为了靶向存在于免疫细胞和病理细胞两者上的抗原而工程化的免疫治疗细胞的制作方法

为了靶向存在于免疫细胞和病理细胞两者上的抗原而工程化的免疫治疗细胞的制作方法【专利摘要】开发用于免疫治疗的基因工程化免疫细胞的方法，通过在所述免疫细胞中由稀切核酸内切酶如TALEN、Cas9或argonaute失活编码病理细胞和所述免疫细胞(例如：CD38，CS1或CD70)二者共有的抗原标记的基因的事实，所述细胞能够具有靶向所述标记的嵌合抗原受体。【专利说明】为了靶向存在于免疫细胞和病理细胞两者上的抗原而工程化的免疫治疗细胞
技术领域：
[0001]本发明涉及开发基因工程化的，优选非同种异体反应性的(non-alloreactive)，用于免疫治疗的免疫细胞的方法，所述免疫细胞具有靶向病理细胞和免疫细胞（例如：CD38)共有的抗原标记的嵌合抗原受体。[0002]所述方法包括表达针对所述抗原标记的CAR和在所述免疫细胞中失活所述基因有助于所述抗原标记在所述免疫细胞的表面上的存在。这种失活通常通过使用编码RNA-引导的核酸内切酶(RNA-guidedendonuclease)(例如：Cas9/CRISPR)，兆碱基大范围核酸酶(meganuclease)，锌指核酸酶或TAL核酸酶的转基因而实施。所述工程化免疫细胞，优选T-细胞，将其免疫活性导向恶性的、感染的细胞或缺陷型免疫细胞，同时避免其相互破坏，自动刺激或聚集。本发明开辟了使用用于治疗癌症，感染和自身免疫疾病的免疫细胞的标准的和负担得起的过继性免疫治疗策略(adoptiveimmunotherapystrategy)的途径。【
背景技术：
】[0003]过继免疫疗法(adoptiveimmunotherapy)(其涉及体外产生的自体抗原特异性免疫细胞的转移），是治疗病毒感染和癌症的有前途的策略。例如，过继免疫疗法使用的T-细胞能够通过抗原特异性T-细胞的扩增或通过基因工程化的T-细胞重新定向（redirection)产生（Park，Rosenbergetal.2011)〇[0004]T-细胞中的新特异性通过转基因的T-细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的遗传转移而成功产生(Jena，Dottietal.2010)<XAR是由在单个融合分子中与一个或多个信号结构域相关的革G向部分构成的合成受体。一般而言，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域构成，包括通过柔性连接子连接的单克隆抗体的所述轻片段和可变片段。基于受体或配体结构域的结合部分也已成功使用。第一代CAR的信号结构域源自所述CD3G或所述Fc受体y链的细胞质区域。第一代CAR已证明成功地重新定向了T-细胞细胞毒性，然而，它们没能提供体内延长的扩增和抗肿瘤活性。来自共刺激分子，包括CD28，0X-40(CD134)和4-1BB(CD137)的信号结构域已单独加入(第二代)或组合加入(第三代），以增强存活率和提高CAR修饰的T细胞的增殖。CAR已经成功地使T细胞针对表达于来自包括淋巴瘤和实体肿瘤的各种恶性肿瘤的肿瘤细胞表面上的抗原重新定向（Jena，Dottietal.2010)。[0005]使用过继免疫疗法治疗患者的目前方案是基于自体细胞转移。在这种方法中，T淋巴细胞从患者中回收，体外遗传修饰或选择，体外培养以在必要时扩增细胞数量，并最后输注到患者体内。除了淋巴细胞输注之外，所述宿主可以以支持所述T-细胞的植入或其在免疫响应中的参与的其它方式进行操纵，例如（用福射或化疗)预处理(pre-conditioning)和给药淋巴细胞生长因子(如IL-2)。每个患者接收单独制作的治疗，使用患者自身淋巴细胞(即自体疗法）。自体疗法对于实际应用面临大量技术性后勤障碍，它们后代需要昂贵的专用设备和专家人员，它们必须在患者的诊断之后很短的时间内产生，并且在许多情况下，所述患者的预治疗已经导致了退化的免疫功能，使所述患者的淋巴细胞可能功能不良并以非常低的数量存在。因为这些障碍，每个患者的自体细胞制备是有效地一种新产品，从而导致效能和安全性大幅变化。[0006]在理想情况下，人们希望使用标准化的疗法，其中异基因治疗细胞能够预先制作，详细表征，并能够立即给药于患者。异体基因（allogeneic)是指获自属于相同物种但遗传上相异的个体的细胞。然而，使用异基因细胞目前存在很多缺点。在免疫活性的宿主中异基因细胞迅速受到排斥，这是称为宿主抗移植排斥(HVG)的过程，而这显著限制了所述转移细胞的功效。在免疫无能宿主中，异基因细胞能够进行移植，但其内源性T-细胞受体(TCR)特异性可以将所述宿主组织识别为外来物，导致移植物抗宿主病(GVHD)，这可能会导致严重的组织损伤和死亡。[0007]为了提供异基因T-细胞，本发明人先前公开了基因工程化T-细胞的方法，其中不同的效应器基因，具体而言是编码T-细胞受体的那些，通过使用特异性TAL-核酸酶，以商标TALEN?(Cellectis，8，ruedelaCroixJarry，75013PARIS)更广为人知，进行失活。这种方法已经证明，在使用RAN转染作为容许异基因T-细胞规模生产的平台的部分时在原生细胞中是高度有效的(W02013/176915)。[0008]⑶38(分化簇38)，也称为环状ADP核糖水解酶，是多种免疫细胞（白血细胞)表面上发现的糖蛋白，具体而言是T-细胞，包括⑶4+，CD8+，B淋巴细胞和天然杀伤细胞。CD38在细胞黏附，信号转导和钙信号方面发挥作用。关于这种蛋白质的结构信息能够查阅文献P28907之下的UniProtKB/SWISS-PROT数据库。在人类中，所述CD38蛋白是由位于染色体组4上的CD38基因进行编码。CD38是催化环状ADP-核糖（cADPR)从NAD+至ADP-核糖的合成和水解的多官能胞外酶。这些反应产物被认为对于细胞内Ca2+的调节是必不可少的。此外，CD38功能的丧失与受损的免疫响应和代谢紊乱相关(MalavasiF.，etal.(2008)."EvolutionandfunctionoftheADPribosylcyclase/CD38genefamilyinphysiologyandpathology".Physiol.Rev.88(3):841_86)。[0009]在另一方面中，CD38蛋白质是HIV感染、白血病、骨髓瘤、实体瘤、II型糖尿病和骨代谢以及一些其他遗传决定病症的标记。具体而言，它在白血病中作为预后标记使用(Ibrahim,S.etal.(2001)CD38expressionasanimportantprognosticfactorinB-cellchroniclymphocyticleukemia.Blood98:181-186)〇[0010]虽然，表达⑶38以及表1中所指的许多其他肿瘤抗原标记，如⑶70和CS1的细胞，能够称为CAR有吸引力的靶，但这种抗原标记也表达于大多数T-细胞表面上的事实已经显著阻碍了这些标记用于实施免疫疗法的选择。[0011]本发明人在本文中提供了涉及表达还存在于T-细胞表面的特异性抗原标记的病理细胞例如像导致白血病的恶性⑶38阳性B-细胞、⑶70和CS1的免疫疗法的策略。【
发明内容】[0012]本发明公开的方法用于工程化旨在靶向病理细胞的T-细胞，而所述病理细胞会表达一种或多种也存在T-细胞表面上的抗原标记。这种抗原标记的例子可查阅表1。这种抗原标记的实例是CD38。其它例子有CD70和CS1。抗原标记是指其免疫活性片段的整个蛋白质。[0013]根据本发明，所述T-细胞进行工程化，以失活编码这种抗原标记的基因表达，或参与到这种抗原标记在所述细胞表面上的递呈。[0014]这种失活优选通过基因组修饰，更具体而言通过在能够靶向直接或间接参与所述抗原标记在所述T-细胞表面生成或递呈的基因位点的特异性稀切核酸内切酶的T-细胞内表达而进行实施。不同类型的稀切核酸内切酶都可以使用，如兆碱基大范围核酸酶，(meganuclease)TAL-核酸酶，锌指核酸酶（ZFN)，或RNA/DNA导向的核酸内切酶如Cas9/CRISPR或Argonaute。[0015]根据一个优选的实施方式，所述T-细胞赋予了至少一个容许携带所述受靶向的抗原标记的所述细胞的特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)。[0016]根据另一实施方式，所述T-细胞特别是通过删除参与自识别的基因，如，例如，编码T-细胞受体(TCR)或HLA复合物的组件的那些能够进一步进行工程化而使之变成异基因的。[0017]本发明涵盖了包含详细描述、实施例和附图中陈述的所述遗传修饰的分离的细胞或细胞系，以及用于工程化所述T-细胞的任何蛋白质，多肽或载体。[0018]由于本发明，所述工程化T-细胞能够用作治疗或预防癌症、感染或自身免疫疾病的方法中的治疗产品，理想地是作为"现货供应的"产品。[0019]根据本发明优选的免疫细胞是产生以下所述表型的那些：[0020]?[靶向表1的抗原标记的CAR]+[表1的抗原标记T[0021]如以下这些：[0022]?[CARCD38]+[CD38]-，还优选[TCR]阴性；[0023]?[CARCD70]+[CD70]-，还优选[TCR]阴性；[0024]?[CARCS1]+[CS1]-，还优选[TCR]阴性；[0025]其用作治疗产品，优选异基因的那些。【附图说明】[0026]附图和表的简述[0027]图1:根据本发明对CD38破坏并赋予了靶向携带所述抗原标记CD38的恶性细胞的嵌合抗原受体(表示为单链CAR)的工程化T细胞的示意性图示。[0028]图2:多亚单元的嵌合抗原受体的示意性图示。[0029]图3:根据本发明结合赋予多亚基的CAR的T-细胞并循环双特异性抗体的治疗策略的示意性图示。在此具体方面中，所述存在于多亚基CAR的胞外链上的受体由通过双特异性抗体识别的表位构成。所述双特异性抗体一方面旨在结合所述表位并在另一方面结合所述抗原标记而有助于所述T-细胞结合至所述病理细胞。[0030]图4:根据本发明结合赋予多亚基CAR的T-细胞并循环单克隆抗体的治疗策略的示意性图示。在此具体方面中，所述存在于多亚基CAR的胞外链上的受体，例如，由旨在结合针对所述抗原标记的单克隆抗体的Fc受体构成。所述单克隆抗体增加了T-细胞结合病理细胞的机会。[0031]图5:根据本发明结合赋予含有两个胞外细胞域结构的多亚基CAR的T-细胞并且一个循环双特异性抗体的治疗策略的示意性图示。在这个具体方面中，所述细胞外细胞结构域位于不同的亚基上。这些结构域分别由通过双特异性抗体识别的表位和靶向抗原的受体构成。所述受体针对第一抗原标记，而所述双特异性抗体旨在结合表位和第二抗原标记。该展示旨在选择性靶向其表面上携带第一和第二抗原标记的病理细胞。[0032]图6:展示类似于图5,但刺激和共刺激结构域(分别是4-1BB和⑶％蛋白结构域)已经发生交换以调节由所述嵌合抗原受体与所述病理细胞的结合所致的所述T-细胞的活化强度。[0033]图7:展示类似于图5,但刺激和共刺激结构域(分别是4-1BB和⑶％蛋白结构域)已经发生交换以及一个CD3G结构域已经加入以提高由所述嵌合抗原受体与所述病理细胞的结合所致的所述T-细胞的活化强度。[0034]图8:根据本发明结合赋予含有两个胞外细胞结构域的多亚基CAR的T-细胞并且一个循环单克隆抗体的治疗策略的示意性图示。在这个具体方面中，所述细胞外细胞结构域位于不同亚基上。这些结构域分别由靶向抗原标记的抗原结合结构域和旨在结合针对第二抗原标记的单克隆抗体的Fc受体构成。该展示旨在选择性靶向其表面上携带第一和第二抗原标记的病理细胞。[0035]图9:由活化的T-细胞的⑶38表达。A.在用⑶3/⑶28涂覆珠+IL2活化后第6天通过T-细胞的⑶38表达。B.在活化后的17天期间内通过T-细胞的⑶38表达的纵向分析。[0036]图10:CD38基因上的敲除(K0):A.经设计敲除T-细胞中Cd38的所述3种不同TALEN(T2，T4和T5)的CD38外显子1序列上的位置。B.在用TALENCD38exl_T2转染后T-细胞中的⑶38的表达。C.用于⑶38K0T-细胞的纯化的控制的⑶38染色。[0037]图11:CD38CAR:A.所设计的3个版本的CAR的图示。B.通过所述靶细胞系的⑶38表达水平。[0038]图12:所述CARCS1+和K0CS1T-细胞的工程化及其后续测试的定时实验；[0039]图13:具有用于CS1基因的K0的所述TAL重复的T01，T02和T03的构建体；[0040]图14:对于所述TALT01，T02和T03在所述CS1(SLAMF7)基因内的靶定位。T01和T02靶向所述外显子1(图14A)，而T03靶向所述外显子2(图14B)。[00411图15A:对于TALEn或非TALEn转染结合CAR+或未转导的细胞的靶细胞活力的百分比测量：当它们用CAR+T-细胞共培养时显示的CS1(+)细胞的细胞活力降低，而对CSl(-)细胞活力没有影响。[0042]图15B:使用流式细胞术数据计算的特异性细胞裂解(CS1+)百分率的测定。