胞计数，用含10%FBS的HT培养基梯度稀释至50个/mL和10个/mL，100 μ L /孔加入96孔板中，如此细胞数量平均约含5个/孔和I个/孔，补培养基10yL /孔，37 °C，5% CO2孵育箱中培养；复筛两次。
[0045]2)每天观察细胞生长情况，即时更换培养基。
[0046]3)选择呈单个克隆生长、形态良好的细胞继续克隆，至抗体分泌孔阳性率为100%。
[0047]4)扩大培养并即时冻存细胞株。
[0048]
6.单克隆抗体的制备与纯化制备单克隆抗体:
(I)杂交瘤细胞以I X 17个/mL (体积为2