据显示，在T-细胞CAR转导之前用靶向所述CS1基因的TALEn转染时特异性细胞裂解要高2-倍。[0043]图16:来自细胞毒活性实验的FACS分析的结果，其表明转导效率在假(mock)转染的细胞中比已经用靶向所述CS1基因的TALEn转染的细胞中更高(NTD:未转导）。[0044]图17:当所述不同的样品在转导后在D11处用CD3/CD28珠粒重新活化时来自FACS分析的结果，显示了每个样品中的所述转导效率和CD8/CS1表达水平。一旦重新活化后在假转染的细胞中观察到CS1水平增加，而少量细胞能够在所述TALEn转染的群中表达CS1。[0045]表1:用于T-细胞电穿孔的不同细胞脉冲(cytopulse)程序。[0046]表2:在T-细胞中使用Cas9的用于所述引导RNA的合适靶序列。[0047]表3:编码免疫检查点蛋白的基因列表。[0048]表4:据发现表达于T-细胞表面上，同时是不同肿瘤类型的特征的分化簇(clusterofdifferentiation)(CD)抗原标记。[0049]表5~13:表达在T-细胞中，同时过表达于来自不同癌症类型的实体肿瘤细胞中的主表面抗原标记。所列出的抗原标记按照实施例1中的阐述进行识别。[0050]表5:结肠肿瘤细胞；[0051]表6:乳腺肿瘤细胞；[0052]表7:消化道肿瘤细胞；[0053]表8:肾肿瘤细胞；[0054]表9:肝肿瘤细胞；[0055]表10:肺肿瘤细胞；[0056]表11:卵巢肿瘤细胞；[0057]表12:胰腺肿瘤细胞；[0058]表13:前列腺肿瘤细胞；[0059]表14:表达于T-细胞中，同时过表达于来自各类癌症（ALL，AML，CML，MDS，CLL，CTRL)的液体肿瘤细胞中的主表面抗原标记。所列出的抗原标记按照实施例1的阐述进行识别。[0060]表15:用于失活所述⑶38抗原的所测试的⑶38靶和TALEN的序列；[00611表16:两个其他CD38靶和用于其失活的相应TALEN的序列；[0062]表17:所述scFv抗-CD38抗体daratumumab和M0R202的VH和VL链和对于VH和VL链的特异性CDR的序列；[0063]表18:scFvdaratumumab-类抗-CD38CAR的3种不同结构和所用的各个组件的多肽序列；[0064]表19:所述scFv抗CS1抗体的VH和VL链的序列；[0065]表20:基于图11A中的所述V1，V2和V3版本的抗CS1CAR的多肽序列；[0066]表21:所述CS1靶和用于其失活的TALEN的序列；[0067]表22:所述CD70靶和用于其失活的TALEN的序列；[0068]表23:所述scFv抗CD70AB4，AB8和1F6抗体的VH和VL链的多核苷酸和核酸序列；[0069]表24:基于图11A中的所述VI，V2和V3版本的抗⑶70CAR的多肽序列。【具体实施方式】[0070]除非在本文中明确定义，所使用的所有技术和科学术语具有基因疗法，生物化学，遗传学和分子生物学领域的技术人员通常理解的相同含义。[0071]类似或等效于本文所述的所有方法和材料能够在本发明的实践或测试中与本文中描述的合适方法和材料一起使用。本文提及的所有出版物，专利申请，专利和其他参考文献以其全部内容结合于本文中作为参考。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义，为准。而且，除非另有规定，所述材料、方法和实施例仅是举例说明性的，而并非旨在进行限制。[0072]除非另外指出，本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中都进行了充分解释。参见，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology(FrederickM.AUSUBEL,2000,WileyandsonInc,LibraryofCongress，USA);MolecularCloning:ALaboratoryManual,ThirdEdition,(Sambrooketal，2001，ColdSpringHarbor,NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress)；01igonucleotideSynthesis(M.J.Gaited.,1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4,683,195；NucleicAcidHybridization(B.D.Harries&S.J.Higginseds.1984)；TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney,AlanR.Liss，Inc?，1987);ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress，1986);B?Perbal，APracticalGuideToMolecularCloning(1984);丛书，MethodsInENZYMOLOGY(J.AbeIsonandM.Simon，eds?-in-chief，AcademicPress，Inc?，NewYork)，尤其是，第154和155卷（Wuetal.eds.)和第185卷，"GeneExpressionTechnology"(D.Goeddel，ed.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.MillerandM.P.Caloseds.,1987,ColdSpringHarborLaboratory)；ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(MayerandWalker,eds.,AcademicPress，London，1987);HandbookOfExperimentalImmunology,VolumesI-IV(D.M.ffeirandC?C?Blackwel1，eds?，1986);和ManipulatingtheMouseEmbryo,(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,N.Y.,1986)〇[0073]在总的方面中，本发明涉及治疗与病理细胞的发育相关的疾病，如癌症、感染和自身免疫疾病的新过继免疫疗法策略的方法。[0074]作为本发明的一个主要目的是靶向与T-细胞一样携带特异性抗原标记的病理细胞的可能性。病理细胞是指认为会导致健康状况恶化的患者中存在的任何类型的细胞。[0075]一般而言，病理细胞是需要降低或消除而获得患者豁免(remission)的恶性或感染的细胞。[0076]在第一实施方式中，本发明的所述方法涉及制备用于免疫疗法的合适免疫细胞，优选T-细胞的方法，包括以下步骤：[0077](a)在免疫细胞中遗传失活或突变基因，其参与抗原标记的表达或递呈，所述抗原标记已知存在于所述T细胞表面上以及所述病理细胞的表面上；[0078](b)将编码针对存在于所述病理细胞表面上的所述抗原标记的嵌合抗原受体的转基因表达至所述免疫细胞中。[0079]根据本发明的免疫细胞被赋予了针对通常通过病理细胞和免疫细胞表达，或已知存在于所述T-细胞表面上的抗原标记的嵌合抗原受体。所述短语"已知存在"是指所述抗原标记据报道已经发现于体内自然条件下生长的所述免疫细胞表面上，特别是在血液中，但在它们体外培养时不是必须的。在任何情况下，本发明所述方法会导致所述免疫细胞表面上的抗原标记缺失，从而防止所述嵌合抗原受体与所述工程化T-细胞表面发生反应。在这方面中，所述方法可以包括通过排除将所述标记抗原递呈于其表面上的所述细胞而纯化所得的T-细胞的进一步的步骤。[0080]如表4中所示，本发明涉及据报道由肿瘤细胞表达，而且也由T-细胞表达的一定数量的抗原标记候选物。他们中的一些，如⑶38,已经在诊断方法中，特别是关于白血病病理细胞，已经用作特异性标记持续一段时间，但还没有用于治疗中。事实上，虽然这些标记在本
技术领域：
内识别为非常特异性的标记，但是因为针对这些标记的抗体将会摧毁或干扰患者的T-细胞它们不能用作免疫疗法的靶。本发明人已证实，CS1和CD70也存在于T-细胞的表面上，并且在这种T-细胞中表达靶向CS1和CD70的CAR会导致其耗尽(depletion)(见实施例2)〇[0081]根据本发明的一个优选的实施方式，上述方法的步骤a)的基因突变或失活使用稀切核酸内切酶进行实施。[0082]失活基因是指所感兴趣的基因不会以功能性蛋白质的形式表达。在具体的实施方式中，所述方法的遗传修饰依赖于稀切核酸内切酶在所提供进行工程化的细胞中的表达，如此而使之同样催化一个靶向基因中的裂解从而失活所述靶向的基因。由所述核酸内切酶所致的所述核酸链断裂通常通过同源重组或非同源端接(non-homologousendjoining)(NHEJ)的不同机制进行修复。然而，NHEJ是一个不完美的修复过程，往往会导致所述切割位点的DNA序列发生变化。这些机制会涉及重新连接保留两个DNA端的事物(通过直接再连接(CritchlowandJackson1998)或经由所谓微同源性介导的端连接（（Betts，Brenchleyetal.2003;Ma，Kimetal.2003))。通过非同源端连接(NHEJ)的修复通常会导致小插入或缺失并能够用于特异性基因敲除的产生。所述修饰可以是取代，缺失，或添加至少一个核苷酸。切割诱导的突变形成事件，即，NHEJ事件之后的突变形成事件发生的细胞，能够通过本领域中公知的方法识别和/或选择。[0083]所述术语"稀切核酸内切酶(rare-cuttingendonuclease)"是指能够催化DNA或RNA分子，优选DNA分子内核酸之间的键的水解(切割）的野生型或变体酶。具体而言，所述核酸酶能够是识别长度范围为10~45个碱基对(bp)，通常长度范围为10~35个碱基对，更通常12~20个碱基对的核酸靶位点的核酸内切酶，更优选高度特异性的稀切核酸内切酶。根据本发明的所述核酸内切酶在特异性的多核苷酸序列，进一步称为"靶序列"处识别并在这些靶序列内切割核酸或进入与其相邻的序列中，这取决于所述核酸内切酶的分子结构。所述稀切核酸内切酶能够在特异性核苷酸序列处识别并产生单或双链断裂。[0084]在具体的实施方式中，根据本发明的所述稀切核酸内切酶是RNA-引导的核酸内切酶如所述Cas9/CRISPR复合物。RNA引导的核酸内切酶构成核酸内切酶与RNA分子关联时新一代基因工程化工具。在这个系统中，所述RNA分子的核苷酸序列决定靶特异性并活化所述核酸内切酶（（Gasiunas，Barrangouetal.2012;Jinek，Chylinskietal.2012;Cong，Ranetal.2013；Mali,Yangetal.2013)〇[0085]Cas9[0086]Cas9,也称为Csnl(C0G3513)，是参与crRNA生物生成和入侵DNA的破坏的巨型蛋白质。Cas9已经在不同的细菌物种如嗜热链球菌、无害利斯特氏菌（（Gasiunas，Barrangouetal.2012;Jinek，Chylinskietal.2012)和化胺性链球菌（（Deltcheva，Chylinskietal.2011)中已经进行了描述。所述巨型Cas9蛋白（>1200个氨基酸)含有两个预测的核酸酶结构域，即位于所述蛋白质中部的HNH(McrA-样）核酸酶结构域和分裂的RuvC样核酸酶域(尺熟88611折叠）（]\&1^1'〇￥&，61'1811；[116七&1.(2006))。[0087]"Cas9"是指能够处理靶核酸序列的工程化核酸内切酶或Cas9的同源物。在具体实施方式中，Cas9能够诱导所述核酸靶序列中（其可能对应于双链断裂或单链断裂）的切割。Cas9变体能够是不天然存在于自然界中并且由蛋白质工程或通过随机诱变获得的Cas9核酸内切酶。根据本发明Cas9变体，例如，能够通过突变，即化脓性链球菌Cas9核酸内切酶(C0G3513)的所述氨基酸序列中至少一个残基的缺失，或插入或取代而获得。在本发明的框架方面中，这种Cas9变种保留了功能，即，它们保留了处理靶核酸序列的能力。Cas9变种也能够同源于能够包含化脓性链球菌Cas9的所述氨基酸序列中至少一个残基的缺失，或插入或取代的化脓性链球菌Cas9。缺失、插入和取代的任何组合也可以制成而获得所述最终的构建体，条件是所述最终构建体具有所需的活性，具体而言是结合导向RNA或核酸靶序列的能力。[0088]RuvC/RNaseH基序包括显示广谱核酸水解功能，对RNA和DNA(RNaseH，RuvC，DNA转座酶和逆转录病毒整合酶和Argonaut蛋白的PIWI结构域)都能作用的蛋白。在本发明中所述Cas9蛋白的RuvC催化结构域能够通过序列基序:D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A进行表征，其中X代表天然20个氨基酸中的任一种，而[I/L]表示异亮氨酸或亮氨酸。在其它方面，本发明涉及的Cas9变体至少包括D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A序列，其中)(代表天然20个氨基酸中的任一种，而[I/L]代表异亮氨酸或亮氨酸。[0089]HNH基序是对包括大肠杆菌素、限制酶和归巢核酸内切酶的双链DNA作用的许多核酸酶的特性。所述结构域HNH(SMARTID:SM00507，SC0P命名:HNH家族)与一定范围的DNA结合蛋白有关，履行各种结合和切割功能。具有已知功能的那些参与一定范围内的细胞过程，包括细菌毒性，组I和II内含子和内含肽（intein)中的归巢功能，重组，发育控制的DNA重排，菌体包装和限制性核酸内切酶活性(Dalgaard，Klaretal.1997)。这些蛋白质发现于病毒、古细菌、真细菌和真核生物中。有趣的是，关于LAGLI-DADG和GIY-YIG基序，所述HNH基序往往与自我繁殖要素比如内含肽，组I和11内含子的核酸内切酶结构域相关(Dalgaard，Klaretal?1997)。所述HNH结构域能够通过由侧翼为保守His(氨基端)和在一定距离的His/Asp/Glu(羧基端)残基的保守Asp/His残基的存在进行表征。相当数量的这些蛋白质也能够在中央Asp/His残基的任一侧上具有CX2C基序。在结构上，所述HNH基序作为由^^累旋在每一侧上侧接的扭曲0链的中央发夹出现(1(163111：11〇118，1(111111]^11116七31.1999)。Cas9的巨型HNH结构域由SEQID勵.5表示。在本发明中，所述圆11基序能够通过所述序列基序:Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S表征，其中)(代表所述天然20个氨基酸中的任一种。本发明涉及至少包含Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S序列的Cas9变体，其中)(代表所述天然20种氨基酸中的任一种。[0090]本发明可能特别有意思的是通过向所述Cas9细胞引入所述导向RNA确实容易进行靶向的多重基因修饰和产生可诱导的核酸酶系统。为了本发明的目的，本发明人已经证实，Cas9蛋白能够分成两个单独的分裂Cas9RuvC和HNH±或，其能够与所述导向RNA-起或单独处理靶核酸序列。[0091]而且来自不同RNA导向的核酸内切酶或Cas同源物的所述RuvC和HNH结构域可以组装以改进核酸酶效率或特异性。来自不同物种的结构域能够分裂成两个蛋白质或相互融合以形成变体Cas蛋白。所述Cas9分裂系统被认为特别适合于基因组靶向的可诱导方法并避免所述细胞内的Cas9过表达的潜在毒性作用。事实上，第一分裂Cas9结构域能够优选通过用编码所述分裂结构域的转基因稳定转化所述细胞而引入到所述细胞中。然后，所述Cas9的互补分裂部分能够引入到所述细胞中，使所述两个分裂部分重新组装至所述细胞中以在所需时间点重构官能性的Cas9蛋白质。[0092]所述分裂Cas9尺寸相对于野生型Cas9的降低使载体化和向所述细胞的递送，例如，通过使用细胞穿透肽而变得容易。来自不同Cas蛋白的重排结构域，允许，例如，通过与化脓性链球菌Cas9略有不同的靶向PAM基序调节特异性和核酸酶的活性。[0093]分裂Cas9系统[0094]所述RuvC和HNH结构域的先前表征已促使本发明人工程化Cas9蛋白以产生分裂Cas9蛋白质。令人惊讶地，本发明人证实，这两个分裂Cas9能够一起或或单独处理所述核酸靶。这一观察结果允许使用分裂Cas9蛋白开发新的Cas9系统。每个分裂Cas9结构域能够单独地制备和使用。因此，这种分裂系统对于所述RNA导向的核酸内切酶在T-细胞中的载体化和递送具有多种优势，允许递送更短的和/或失活的蛋白质，并且特别适用于在所需时间诱导T-细胞内的基因组工程化，从而限制整合Cas9核酸酶的潜在毒性。[0095]"分裂Cas9"在本文中是指Cas9蛋白质或Cas9变体的降低或截短形式，其包含RuvC或HNH结构域，但不会两个这些结构域。这种"分裂Cas9"能够与导向RNA-起独立使用或以互补的方式使用，像例如，一个分裂Cas9提供RuvC结构域而另一个提供HNH结构域。不同的分裂RNA导向核酸内切酶可以一起使用，具有RuvC和/或NHN结构域。[0096]每个Cas9分裂结构域能够源自不同或相同Cas9同源物。Cas9的许多同源物已在基因组数据库中确定。[0097]所述Cas9分裂结构域(RuvC和HNH结构域)能够同时或依次引入所述细胞中而使所述分裂Cas9结构域在所述细胞种处理所述祀核酸序列。所述Cas9分裂结构域和导向RNA能够通过使用细胞穿透肽或如其它地方所述的其它转染方法引入到所述细胞中。[0098]在本发明的另一方面中，只有一个分裂Cas9结构域，称为紧凑Cas9,引入到所述细胞中。事实上，令人惊奇的是，本发明人证实，包含如上所述的RuvC基序的所述分裂Cas9结构域能够独立切割包含所述HNH基序的分裂结构域的靶核酸序列。因此，它们能够证明所述导向RNA不需要HNH结构域存在以结合至所述靶核酸序列并且通过所述RuvC分裂结构域充分稳定地结合。在一个优选的实施方式中，所述分裂Cas9结构域单独能够切断所述祀核酸序列。[0099]每个分裂结构域能够融合到所述N-端和/或C端中的至少一个活性结构域，所述活性结构域能够选自以下组成的组:核酸酶(例如，核酸内切酶或核酸外切酶）、聚合酶、激酶、磷酸酶、甲基化酶、脱甲基酶、乙酰化酶、脱乙酰化酶、拓扑异构酶、整合酶、转座酶、连接酶、解旋酶、重组酶、转录激活子(例如，VP64，VP16)、转录抑制剂(例如，KRAB)、DNA末端加工酶(例如，Trex2，Tdt)、报道分子(例如，荧光蛋白，lacZ，萤光素酶）。[0100]HNH结构域负责对所述靶双链DNA的一个链进行切口而所述RuvC样RNaseH折叠结构域参与对双链核酸靶的另一条链（包括所述PAM基序）切口（Jinek，Chylinskietal.2012)。然而，在野生型Cas9中，这两个结构域会导致所述PAM紧接附近内相同靶序列（原间隔子）内的所述侵入〇嫩发生钝切割（（"114,0^1111吐1的31.2012)。0&89能够是切口酶并诱导不同靶序列中的切口事件。[0101]作为非限制性实例，Cas9或分裂Cas9能够在所述HNH或RuvC样结构域的所述催化残基中包含突变，以诱导不同靶序列内的切口事件。作为非限制性实例，所述Cas9蛋白的催化残基是在Cas家族成员的同源物上对应于氨基酸010,031，11840，11868，_82和_91或使用CLUSTALW方法的对准位置的那些。任何这些残基能够被任何其它氨基酸，优选被丙氨酸残基取代。催化残基内的突变是指诱导cas9的至少一个所述催化结构域失活的被另一氨基酸的取代，或氨基酸的缺失或加入。（参见，在一个【具体实施方式】中，Cas9或分裂Cas9可以包含一个或多个上述突变。在另一【具体实施方式】中，分裂Cas9仅包含所述两个RuvC和HNH催化结构域中的一种。在本发明中，来自不同物种、Cas9同源物、其Cas9工程化和功能性变体的Cas9都能够使用。本发明设想了使用任何RAN导向核酸内切酶或分裂RNA导向核酸内切酶变体以实施所关注的遗传序列中的核酸切割。[0102]优选根据本发明的所述Cas9变体具有与化脓性链球菌的Cas9(C0G3513)共享至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，而甚至更优选95%-致性的氨基酸序列。[0103](meganuclease)[0104]稀切核酸内切酶也能够是归巢核酸内切酶，也已知称为兆碱基大范围核酸酶。这种归巢核酸内切酶在本领域内是公知的（Stoddard2005)。归巢核酸内切酶是高度特异性的，会识别长度12~45个碱基对(bp)，通常长度范围为14~40bp的DNA靶位点。根据本发明的所述归巢核酸内切酶例如可以对应于LAGLIDADG核酸内切酶，对应于HNH核酸内切酶，或对应于GIY-HG核酸内切酶。根据本发明优选的归巢核酸内切酶能够是I-CreI变体。"变体"核酸内切酶，即，天然不存在于自然界中而通过工程化或通过随机突变获得的核酸内切酶，能够结合不同于由野生型核酸内切酶识别的DNA序列（参见国际申请W02006/097854)。[0105]所述稀切核酸内切酶能够是模块化的DNA结合核酸酶。模块化DNA结合核酸酶是指包含核酸内切酶的至少一个催化结构域和至少一个DNA结合结构域的任何融合蛋白或指定核酸靶序列的蛋白。所述DNA结合结构域一般是由包含至少1个识别双或单链多核苷酸的基序的独立折叠的多肽或蛋白结构域形成的RNA或DNA结合结构域。许多这种多肽在本领域内进行了描述，具有结合特异性核酸序列的能力。这种结合结构域通常包括，作为非限制性实例，螺旋-转角螺旋结构域(helix-turnhelixdomain)、亮氨酸拉链结构域、翼状螺旋结构域(wingedhelixdomain)、螺旋-环-螺旋结构域、HMG-盒子结构域、免疫球蛋白结构域、B3结构域或工程化锌指结构域。[0106]锌指核酸酶[0107]最初开发用于体外切割DNA，"锌指核酸酶"（ZFN)是所述IIS型限制酶切割结构域、FokI和含有3个或更多个C2H2型锌指基序的DNA识别结构域之间的融合。在精确的方向和间距上两个单独的ZFN的DNA中具体位置上的异源二聚会导致所述DNA中双链断裂(DSB)。使用这种嵌合核酸内切酶在本领域中已经广泛报道，正如Urnov等的综述（Genomeeditingwithengineeredzincfingernucleases(2010)NaturereviewsGeneticsl1:636-646)〇[0108]标准的ZFN将所述切割结构域融合至每个锌指结构域的所述C-端。为了允许两个切割结构域二聚并切割DNA，所述两个单独的ZFN将DNA的相对链与其相隔一定距离的C端结合。所述锌指结构域和所述切割结构域之间最常用的连接子序列要求每个结合位点的5'边缘被5~7个bp分离。[0109]产生新锌指阵列的最直接方法，是合并已知特异性的较小锌指"模块"。最常见的模块化装配过程涉及结合三个各自能够识别3个碱基对DNA序列的单独锌指以产生能够识另IJ9个碱基对的靶位点的3-指阵列。许多选择方法已被用于产生能够靶向所需序列的锌指阵列。初始选择的工作利用噬菌体展示以选择出结合来自较大集合的部分随机化的锌指阵列的给定DNA靶的蛋白。最近更多的工作已经利用酵母单杂交系统，细菌单杂交和双杂交系统，以及哺乳动物细胞。[0110]TAL-核酸酶[0111]"TALE-核酸酶"或"MBBBD-核酸酶"是指由通常源自转录激活子样效应蛋白（TALE)或模块化碱基-对-碱基(base-per-base)结合结构域(MBBBD)的DNA结合结构域的融合产生的工程化蛋白，含有具有核酸内切酶活性的催化结构域。这样的催化结构域通常来自酶，如例如I-TevI，ColE7，NUCA和Fok-IJALE-核酸酶能够根据所选择的催化结构域在单体或二聚体形式下形成(W02012138927)。这种工程化TALE-核酸酶能够以商品名TALEN?商购获得(Cellectis,8ruedelaCroixJarry，75013Paris，France)〇[0112]根据本发明的一个优选的实施方式，所述DNA结合结构域源自转录激活子样的效应器（TALE)，其中序列特异性受源自作为非限制性实例的黄单胞菌属或青枯细菌蛋白AvrBs3、PthXol、AvrHahl、PthA、Tallc的一系列33~35个氨基酸重复驱动。[0113]这些重复基本上区别在于指定与碱基对相互作用的两个氨基酸的位置（（Boch，Scholzeetal?2009;MoscouandBogdanove2009)。所述DNA革E中每个喊基对通过单一重复接触，而特异性是由所述重复(所谓的重复可变二肽，RVD)的两个变体氨基酸所致。TALE结合结构域可以进一步包含负责所述靶向序列的第一胸腺嘧啶碱基(TO)需求的N-端易位结构域和含有核定位信号(NLS)的C端结构域。TALE核酸结合结构域具体而言对应于包含多个TALE重复序列的工程化核心TALE支架，每个重复包括对于TALE识别位点的每个核苷酸碱基具有特异性的RVD。在本发明中，所述核心支架的每个TALE重复序列是由30~42个氨基酸，更优选33或34个氨基酸制成，其中位于位置12和13的两个关键氨基酸（即所谓的重复可变二肽，RVD)介导所述TALE结合位点序列的一个核苷酸的识别；相当于两个关键氨基酸能够专门位于高度超过33或34个氨基酸长度的所述TALE重复序列中除了12和13位置之外的位置。优选与所述不同核苷酸的识别相关的RVD是识别C的HD，识别T的NG，识别A的NI，识别G或A的NN。在另一实施方式中，关键氨基酸12和13能够朝着其他氨基酸残基突变以调节其对核苷酸A、T、C和G的特异性并且尤其是增强这种特异性。TALE核酸结合结构域通常包含8~30个TALE重复序列。更优选本发明的所述核心支架包含8~20个TALE重复序列，更加优选15个TALE重复序列。它还能够包含由位于所述TALE重复序列组的C-端，即另外C-端半-TALE重复序列的20个氨基酸构成的附加单短截TALE重复序列。[0114]其他工程化的DNA结合结构域能够用作替代序列，以形成所谓的模块化碱基_对_碱基(base-per-base)特异性核酸结合结构域(MBBBD)，如W02014/018601所述。所述MBBBD能够，例如，从新近鉴定的蛋白，即来自所述内共生真菌根霉共生产素伯克霍尔德氏菌(BurkholderiaRhizoxinica)的近期测序基因组的EAV36_BURRH，E5AW43_BURRH，E5AW45_BURRH和E5AW46_BURRH蛋白（Lackner，Moebiusetal.2011)进行工程化。这些核酸结合多肽包含约31~33个碱基特异性的氨基酸的模块。这些模块表现出与黄单胞杆菌属TALE共同重复小于40%的序列一致性并表现出更多的多肽序列可变性。来自伯克霍尔德菌属和黄单胞杆菌属的上述蛋白质(模块，N和C-端）的不同结构域适用于工程化对特异性核酸序列具有结合性质的新蛋白质或支架，并可以结合以形成嵌合TALE-MBBBD蛋白。[0115]作为实例，本发明涵盖为了通过使用特异性TALE-核酸酶失活所述编码抗原标记如⑶38、CS1和⑶70的基因的表达的工程化T-细胞的方法。[0116]特别适合用于实现本发明的是，TALE-核酸酶如各自对于⑶38、CS1和⑶70基因在SEQIDN0:2-3;5-6;8-9、SEQIDN0:64-65;67-68;70-71和SEQIDN0:73-74;76-77;79-80中的那些。这些特异性的TALE-核酸酶，其序列靶和所使用的方案更彻底地介绍于以下实施例1-3中。[0117]递送方法[0118]本发明人已经考虑本领域中已知的任何方法，以允许在所述细胞或所述细胞亚细胞区室内部递送表达所述核酸内切酶、其可能的共效应子(例如，与Cas9或argonaute核酸酶相关的导向RNA或DNA)以及所述嵌合抗原受体的多核苷酸。这些方式包括作为非限制性的例子的病毒转导，电穿孔，以及还有脂质体递送方式，聚合物载体，化学载体，脂质复合物(lipoplex)，聚合复合物(polyplex)，树枝状聚合物，纳米粒子，乳剂，天然内吞作用或吞途径。[0119]作为本发明的一个优选实施方式，编码本发明的核酸内切酶的多核苷酸在mRNA形式下转染以便，例如，通过电穿孔获得瞬时表达并避免外源DNA的染色体整合。本发明人已经确定了表1中展示的T-细胞内的mRNA电穿孔的不同最佳条件。本发明人使用了细胞脉冲(cytoPulse)技术，这种技术允许通过使用脉冲电场瞬时渗透活细胞以将物质递送到所述细胞内（美国专利US6010613和W02004/083379)。脉冲持续时间、强度以及脉冲之间的间隔能够进行修改以达到高转染效率而死亡率最低的最佳条件。基本上，所述第一高电场脉冲容许孔道形成，而随后的低电场脉冲允许将所述多核苷酸迀移至所述细胞中。在本发明的一个方面中，本发明人描述了导致T-细胞中实现mRNA转染效率>95%，和利用电穿孔方案在T-细胞中瞬时表达不同类型的蛋白质的步骤。具体而言，本发明涉及一种转化T-细胞的方法，包括将所述T-细胞与RNA接触并向T-细胞施加由以下各项组成的灵活(agi1e)脉冲序列：[0120](a)-个电脉冲，电压范围2250~3000V/cm，脉冲宽度0.1ms以及步骤(a)和(b)电脉冲之间的脉冲间隔0.2~10ms;[0121](b)-个电脉冲，电压范围2250~3000V，脉冲宽度100ms以及步骤(b)的电脉冲和步骤(c)的第1电脉冲之间的脉冲间隔100ms;和[0122](c)4个电脉冲，电压325V，脉冲宽度0.2ms以及每4个电脉冲之间的脉冲间隔2ms。[0123]在【具体实施方式】中，转化T-细胞的方法包括将所述T-细胞与RNA接触并向T-细胞施加灵活脉冲序列，由以下各项组成：[0124](a)-个电脉冲，电压2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000￥/〇11，脉冲宽度0.11118以及步骤(&)和(13)的电脉冲之间的脉冲间隔0.2、0.5、l、2、3、4、5、6、7、8、9Sl0ms;[0125](b)-个电脉冲，电压范围从2250,为2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000￥，脉冲宽度1001118以及步骤(13)的电脉冲和步骤(c)的第1电脉冲之间的脉冲间隔100ms;和[0126](c)4个电脉冲，电压325V，脉冲宽度0.2ms以及每4个电脉冲之间的脉冲间隔2ms。[0127]上述数值范围内包括的任何值都在本申请中公开。电穿孔介质能够是本领域中已知的任何合适的介质。优选所述电穿孔介质具有0.01~1.0毫西门子的导电率范围跨度。[0128]表1:用于测定PBMC衍生的T细胞中电穿孔所需的最低电压的不同细胞脉冲程序[0129][0130]病毒转导[0131]根据本发明，利用逆转录病毒载体以及更优选利用慢病毒载体特别适合于将所述嵌合抗原受体表达至所述T-细胞中。对于病毒转导的方法在本领域中是公知的(Waltheretal.(2000)ViralVectorsforGeneTransfer.Drugs.60(2):249-271)。整合病毒载体允许在所述T-细胞基因组中稳定整合所述多核苷酸并容许在一段较长时期内表达所述嵌合抗原受体。[0132]非同种异体反应性T细胞[0133]虽然本发明的方法能够作为基因疗法的一部分，例如，通过在血液循环中使用靶向T-细胞的病毒载体进行体内实施，其将会包括连同表达CAR的其他遗传序列一起表达特异性稀切核酸内切酶(rare-cuttingendonuclease)的遗传序列，但是本发明的所述方法更一般而言旨在对能够获自患者或供体的培养T-细胞进行体外实践。体外工程化的工程化的T-细胞能够作为自体治疗的一部分重新植入其所来源的患者，或者作为异基因治疗(allogeneictreatment)的一部分使用。在后一种情况下，优选对所述细胞进一步进行工程化，使它们变成非异体反应性的（n〇n-a11〇reactive)，以确保其正确移入(engraftment)。因此，本发明的所述方法可以包括从供体获取所述T-细胞并失活其参与MHC识别和或是免疫抑制性药物的靶的基因的额外步骤，正如例如W02013/176915中所述。[0134]T-细胞受体(TCR)是响应于抗原的出现而参与T-细胞活化的细胞表面受体。所述TCR-般由两条链，a和0，构成，其组装以形成异源二聚体并与⑶3转导亚基关联以形成在所述细胞表面上存在的所述T-细胞受体复合物。所述TCR的每个a和M连由免疫球蛋白样N-端可变(V)和恒定(C)区、疏水跨膜结构域和短胞质区构成。对于免疫球蛋白分子，所述a和M连的可变区由V(D)J重组产生，在T-细胞群内产生大量不同的抗原特异性。然而，相比于识别完整抗原的免疫球蛋白，T-细胞通过与MHC分子相关的经过加工处理的肽片段活化，向通过T-细胞的抗原识别中引入额外的维度(dimension)，也称为MHC限制。通过所述T细胞受体所述供体和受体之间的MHC差异的识别导致T-细胞增殖和GVHD的潜在发展。据显示，所述TCR的正常表面表达取决于所述复合物的所有七个组件（component)的协调合成和组装(AshwellandKlusner1990)。!^!?*!或TCR0的失活可能导致所述TCR从T-细胞的表面上消除以阻止同种抗原的识别，从而阻止GVHD的识别。[0135]因此，仍然根据本发明，所述T-细胞的植入可以通过失活编码TCR组件的至少1个基因而改善。通过失活TCRa基因和/或TCRP基因TCR会在导致在所述细胞中无功能。[0136]相对于使用Cas9/CRISPR系统，本发明人已经在编码TCR的3个外显子内确定了合适的靶序列，允许在活细胞内显著降低毒性，同时保留切割效率。所述优选的靶序列在表2中指出(+为较低比率的TCR阴性细胞，++中间比率，+++为较高比率）。[0137]表2:在T-细胞中使用Cas9的所述引导RNA的合适靶序列[0139][0140]MHC抗原也是在移植反应中发挥了重要作用的蛋白质。排斥通过对所植入的组织的表面上的组织相容性抗原产生反应的T-细胞介导，而这些抗原的最大的组是主要组织相容性抗原(MHC)。这些蛋白表达于所有高等脊椎动物的表面上，并且称为人细胞中的HLA抗原(人类白细胞抗原）。如TCR，所述MHC蛋白在T-细胞刺激中发挥至关重要的作用。抗原呈递细胞(通常是树突细胞）显示作为所述MHC上的所述细胞表面上的外源蛋白的降解产物的肽。在共刺激信号的存在下，所述T-细胞被活化，并且将作用于也展示相同肽/MHC复合物的靶细胞。例如，刺激的T助手细胞将靶向结合其MHC展示抗原的的巨噬细胞，或细胞毒性T-细胞(CTL)将作用于展示外源病毒肽的病毒感染细胞。[0141]因此，为了提供更小的同种异体反应性的T-细胞，本发明的所述方法能够进一步包括失活或突变一个HL基因的步骤。[0142]人体中I类HL基因簇包括三种主要的位点(majorlocus)，B、C和A，以及多个次要位点(minor1〇〇118)。11类111^簇也包括三种主要位点，0?、00和01?，并且1类和11类基因簇都是多态的，因为在所述群体中I类和II基因都具有多个不同的等位基因。还存在在HLA功能中也发挥作用的多种辅助蛋白。所述Tapi和Tap2亚基是将肽抗原装载于I类HLA复合物上至关重要的所述TAP转运子复合物的部分，并且所述LMP2和LMP7蛋白体亚基会在抗原的蛋白水解降解成肽以在所述HLA上展示中发挥作用。LMP7降低已经证明也许通过稳定性的缺乏而在所述细胞表面上减少MHCI类的量(Fehlingetal.(1999)Science265:1234-1237)。除了TAP和LMP之外，还有tapasin基因，其产物形成所述TAP复合物和所述HLAI类链之间的桥梁并增强肽负载。tapasin的降低会导致细胞的MHCI类组装受损，所述MHCI类的细胞表面表达降低和免疫响应受损(Grandeaetal.(2000)Immunity13:213-222和Garbietal.(2000)Nat.Immunol.1:234-238)。任何上述基因都可以作为本发明的一部分，例如，如W02012/012667所公开的那样进行失活。[0143]工程化耐药性T-细胞的方法:[0144]为了改善癌症治疗和选择性植入异基因T-细胞，能够将耐药性赋予工程化的T-细胞中，以保护其免于化疗或免疫抑制剂的毒副作用。事实上，本发明人已经观察到，大多数患者都采用化疗和免疫耗竭剂（immunedepletingagent)作为护理标准进行治疗，之后才接受T-细胞免疫治疗。此外，据他们发现，他们能够利用这些治疗帮助选择所述工程化T-细胞(通过在培养基介质中添加化疗药物进行所述细胞体外扩增，之后进行治疗，或者通过在化疗或免疫抑制治疗之下在患者体内获得所述工程化T-细胞体内选择性扩增。[0145]而且T-细胞的耐药性也允许其体内或体外富集，因为表达所述药物抗性基因的T-细胞将存活并相对于药物敏感性细胞倍增。具体而言，本发明涉及一种工程化耐受免疫疗法的异基因和耐药性T-细胞的方法，包括：[0146](a)提供T-细胞；[0147](b)选择至少一种药物；[0148](c)修饰T-细胞以赋予所述T-细胞耐药性；[0149](d)在所述药物存在下扩增所述工程化的T-细胞，和可选地[0150]前述步骤可以结合先前描述的所述方法的步骤。[0151]能够通过失活一个或多个负责所述细胞对药物敏感性的基因（药敏基因），如所述次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因（基因库:M26434.1)赋予T-细胞耐药性。具体而言，HPRT能够在工程化的T-细胞中失活以赋予对细胞生长抑制代谢物6-硫鸟嘌呤(6TG)的抗性，6-硫鸟嘌呤通过HPRT转化为细胞毒性的硫鸟嘌呤核苷酸并且目前用于治疗癌症患者，具体而言是白血病患者(Hacke，Tregeretal.2013)。另一例子是正常表达于所述T-细胞表面上的CD3的失活能够赋予对于抗CD3抗体如替丽珠单抗(〖6?11211111&13)的抗性。[0152]也能够通过表达抗药性基因赋予T-细胞耐药性。所述抗药性基因是指编码对试剂如化疗剂(例如，氨甲喋呤）"耐受性"的核酸序列。换句话说，细胞中抗药性基因的表达允许所述细胞在所述药物存在下比无抗药性基因的相应细胞增殖更大程度的细胞增殖。本发明的抗药性基因能够编码对抗代谢物、甲氨蝶呤、长春碱、顺铂、烷基化试剂、蒽环霉素、细胞毒性抗生素、抗亲免素、其类似物或衍生物等的抗性。[0153]多个基因的变体的等位基因如二氢叶酸酯还原酶(DHFR)、次黄嘌呤核苷单磷酸酯脱氢酶2(MPDH2)、钙调磷酸酶或甲基鸟嘌呤转移酶(MGMT)已经确定能够对细胞赋予抗药性。所述耐药性基因能够通过向所述细胞中引入编码所述基因的转基因，或者通过同源重组将耐药性基因整合到所述细胞的基因组中而表达于所述细胞中。多种其他的耐药性基因已确定能够潜在地用于将耐药性赋予革E向的细胞（Takebe，Zhaoetal.2001;Sugimoto，Tsukaharaetal.2003；Zielske,Reeseetal.2003；Nivens,Felderetal.2004；Bardenheuer,Lehmbergetal?2005;Kushman，Kableretal.2007)〇[0154]DHFR是参与所述细胞中四氢叶酸酯的量的调节的酶，并且对于DNA合成是重要的。叶酸类似物如甲氨蝶呤(MTX)会抑制DHFR并因此用作临床上的抗肿瘤试剂。已提高对疗法中使用的抗叶酸类物质的抑制作用的耐受性的DHFR不同突变体形式已经进行了描述。在一个具体的实施方式中，根据本发明的所述耐药性基因能够是编码人野生型DHFR(基因库：AAH71996.1)的突变体形式的核酸序列，其包含对抗叶酸治疗，如甲氨蝶呤提供耐受性的至少一个突变。在【具体实施方式】中，DHFR的突变形式在位置G15、L22、F31或F34,优选位置L22或F31上包含至少一个突变的氨基酸（（Schweitzer，Dickeretal?1990);国际申请W094/24277;US专利US6,642,043)。[0155]正如本文中所用，"抗叶酸类试剂(antifolateagent)"或"叶酸类似物（folateanalog)"是指涉及一定程度上干涉所述叶酸代谢途径的分子。抗叶酸类试剂的例子包括，例如，甲氨蝶呤(MTX);氨基喋呤;三甲曲沙(Neutrexin?);依达曲沙;N10-炔丙基_5,8_二脱氮叶酸（CB3717);ZD1694(Tumodex);5,8_二脱氮异叶酸（IAHQ);5，10_二脱氮四氢叶酸(DDATHF);5-脱氮叶酸;PT523(Na-(4-氨基-4-脱氧蝶酰基）-NS-半邻苯二甲酰基-L-鸟氨酸）；1〇_乙基-10-脱氮氨基蝶呤（DDATHF，洛美曲索）；吡曲克辛；10-EDAM;ZD1694;GW1843;培美曲塞和rox(10-炔丙基-10-脱氮氨基蝶呤）。[0156]耐药性基因的另一例子也能够是肌苷-5'-单磷酸脱氢酶naMPDH2)，这种鸟苷核苷酸从头合成的限速酶的突变体或修饰形式。頂PDH2的突变体或修饰形式是頂TOH抑制剂耐受基因。IMPDH抑制剂能够是霉酚酸（MPA)或其前体药物霉酚酸酯（mycophenolatemofetil)(MMF)。所述突变IMPDH2能够在导致对IMPDH抑制剂抗性显著增加的野生型人頂TOH2的MAP结合位点（NP_000875.2)中包含至少一个，优选两个突变。所述突变优选处于位置T333和/或S351(Yam，Jensenetal.2006;Sangiolo，Lesnikovaetal.2007;Jonnalagadda，Brownetal.2013)。在一个具体的实施方式中，位置333的所述苏氨酸残基替换为异亮氨酸残基而位置351的丝氨酸残基替换为酪氨酸残基。[0157]另一耐药性基因是钙调磷酸酶的突变形式。钙调磷酸酶(PP2B)是一种参与许多生物过程并且是T细胞活化中心的普遍表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。钙调磷酸酶是由催化亚基(CnA;三种同种型)和调节性亚基(CnB;两种同种型）构成的异源二聚体。所述T-细胞受体结合之后，钙调磷酸酶对转录因子NFAT去磷酸化，允许其转位到所述细胞核和活性的关键靶基因如IL2。与FKBP12的复合物中的FK506,或与CyPA嵌段NFAT的复合物中的环孢霉素A(CSA)会接近钙调磷酸酶的活性位点，阻止其去磷酸化，并由此抑制T-细胞活化(Brewin，Mancaoetal.2009)。本发明的耐药性基因能够是编码耐受|丐调磷酸酶抑制剂的钙调磷酸酶的突变形式的核酸序列（如FK506和/或CsA)。在具体的实施方式中，所述突变形式能够在以下位置上包含所述野生型钙调磷酸酶异源二聚体a的至少一个突变氨基酸：乂314，￥341，]\〇47，了351，1352儿354，1(360，优选在位置了351和1354或￥314和￥341上双突变。本文中所描述的氨基酸位置的对应经常依据野生型人体钙调磷酸酶异源二聚体(基因库：ACX34092.1)的形式的氨基酸位置进行表达。[0158]在另一【具体实施方式】中，所述突变形式能够在以下位置包含野生型钙调磷酸酶异源二聚体b的至少一个突变氨基酸:V120，N123，L124或K125，优选在位置L124和K125上双突变。本文中所描述的氨基酸位置的对应经常依据野生型人钙调磷酸酶异二聚体b多肽(基因库:ACX34095.1)的形式的氨基酸的位置进行表达。[0159]另一耐药性基因是编码人烷基鸟嘌呤转移酶(hAGT)的0(6)-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMThAGT是赋予对烷化剂，如亚硝基脲和替莫唑胺(TMZ)的细胞毒性作用的耐受性的DNA修复蛋白。6-苄基鸟嘌呤(6-BG)是增强亚硝基脲毒性的AGT抑制剂并与TMZ联合给药以增强这种试剂的细胞毒性作用。编码AGT变体的MGMT的多种突变形式对于由6-BG所致失活作用具有高度耐受性，但保留了其修复DNA损伤的能力(Maze，Kurpadetal.1999)。在一个具体的实施方式中，AGT突变体形式能够包含野生型AGT位置P140的突变氨基酸(UniProtKB：P16455)〇[0160]另一耐药性基因能够是多耐药性蛋白1(MDR1)基因。这个基因编码膜糖蛋白，称为参与代谢副产物横穿过细胞膜的传输的P-糖蛋白（P-GP)。所述P-Gp蛋白表现出对多种结构上不相关的化疗药物具有广泛的特异性。因此，能够通过表达编码MDR-1的核酸序列（NP_000918)赋予细胞耐药性。[0161]耐药性基因也能够是细胞毒性抗生素，如ble基因或mcr基因。免疫细胞中ble基因或mcr的异位表达在暴露于化疗试剂，分别是博来霉素或丝裂霉素C时会提供选择的优势。[0162]所述T-细胞也能够制成对免疫抑制剂具有耐受性的。免疫抑制剂是通过多种作用机制之一抑制免疫功能的试剂。换句话说，免疫抑制剂是通过表现出消除免疫响应的程度和/或渴求(voracity)的能力的化合物所起的作用。作为非限制性实例，免疫抑制剂能够是钙调磷酸酶抑制剂、雷帕霉素的靶、白介素-2a-链阻断剂、肌苷单磷酸脱氢酶抑制剂、二氢叶酸还原酶抑制剂、皮质类固醇或免疫抑制抗代谢物。经典的细胞毒性免疫抑制剂通过抑制DNA的合成而发挥作用。其他的可以通过T-细胞的活化或通过抑制辅助细胞活化而发挥作用。根据本发明的所述方法允许通过失活T-细胞中所述免疫抑制剂的靶而赋予T-细胞对免疫疗法的免疫抑制耐受性。作为非限制性的例子，免疫抑制剂的靶能够是免疫抑制剂的受体，如:CD52,糖皮质激素受体(GR)，FKBP家族基因成员和亲环素家族基因成员。[0163]在免疫活性的宿主中，同种异体细胞通常很快受到所述宿主的免疫系统排斥。据证明，存在于非照射血液制品中的同种异体白细胞会持续不超过5~6天。因此，为了防止异体基因细胞的排斥，所述宿主的免疫系统必须被有效地抑制。糖皮质激素类固醇在治疗上广泛用于免疫抑制。这类型类固醇激素结合至存在于T-细胞细胞溶质中的所述糖皮质激素受体(GR)，导致易位进入细胞核和结合调节许多参与免疫过程的基因的表达的特异性DNA基序。T-细胞用糖皮质激素类固醇处理，会产生导致T-细胞无能和干扰T-细胞活化的细胞因子生产水平降低。阿仑单抗，也称为CAMPATH1-H，是一种靶向⑶52(12个氨基酸的葡糖基磷脂酰-肌醇-(GPI)连接的糖蛋白）的人源化单克隆抗体（（WaldmannandHale，2005)。CD52高水平表达于T和B淋巴细胞上并低水平表达于单核细胞上，而同时却不出现在粒细胞和骨髓前体上。采用阿仑单抗(针对CD52的人源化单克隆抗体)的治疗已经证明能够诱导循环淋巴细胞和单核细胞的快速耗尽。它经常用于T-细胞淋巴瘤的治疗，并在某些情况下，作为移植的调节方案的一部分。然而，在过继免疫疗法的情况下，使用免疫抑制性药物也会对所述引入的治疗性T-细胞产生不利影响。因此，为了在这些病症中有效使用过继免疫疗法，所述引入的细胞将需要对免疫抑制治疗具有耐受性。[0164]作为上述步骤的优选实施方式中，所述步骤(b)的基因（对免疫抑制治疗具有特异性)是CD52,而步骤(d)的免疫抑制治疗包含靶向CD52抗原的人源化抗体。作为另一实施方式，所述步骤(b)的基因（对免疫抑制治疗具有特异性)是糖皮质激素受体(GR)，而步骤(d)的免疫抑制治疗包括皮质类固醇如地塞米松。作为另一实施方式，步骤(b)的所述靶基因(对免疫抑制治疗具有特异性)是FKBP家族基因成员或其变体，而步骤(d)的免疫抑制治疗包括FK506,也称为他克莫司或藤霉素(fujimycin)。作为另一实施方式，所述FKBP家族基因成员是FKBP12或其变体。作为另一实施方式，所述步骤(b)的基因（对免疫抑制治疗具有特异性)是亲环蛋白家族基因成员或其变体，而步骤(d)的免疫抑制治疗包括环孢素。[0165]在本发明的一个【具体实施方式】中，所述方法的遗传修饰步骤依赖于选自由以下各项组成的组中的两种基因的失活:CD52和GR，CD52和TCRa，CDR52和TCR0，GR和TCRa，GR和TCR，TCRa和TCRf3。在另一实施方式中，所述方法的遗传修饰步骤依赖于两个以上的基因的失活。所述遗传修饰优选使用至少两个靶向不同基因的RNA引导进行体外操作。[0166]失活基因是指是所感兴趣的基因不以功能性蛋白质的形式表达。[0167]为免疫疗法工程化高度活性的T-细胞[0168]根据本发明，所述T-细胞能够选自由下列各项组成的组中：炎性T-淋巴细胞，细胞毒性T-淋巴细胞，调节性T-淋巴细胞或辅助性T-淋巴细胞。在另一实施方式中，所述细胞能够源自由⑶4+T-淋巴细胞和⑶8+T-淋巴细胞组成的组中。它们能够从血液中提取或源自干细胞。所述干细胞能够是成人干细胞，胚胎干细胞，更具体而言是非人干细胞，脐带血干细胞，祖细胞，骨髓干细胞，诱导多能干细胞，全能干细胞或造血干细胞。代表性的人细胞是CD34+细胞。在扩增和遗传修饰本发明的所述细胞之前，细胞源能够通过各种非限制性方法获自受试者。T-细胞能够获自许多非限制性来源，包括外周血单核细胞，骨髓，淋巴结组织，脐带血，胸腺组织，感染位点的组织，腹水，胸腔积液，脾脏组织和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，本领域技术人员可利用的和已知的任何数量的T-细胞系都可以使用。在另一实施方式中，所述细胞能够源自健康供体，源自确诊患有癌症的患者或获自确诊感染的患者。在另一实施方式中，所述细胞是存在不同表型特性的细胞的混合群的一部分。在本发明的范围内也涵盖了根据先前描述的方法获自转化的T-细胞的细胞系。[0169]作为本发明的进一步的方面，根据本发明的所述T-细胞可以进一步进行工程化，优选进行遗传工程化，以尤其是通过调节参与全部T-细胞调节(也称为"免疫检查点"）的蛋白的表达，增强其活性和/或活化。[0170]免疫检查点[0171]本领域的那些普通技术人员应该理解的是，所述术语"免疫检查点"是指T-细胞表达的一组分子。这些分子有效地起到"刹车(brake)"作用，以下调或抑制免疫响应。免疫检查点的分子包括，但不限于，程序性死亡（ProgrammedDeath)1(PD-1，也称为PDCD1或CD279,登录号:NM_005018)，细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA-4,也称为CD152,基因库登录号八?414120.1)，1^63(也称为0)223，登录号：匪_002286.5)，111113(也称为撤￥0?2，基因库登录号：几049979.1)，8!1^(也称为0)272，登录号:匪_181780.3)，8￥55(也称为0)160，基因库登录号：〇?541888.1)，!'1611'(也称为1￥51]\〇，登录号：匪_173799)，1^11?1(也称为〇)305，基因库登录号：CR542051?1，{Meyaard，1997年#122})，SIGLEC10(基因库登录号：AY358337.1)，2B4(也称为CD244,登录号：NM_001166664.1)，PPP2CA，PPP2CB，PTPN6，PTPN22，CD96，CRTAM，SIGLEC7{Nicol1，1999#123}，SIGLEC9{Zhang，2000#124;Ikehara，2004#125}，TNFRSF10B，TNFRSF10A，CASP8，CASP10，CASP3，CASP6，CASP7，FADD，FAS，TGFBRII，TGFRBRI，SMAD2，SMAD3，SMAD4，SMAD10，SKI，SKIL，TGIF1，IL10RA，IL10RB，HM0X2，IL6R，IL6ST，EIF2AK4，CSK，PAG1，SIT1，F0XP3，PRDM1，BATF{Quig1ey，2010#121}，GUCY1A2，GUCY1A3,⑶CY1B2,⑶CY1B3,其直接抑制免疫细胞。例如，CTLA-4是表达于某些CD4和CD8T-细胞上的细胞-表面蛋白；当被其抗原递呈细胞上的配体(B7-1和B7-2)结合时，T-细胞活化和效应子功能被抑制。因而本发明涉及一种工程化T-细胞，特别是用于免疫疗法，包括通过失活参与免疫检测点的至少一种蛋白质，具体而言是PD1和/或CTLA-4或表3中所指的任何免疫检查点蛋白而遗传修饰T-细胞。[0172]表3:编码免疫检查点蛋白的基因列表[0173][0174]对于病理细胞表达嵌合抗原受体的工程化T-细胞[0175]引入到根据本发明的T-细胞中的嵌合抗原受体能够采用不同的设计，如单链或多链CAR。这些不同的设计允许各种策略提高对所述靶向的病理细胞的特异性和结合效率。一些这些策略在本申请的附图中进行了举例说明。单链CAR是在本领域中最经典的版本。多链CAR结构是由本【申请人】开发作为允许根据特异性和强度调节T-细胞的活性。所述多个亚基能够掩蔽其它共刺激结构域或将这种结构域保持一定距离，以及其他类型的受体，而传统单链结构有时可能视为对多特异性相互作用太过灵敏和过少允许。[0176]单链CAR[0177]过继免疫疗法(其涉及体外产生的自体抗原特异性T-细胞的转移），是治疗病毒感染和癌症的有前景的策略。用于过继免疫疗法的T-细胞能够通过扩增抗原特异性T-细胞或通过基因工程化重新定向T-细胞而产生(Park，Rosenbergetal.2011)。病毒抗原特异性T-细胞的转移是用于移植相关的病毒感染和罕见病毒相关的恶性肿瘤的治疗的良好建立的程序。同样地，分离和转移肿瘤特异性T-细胞已经证明在黑素瘤治疗方面是成功的。[0178]T-细胞的新特异性已经通过遗传转移转基因T-细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)而成功产生（（Jena，Dottietal.2010)<XAR是由与一个或多个在单一融合分子中的信号结构域相关的靶向部分组成的合成受体。一般而言，所述CAR的结合部分是由单链抗体(scFv)的抗原-结合结构域构成，包括通过柔性连接子连接的单克隆抗体的轻片段和可变片段。基于受体结构域或配体结构域的结合部分也已成功使用。第一代CAR的所述信号结构域源自所述⑶艽或所述Fc受体y链的胞浆区。第一代CAR已经证明成功地重新定向T-细胞的细胞毒性。然而，它们未能提供体内的延长扩增和抗肿瘤活性。来自包括CD28、0X-40(CD134)和4-1BB(⑶137)的共刺激分子的信号结构域，已经单独添加(第二代），或组合(第三代)添加，以提高存活率和提高CAR改性的T-细胞的增殖。CAR已经成功地容许T-细胞重新定向针对表达于来自包括淋巴瘤和实体瘤的各种恶性肿瘤的肿瘤细胞的表面上的抗原（Jena，Dottietal.2010)〇[0179]除了靶向病理细胞和T-细胞共有的抗原标记如⑶38的CAR之外，可以设想表达针对并不一定通过所述T-细胞表达的其它抗原标记的其它CAR，从而增强T-细胞的特异性。[0180]能够进一步被所述T-细胞表达以产生多特异性细胞的嵌合抗原受体的例子，是针对多发性骨髓瘤或淋巴母细胞白血病抗原标记的抗原受体，如TNFRSF17(UNIPR0TQ02223)，SLAMF7(UNIPR0TQ9NQ25)，GPRC5D(UNIPR0TQ9NZD1)，FKBP11(UNIPR0TQ9NYL4)，KAMP3，ITGA8(UNIPR0TP53708)和FCRL5(UNIPR0TQ68SN8)。[0181]作为进一步的例子，所述靶的抗原能够来自分化分子的任何簇(例如，CD16，CD64，0)78,0)96,0^1，0)116,0)117,0)71，0)45,0)71，0)123和0)138)，肿瘤相关的表面抗原，如ErbB2(HER2/neu)，癌胚抗原(CEA)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，表皮生长因子受体(EGFR)，EGFR变体III(EGFRvIII)，CD19，CD20，CD30，CD40,双口垂液酸神经节昔月旨(disialoganglioside)⑶2,导管上皮粘蛋白，gp36，TAG-72,鞘糖脂，神经胶质瘤相关的抗原，人绒毛膜促性腺激素，a甲胎蛋白（AFP)，植物凝血素反应性AFP，甲状腺球蛋白，1^6￡_1，MN-CAIX，人端粒酶逆转录酶，RU1，RU2(AS)，肠羧基酯酶，muthsp70-2，M-CSF，前列腺酶(prostase)，前列腺酶特异性抗原（PSA)，PAP，NY-ES0_1，LAGA_la中，p53，Prostein，PSMA，存活和端粒酶，前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)，MAGE，ELF2M，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，肝配蛋白B2，CD22,胰岛素生长因子（16?1)-1，16?-11，16?1受体，间皮素，递呈肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合物(MHC)分子，5了4，如1?1，他?30，疆620，肿瘤基质抗原，纤维连接蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)和腱生蛋白-C的A1结构域(TNCA1)和成纤维细胞相关蛋白（fap);谱系特异性或组织特异性的抗原如⑶3，⑶4，⑶8，⑶24，CD25，〇033,0034,0)133,0)138，(：1'1^-4,87-1(0)80)，87-2(0)86)，61-〇5卩，细胞因子受体，内皮糖蛋白，主要组织相容性复合物(MHC)分子，BCMA(⑶269，TNFRSF17)，或病毒特异性的表面抗原如HIV特异性的抗原（如HIVgp120);EBV特异性的抗原，CMV特异性抗原，HPV特异性抗原，拉塞病毒特异性抗原，流感病毒特异性抗原以及这些表面标记的任何衍生物或变体。抗原不一定是表面标记抗原，但也能够是由所述细胞表面上的HLA-I类递呈的内源小抗原。[0182]作为例子，本发明连同在表达所述CAR的细胞中失活分别编码⑶38、CS1和/或⑶70的基因一起涵盖特异性靶向细胞表面标记（如⑶38，CS1和/或⑶70,正如实施例中所述）的单链CAR。[0183]作为一个具体实例，所述8(^￥抗〇)38的所述￥11和￥1链分别与3￡010勵：10和12和SEQIDN0:11和13共享至少80%，优选90%和更优选95%的一致性。[0184]作为一个具体的例子，CD38抗原上的抗体或表位结合，特征在于所述抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个具有由SEQIDNOS:14-17表示的氨基酸序列的连续互补性决定区，并且其中所述轻链包含三个具有由SEQIDN0S:21-23表示的氨基酸序列的连续互补性决定区。[0185]作为另一具体示例，CD38抗原上的抗体或表位结合，特征在于所述抗体或表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个具有由SEQIDNOS:18-20表示的氨基酸序列的连续互补性决定区，并且其中所述轻链包含三个具有SEQIDNOS:24-26表示的氨基酸序列的连续互补性决定区。[0186]作为另一具体例子，所述8(^￥抗031的￥11和￥1链分别与3￡〇10^):38-4〇-42-44-46和SEQIDN0:39-41-42-45-46共享至少80%，优选90%，并更优选95%的一致性。[0187]作为还有的另一具体实例，所述scFv抗CD70的VH和VL链分别与SEQIDN0:81-82;85-86;89-91和SEQIDNO:83-84;87-88;91-92共享至少80%，优选90%，并更优选95%多核苷酸或核酸水平上的一致性。[0188]在一个实施方式中，本发明涵盖了编码单CAR抗⑶38的多核苷酸，其与SEQIDN0:35-37共享至少80%，优选90%，并更优选95%-致性。在另一实施方式中，本发明包涵盖了编码单CAR抗CS1的多核苷酸，其与SEQIDN0:48-62共享至少80%，优选90%，并更优选95%-致性。[0189]在还有的另一实施方式中，本发明涵盖了编码单CAR抗⑶70的多核苷酸，其与SEQIDN0:93-101共享至少80%，优选90%，并更优选95%-致性。[0190]本发明更具体而言集中于赋予了与本申请中描述的那些具有一些一致性的CAR并将在编码由所述CAR靶向的所述细胞标记的基因中携带稀切核酸内切酶诱导的突变的免疫细胞(即，所述CAR展现出与所述失活的基因的产物的亲合力）。一致性是指通过软件如可以作为GCG序列分析软件包(UniversityofWisconsin，Madison，Wis?)的一部分可供利用的软件FASTA，或BLAST测定的至少70%，优选80%，更优选90%，而甚至更优选95%的多核苷酸或多肽一致性。BLASTP"一致性"表明在所述一致的高得分序列对中的总残基的数目和分数。具有与本文公开的氨基酸序列的这些程度的一致性或相似性或任何中间程度的一致性或相似性的氨基酸序列都已经设想并且被本发明公开内容涵盖。这相对于使用BLASTN多核苷酸序列同样适用。[0191]多亚基CAR[0192]引入于T-细胞中的现有技术的嵌合抗原受体由需要连续附加信号结构域的单链多肽组成。然而，从其天然近膜位置移动信号结构域，可能会干扰其功能。为了克服这个缺点，本【申请人】最近设计了源自FceRI的多链CAR以允许所有相关信号结构域的正常近膜位置。在这种新的体系结构中，FceRIa链的所述高亲和力IgE结合结构域被细胞外配体结合结构域如scFv替换以重新定向T-细胞对细胞靶标的特异性，以及所述FceRIP链的N-和/或C-端尾则用于在正常近膜位置放置共刺激信号。[0193]因此，由根据本发明的所述工程化的T-细胞表达的所述CAR能够是特别适合于本发明的工程化T-细胞的生产和扩增的多链嵌合抗原受体(CAR)。这种多链CAR包含至少两个以下组分：[0194]a)-种包含FceRIa链的跨膜结构域和胞外配体结合结构域的多肽，[0195]b)-种包含N-和C-端胞质尾的一部分和FceRIP链的跨膜结构域的多肽和/或[0196]c)至少两种各自包含胞浆内尾一部分和FceRIy链的跨膜结构域的多肽，由此不同多肽一起自发地多聚以形成二聚，三聚或四聚CAR。[0197]根据这种结构，配体结合结构域和信号结构域产生于单独的多肽上。所述不同的多肽锚定于紧密近邻的膜上以允许彼此相互作用。在这样的结构中，所述信号和共刺激结构域能够处于近膜位置上（即，邻近其内侧上的所述细胞膜），这被认为允许改善共刺激结构域的功能。所述多亚基架构还提供了设计对T-细胞激活具有更多控制的CAR的更多灵活性和可能性。例如，有可能包括多种具有不同特异性的胞外抗原识别结构域以获得多特异性的CAR结构。还有可能控制所述不同亚基之间的相对比率成为多链CAR。这种类型的结构最近已经由本【申请人】介绍于PCT/US2013/058005(W02014/039523)中。[0198]例如，通过使用融合了所述信号和共刺激结构域的IgE(FceRI)(Metzger，Alcarazeta1.1986)的高亲和力受体的所述不同a、0和y链，所述不同链组装作为单一多链CAR的一部分就成为可能。所述Y链包含跨膜区和含有一个免疫受体酪氨酸_类的活化基序(ITAM)的胞质尾（Cambierl995)〇[0199]所述多链CAR能够包含多个胞外配体结合结构域，以同时结合靶中的不同组件从而增加免疫细胞的活化和功能。在一个实施方式中，所述胞外配体结合结构域能够串联放置于相同跨膜多肽上，并可选地能够通过连接子分开。在另一实施方式中，所述不同细胞外配体结合结构域能够放置于组成所述多链CAR的不同跨膜多肽。在另一实施方式中，本发明涉及各自包含一个不同胞外配体结合结构域的多链CAR群。在一个【具体实施方式】中，本发明涉及工程化免疫细胞的方法，包括提供免疫细胞，和在所述细胞表面上表达各自包含不同胞外配体结合结构域的多链CAR的群体。在另一【具体实施方式】中，本发明涉及工程化免疫细胞的方法，包括提供的免疫细胞，和向所述细胞中引入编码由各自包含不同胞外配体结合结构域的多链CAR的群体构成的多肽的多核苷酸。在一个【具体实施方式】中，所述工程化免疫细胞的方法包括在所述细胞的表面上表达至少一部分融合于信号转导结构域的FceRIP和/或Y链和多个部分融合于不同胞外配体结合结构域的FceRIa链。在一个更具体的实施方式中，所述方法包括向所述细胞中引入至少一个编码一部分融合于信号转导结构域的FceRIP和/或y链和多个融合于不同胞外配体结合结构域的FceRIa链的多核苷酸。对于多链CAR群，是指至少两个、三个、四个、五个、六个或更多个各自包含不同胞外配体结合结构域的多链CAR。根据本发明的所述不同胞外配体结合结构域能够优选同时结合靶中的不同组件从而增加免疫细胞的活化和功能。[0200]本发明还涉及一种分离的免疫细胞，其包含一群各自包含不同胞外配体结合结构域的多链CAR。[0201]本发明的多链CAR的所述信号转导结构域或胞内信号结构域在胞外配体结合结构域结合至所述靶导致所述免疫细胞活化和免疫反应之后负责细胞内信号。换句话说，所述信号转导结构域负责表达多链CAR的免疫细胞的至少一种正常效应器功能的激活。例如，T-细胞的所述效应器功能可能是包括细胞因子分泌的胞溶活性或辅助活性。[0202]在本申请中，所述术语"信号转导结构域"是指转导所述效应器信号功能信号并指导所述细胞执行专门功能的蛋白质的所述部分。[0203]用于单或多链CAR的信号转导结构域的优选实例能够是所述Fc受体或T-细胞受体和在抗原受体结合后一致行动开始信号转导的共受体的所述细胞质序列，以及这些序列和任何作为相同功能能力的合成序列的任何衍生物或变体。信号转导结构域包含两个独特类型的胞质信号序列，启动抗原依赖性的初级活化的那些，和按照抗原无关的方式作用以提供次级或共刺激信号的那些。初级胞质信号序列能够包含称为ITAM的免疫受体酪氨酸-类的活化基序的信号基序。ITAM是发现于充当syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点的各种受体的所述胞质内尾中的良好限定的信号基序。用于本发明中的ITAM的实例作为非限制性实例能够包括源自TCRlFcRy，FcR0，FcRe，CD3y，CD3S，CD3e，CD5，CD22，CD79a，CD79l^PCD66d的那些。在优选的实施方式中，所述多链CAR的信号转导域能够包含所述CD3G信号结构域，或所述FceRIP或y链的胞浆内结构域。[0204]在【具体实施方式】中，本发明的所述多链CAR的信号转导结构域包含共刺激信号分子。共刺激分子是除了抗原受体或其有效免疫响应所需的配体之外的细胞表面分子。[0205]配体结合结构域能够是关于文献中所指的单链CAR任何先前所用和提到的抗原受体，具体而言是来自单克隆抗体的scFv。正如W02014/4011988中所述的双特异性或多特异性的CAR都结合于本文中作为参考。[0206]类似于此前关于单链CAR所述，本发明涵盖了赋予特异性靶向细胞表面标记如CD38、CS1或CD70的多链CAR的免疫细胞。根据本发明的优选实施方式，上述CAR在免疫细胞中表达，而编码所述表面标记的所述内源基因的失活由稀切核酸内切酶的表达诱导。[0207]T-细胞的活化和扩增[0208]根据本发明的所述方法一般包括激活和/或扩增所述T-细胞的进一步的步骤。这能够在所述T-细胞的遗传修饰之前或之后，使用如，例如，美国专利6，352，694;6，534，055;6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869;7,232,566;7，175,843;5,883,223;6,905,874;6,797,514;6,867,041;和美国专利申请公开号20060121005中所述的方法完成。根据这些方法，本发明的所述T-细胞能够通过与刺激CD3TCR复合物相关的信号的试剂和刺激所述T-细胞表面上的共刺激分子的配体连接至其上的表面接触进行扩增。[0209]具体而言，T-细胞群可以如通过与抗⑶3抗体，或其抗原-结合片段，或表面上固定的抗-CD2抗体接触，或通过与钙离子载体结合与蛋白激酶C活化子(例如，苔藓虫素)接触而进行体外刺激。对于所述T-细胞表面上的辅助分子的共刺激作用，使用了结合辅助分子的配体。例如，T-细胞群能够在适合刺激所述T-细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T-细胞或CD8+T-细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。例如，提供每种信号的试剂可以处于溶液中或偶联至表面。因为本领域的普通技术人员能够易于理解，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于所述靶细胞的粒度。在本发明进一步的实施方式中，所述细胞，如T-细胞，与试剂涂覆的珠结合，所述珠和细胞随后分离，并随后将所述细胞进行培养。在可替代的实施方式中，培养之前，所述试剂涂覆的珠和细胞并不分离而是一起培养。细胞表面蛋白质可以通过允许抗CD3和抗CD28附连的顺磁珠(3X28珠)接触所述T-细胞而连接。在一个实施方式中，所述细胞（例如，4~10个T-细胞）和珠粒（例如，比率1:1的DYNABEADS'XM-450CD3/CD28T顺磁性珠粒)结合于缓冲液，优选PBS(无二价阳离子如钙和镁）中。而且，本领域内那些普通技术人员容易理解，任何细胞浓度都可以使用。所述混合物可以培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在另一实施方式中，所述混合物可以培养21天。适于T-细胞培养的条件包括可以包含增殖和活力必要的因子的合适介质（例如，最低必需培养基(MinimalEssentialMedia)或RPMI培养基1640或X-vivo5，（Lonza))，包括血清（例如，胎牛血清或人血清），白介素_2(IL-2)，膜岛素，IFN-g，1L-4，11-7,61^3?，-10，-2，11-15，16?口和1即-或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括，但不限于，表面活性剂，人血浆蛋白，和还原剂如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。介质能够包括RPMI1640，AlM-V，DMEM，MEM，a-MEM，F-12，乂-'\^￥〇1和乂-'\^￥〇20，优化剂((^1：；[1111261')，以及附加的氨基酸，丙酮酸钠和维生素，无血清或补充适量的血清（或血浆)或定义组的激素，和/或一定量足以用于T-细胞生长和扩增的细胞因子。抗生素，例如，青霉素和链霉素，仅包含于实验培养物中，而不包含于要注入到受试者中的细胞培养物中。所述靶细胞要维持于支持生长所必须的条件下，例如，合适的温度（例如，37°C)和气氛(例如，空气+5%⑶2)。已经暴露于变化的刺激时间的T-细胞可以表现出不同的特性。[0210]在另一【具体实施方式】中，所述细胞能够通过与组织或细胞共培养进行扩增。所述细胞也能够在将所述细胞给药于所述受试者之后，例如，在受验者的血液中进行体内扩增。[0211]治疗应用[0212]通过上述的不同方法可获得的所述T-细胞旨在用作治疗在需要其的患者中的癌症、感染或免疫疾病等的药物。[0213]所述治疗能够是缓解性的，治疗性的或预防性的。它可以是同种异体免疫疗法的一部分或自体免疫疗法治疗的一部分。对于自体，是指用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞群是源自所述患者或人类白细胞抗原(HLA)相容性供体。对于异基因，是指用于治疗患者的细胞或细胞群并非源自所述患者，但源自供体。[0214]根据以前的方法之一工程化的所述T-细胞可以汇集，冷冻，并给药于一个或多个患者。当它们制成非异体反应性时，它们可利用为"现成的（offtheshelf)"治疗性产品，这意味着它们能够普遍输注到需要其的患者中。[0215]所述的治疗主要是用来诊断癌症、病毒感染、自身免疫性疾病或移植物抗宿主病(GVHD)的患者。癌症优选是白血病和淋巴瘤，其是液体肿瘤，但也可以涉及实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括，但不限于，癌，母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤，良性和恶性肿瘤，和恶性肿瘤，例如，肉瘤，癌和黑色素瘤。成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症也包括在内。[0216]本发明在表4至14中提供了能够用本发明用于治疗不同癌症类型的所述工程化的细胞革G向的抗原标记的例子。[0217]用于本发明的免疫疗法的优选抗原标记更具体而言是⑶38,⑶319(CS1)和⑶70。[0218]本发明的T-细胞，当用针对患者自身的免疫细胞的特异性CAR，特别是T-细胞装备时，允许对所述细胞进行抑制或调节，这是用于治疗自体免疫疾病，如类风湿性多关节炎，系统性红斑狼疮，干燥综合征，硬皮病，纤维肌痛，肌炎，强直性脊柱炎，I型胰岛素依赖性糖尿病，桥本氏甲状腺炎，阿狄森氏病，克罗恩病，乳糜泻(Celiac'sdisease)，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和多发性硬化(MS)的关键步骤。因此本发明涵盖了通过将先前描述的工程化T-细胞针对患者自身的T-细胞而用于治疗免疫疾病的方法。[0219]上述治疗能够组合一种或多种选自抗体疗法，化疗，细胞因子疗法，树突细胞疗法，基因疗法，激素疗法，激光疗法和放射疗法组成的组中的疗法。[0220]如先前描述的所述工程化的T-细胞，当它们制成对于用作护理标准的化疗药物和免疫抑制性药物，特别是氨甲蝶呤和氟达拉滨和环磷酰胺组合具有耐受性时，特别适合于治疗各种形式的癌症。事实上，本发明优选依赖于细胞或细胞群，在这方面，预期所述化疗和/或免疫抑制治疗应该有助于所述工程化的T-细胞的体内选择和扩增。[0221]在本发明的某些实施方式中，细胞结合任何数量的相关治疗方式（例如，在其之前，同时或之后），包括，但不限于，用如抗病毒疗法，西多福韦和白细胞介素-2,阿糖胞苷(还称为ARA-C)的试剂的治疗或MS患者的那他丽珠单抗(nataliziimab)治疗或牛皮癣患者的依法丽珠单抗(efaliztimab)治疗或PML患者的其他治疗给药于患者。在进一步的实施方式中，本发明的T-细胞可以组合化疗，辐射，免疫抑制剂，如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其他免疫消融（immunoablative)剂，如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体疗法，细胞毒素(cytoxin)，氟达拉滨(fludaribine)，环孢菌素，FK506,雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，FR901228,细胞因子，和辐照使用。这些药物会抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶（环孢菌素和FK506)或抑制对于生长因子诱导的信号很重要的p70S6激酶（雷帕霉素）(Liuetal.,Cell66:807-815,1l；HendersonetalImmun.73:316-321,1991；Biereretal.，Citrr.0pin.mmn.5:763_773,93)。在一个进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物结合骨髓移植，使用化疗剂如氟达拉滨的T-细胞消融疗法，外部束辐射疗法(XRT)，环磷酰胺，或抗体如0KT3或CAMPATH(例如，之前，同时或之后）给药于患者，在另一实施方式中，本发明的细胞组合物在B-细胞消融疗法如与CD20反应的试剂，例如，利妥昔单抗(Rituxan)之后进行给药。例如，在一个实施方式中，受试者可以进行高剂量化疗的标准治疗之后进行外周血干细胞移植。在某些实施方式中，移植之后，受试者接受本发明的所述扩增免疫细胞的注入。在另外的实施方式中，所述扩增的细胞在手术之前或之后给药。通过本文中描述的任何一种方法获得的所述改性细胞能够在本发明的具体方面中用于治疗需要其的患者对抗宿主抗移植物(HVG)排斥和移植物抗宿主病(GVHD);因此在本发明的范围中是治疗需要其的患者对抗宿主抗移植物(HVG)排斥和移植物抗宿主病(GVHD)的方法，包括通过向所述患者给药有效量的包含失活的TCRa和/或TCR0基因的改性细胞而治疗所述患者。[0222]根据一个实施方式，本发明的所述T-细胞一旦给药于患者就可能经受强劲的体内T-细胞扩增，并且能够存在于体液中长达延长的一段时间量，优选1周，更优选2周，甚至更优选至少一个月。尽管根据本发明的所述T-细胞预期在此期间持续，其进入患者身体的寿命预期不超过一年，优选6个月，更优选2个月，甚至更优选一个月。[0223]给药根据本发明的所述细胞或细胞群可以以任何方便的方式，包括通过气溶胶吸入，注射，摄取，输液，植入或移植而进行实施。本文描述的组合物可以以皮下，皮内，瘤内，结内，髓内，肌肉内，通过静脉内或淋巴内注射，或腹腔内给药于患者。在一种实施方式中，本发明的细胞组合物优选通过静脉内注射给药。[0224]给药所述细胞或细胞群能够由以下构成:给药104~109个细胞/kg体重，优选105~1〇6个细胞/kg体重，包括那些范围内细胞数的所有整数值。所述细胞或细胞群能够以一个或多个剂量给药。在另一实施方式中，所述有效量的细胞作为单剂量给药。在另一实施方式中，所述有效量的细胞作为不只一个剂量给药一段时间。给药的定时计划在管理医师的判断范围内，并取决于所述患者的临床状况。所述细胞或细胞群可以获自任何来源，如血库或供体。虽然个体需要改变，但对于具体疾病或病症的给定细胞类型的有效量的最佳范围的确定都在本领域的技术内。有效量是指提供治疗或预防益处的量。所述给药的剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和体重、如果存在的化并行治疗的类型，治疗频率和所需疗效的性质。[0225]在另一实施方式中，所述有效量的细胞或包含这些细胞的组合物通过胃肠外进行给药。所述给药能够是静脉给药。所述给药能够通过在肿瘤中注射直接完成。[0226]表达于T-细胞的表面上的表面抗原标记的识别，同时过表达于参与不同癌症类型(表5~13)的实体肿瘤中[0227]我们使用了来自也能够从包含所述亚细胞定位的BioGPS(人类原发性肿瘤(U95))UniProt数据下载的一小组正常组织(HumanU133A/GNF1HGeneAtlas)癌症微阵列数据的BioGPS微阵列数据。[0228]我们推导出了来自正常组织的值的分布并确定了所述相关表达5的阈值。[0229]我们浏览了用微阵列分析的所有基因（44.000探针表示约13000基因）并检查其在所述膜中的定位(未指出是膜蛋白的蛋白就丢弃）。在CD8+T-细胞中的表达由BioGPS数据库进行检查。所述基因根据癌症类型列出，其中所述对应的表达是最高的(表5~13)。_〇]表达于T-细胞的表面上的表面抗原标记的识别，同时过表达于不同液体血液瘤中(表14)[0231]对于这项研究，没有RNA-seq数据可用，因此我们使用获自所述MILE协会(MicroarrayInnovationsinLeukemia)大型研究的微阵列数据，涉及11个实验室(http://www.ngrl.org.uk/wessex/downloads/tm08/TM08-S4_l_KenMills.pdf-Haferlachetal.2010，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20406941)。这些原始数据包括ALL(急性成淋巴细胞白血病）、AML(急性髓细胞性白血病）、CLL(慢性成淋巴细胞白血病）和CML(慢性髓细胞白血病）和MDS(骨髓发育异常综合征）的结果。我们还使用了用于平常亚细胞定位的UniProt数据。[0232]我们首先推导了所有研究的组织上的所有基因的值的整体分布。然后，为了了解表达必要的水平，我们选取了表达于一些液体肿瘤中并且治疗性抗体是可利用的基因列表(CD52，CD20，CD33，CD19，CD25，CD44，CD47，CD96，CD116，CD117，CD135，T頂-3)。对于每一个基因，我们研究了其表达的肿瘤中获得的值。然后，我们计算了对于所述基因似乎为其提供细胞膜蛋白（细胞膜定位+蛋白质中至少一个跨膜结构域的描述)的每个肿瘤和基因对的平均值。我们丢弃在所有组织中表达低于0.15这个阈值的基因。我们将T-细胞中相对表达高于0.2的那些基因列出于表14中并进行排序。因此，表4提供了根据本发明靶向液体肿瘤细胞，具体而言是用于治疗ALL、AML、CLL、CML和MDS的假定抗原标记候选物。[0233]根据本发明用于免疫治疗的工程化T-细胞的步骤的实例[0234]为了更好地理解本发明，以下提供了随后产生针对白血病⑶38阳性细胞的T-细胞的步骤的实例：[0235]1.从细胞培养物或来自一个个体患者或血库的血液样品中提供T-细胞并使用抗CD3/C28活化子珠粒（Dynabeads?)活化所述T-细胞。所述珠粒提供T-细胞活化和扩增所需的初级和共刺激信号。[0236]2.用包含编码由⑶％激活结构域、4-1BB共刺激结构域、跨膜结构域和来自融合于编码抗CD38抗体可变链的序列的CD28的铰链的融合构成的嵌合抗原受体的转基因的逆转录病毒载体转导所述细胞。为了安全地改善所述转化的T-细胞，对利妥昔单抗敏感的自杀基因可以按照W02013/153391中的描述进一步引入到由T2A分裂序列分离的所述慢病毒载体中。[0237]3.(可选地)工程化非同种异体反应性和/或抗性的T-细胞：[0238]a)有可能失活所述细胞中的TCRa以从所述细胞表面上消除所述TCR并防止同种异体TCR将宿主组织识别为外来的并且由此通过遵照W02013/176915中提出的方案避免GvHD。[0239]b)也有可能失活编码用于免疫抑制剂或化疗药物的靶的一个基因以使所述细胞对免疫抑制或化疗治疗产生耐受性，以防止移植排斥而不影响移植的T-细胞。在这个例子中，免疫抑制剂的靶标是CD52且免疫抑制剂是人源化单克隆抗CD52抗体(例如:阿仑单抗），如W02013/176915中所述。[0240]4.基因失活通过用编码特异性TAL-核酸内切酶(TALEN?-Cellectis，8ruedelaCroixJarry，France)的mRNA电穿孔T-细胞而进行实施。失活的T-细胞使用磁珠进行分选。例如，仍然表达所述靶向的基因（例如，CD38，⑶70和⑶70)的T-细胞能够通过固定于固体表面上而除去，而失活的细胞并未暴露于过柱的应力。这种柔性方法增加正确工程化T-细胞的浓度。[0241]5.在给药于患者之前工程化的T-细胞体外扩增或在通过⑶3复合物刺激给药于患者之后体内扩增。在给药步骤之前，患者能够经受免疫抑制治疗如CAMPATH1-H，人源化单克隆抗⑶52抗体。[0242]6.可选地在给药于患者之前将所述细胞体外暴露于双特异性抗体或在给药于患者之后将所述细胞体内暴露而使所述工程化的细胞接近靶抗原。[0243]用对抗CD38单链嵌合抗原受体(CARCD38)编码的单顺反子(monocistronic)mRNA电穿孔的工程化T-细胞的功能分析：[0244]为了验证基因组工程化并没有影响工程化的T-细胞表现出抗肿瘤活性的能力，尤其是在提供了嵌合抗原受体(CARCD38)时。所述工程化的T-细胞用表达CD38于其表面上的Daudi细胞进行孵育4小时。CD107a的细胞表面上调(upregulation)，通过T淋巴细胞的细胞毒性颗粒释放（称为脱粒（degranulation))的标记，通过流式细胞术分析进行测定((Betts,Brenchleyetal.2003)〇[0245]电穿孔后24h，细胞用可固定的活力染料eFluor-780和特异性评价所述活细胞上CAR的细胞表面表达的PE-结合山羊抗小鼠IgGF(ab'）2片段进行染色。绝大多数对于⑶38遗传破坏的活的T-细胞，表达所述CAR在其表面上。T-细胞用Daudi(CD38+)细胞共培养6h，并通过流式细胞术分析，以检测所述脱粒标记⑶l〇7a在其表面上的表达(Betts，Brenchleyetal.2003)〇[0246]所述结果表明，CD38破坏的T-细胞保持响应于PMA/离子霉素（阳性对照）或⑶38+Daudi细胞脱粒的相同能力。⑶107上调依赖于⑶38+的存在。这些数据表明，本发明T-细胞的基因组工程化对T-细胞安装(mount)受控的抗肿瘤响应的能力没有负面影响。[0247]表4:发现表达于T-细胞表面上的各种癌症的分化(⑶)抗原标记簇[0311][0312]实施例1-⑶38基因上的敲除(K0)&抗⑶38CAR的表达[0313]所述⑶38靶-环状ADP核糖水解酶的说明[0314]⑶38是发现于许多免疫细胞，包括在大多数患者中表达高水平⑶38的多骨髓瘤(MM)细胞的表面上的糖蛋白。⑶38是MM的证实的靶，因为许多研究已经证明使用抗⑶38mAb通过⑶C和ADCC能有效杀伤来自患者的⑶38+MM细胞和⑶38+MM细胞系（El1is，J.H.K.etal，JournalofImmunology，1995，155(2)，925-937)aDaratumumab是诱发多骨髓瘤和其它血液系统肿瘤杀伤的治疗性人⑶38单克隆抗体(DeWeers，M.etal，JImmunol2011186:1840-1848)。在一些研究中，已经证明CD38也是由活化的T-细胞高度表达的（3&11(1〇￥&1-MontesCJeta:，2005，LeukocBiol.77(4):513_21)〇[0315]通过T-细胞表达CD38[0316]在CD3/CD28珠粒和IL-2刺激之后通过T-细胞的CD38表达，通过FACS在17天内每3-4天进行分析。据观察，超过90%的T-细胞在活化之后在第6~第17天内表达(图10B)。[0317]因此，为了避免由抗⑶38CAR+T-细胞杀伤活化的T-细胞，需要防止⑶38在T-细胞中的表面表达。这可以通过使用TALE-核酸酶失活所述⑶38基因来完成。TALEN是本【申请人】(Cellectis公司，8ruedelaCroixJarry，75013PARIS)拥有的商标，指定TAL核酸酶定制形式。[0318]所述⑶38基因敲除(K0)的策略[0319]设计和生产了靶向由所述⑶38基因中的13-pb间隔物隔开的两个17-pb长序列的异源二聚体TALE-核酸酶。每一半的靶通过列于下表15和图10A中的所述半TALE-核酸酶的重复识别。[0320]CD38exl_T2靶的所述左侧TALEN的重复序列是NN-NI-NN-NN-NG-NN-NN-NN-NG-NG-NN-NN-HD-NN-NI-NG，而右侧TALEN的重复序列是NN-NG-HD-HD-HD-HD-NN-HD-NI-NN-NG-NN-HD-HD-HD-NG〇[0321]表15:测试的CD38靶和用于所述CD38抗原的活化的TALEN的序列[0322][0323]每个TALE-核酸酶构建体在T7启动子的控制下于哺乳动物表达载体中使用限制性酶消化进行亚克隆。编码切割CD38的TALE-核酸酶的mRNA由携带下游来自所述T7启动子的所述编码序列的质粒进行合成。[0324]在72小时期间采用抗-⑶3/⑶28涂覆的珠和重组IL-2活化的纯化T-细胞通过电穿孔(Cytopulse)采用每个编码两个半⑶38exl_T2TALE_核酸酶的所述2mRNA(每个lOyg)进行转染。为了研究，所述⑶38K0，⑶38阴性T-细胞的百分比通过流式细胞仪在TALENmRNA基因转染后的第3、6、10和13天时进行评价。据观察，15%的转染T-细胞是⑶38缺乏的（图10)而这种缺乏在转染之后的13天内是稳定的。[0325]另外，设计了两个靶向所述⑶38基因的可替代的TALE-核酸酶。每个半靶通过以下表16和图10A中所列的所述半TALE-核酸酶的重复进行识别。所述⑶38exl_T4靶的所述左侧TALEN的重复序列是NG-NN-HD-NN-NI-NN-NG-NG-HD-NI-NN-HD-HD-HD-NN-NN-NG，而所述右侧TALEN的重复序列是NG-NN-HD-NG-NN-HD-HD-NN-NN-HD-NG-HD-NG-HD-NG-NI。所述CD38exl_T5靶的左侧TALEN的重复序列是NG-NN-NI-NG-HD-HD-NG-HD-NN-NG-HD-NN-NG-NN-NN-NG，而所述右侧TALEN的重复序列是HD-NN-NI-NN-NN-NG-NN-NN-HD-NN-HD-HD-NI-NN-HD-NI〇[0326]表16:两个其它⑶38靶和用于其活化的相应TALEN的序列[0329][0330]所述CAR抗⑶38的表达策略[0331]CAR抗⑶38的结构和组成[0332]表17中提供了8〇?￥抗〇)38的￥11和￥1链。3￡010^):10-11对应于所述人源化抗-CD38抗体daratumumab(Genmab)而SEQIDN0:12-13对应于所述M0R202(或M0R03087)，正如US8,263，746B专利中所述。[0333]5￡〇10如：14-20和5￡〇10腸：21-26分别对应于所述711链（110)1〇和所述￥1链(LCDR)的所述CDR序列，正如W02008/047242申请中所述。[0334]表17:所述scFv抗-CD38抗体daratumumab、M0R202的VH和VL链的序列和VH和VL链的特异性CDR的序列。[0336][0337]对于所述daratumumbabscFv3，设计了不同的CAR构建体(GMB005-V1&V2&V3)，如图11A中所示，而其序列列于下表18中。所有三个构建体在信号条款肽(CD8c〇、（所述scFvVH和VL链之间的)GS连接子、跨膜结构域(TM)、4-1BB共刺激结构域和⑶沉活化结构域(下面表18中所列的序列)方面共享相同组件。其差异来自于所述铰链的选择(表18):[0338]Vl:FcRIIa铰链[0339]-V2:CD8a铰链[0340]-V3:IgGl铰链[0341]表18:scFvdaratumumab类的抗⑶38CAR的3种不同结构和所使用的各个组件的多肽序列[0344]⑶38TALEN将在活化之后第4天进行转染。3天后所述⑶38缺乏细胞通过阴性选择进行分选并在之后3天采用抗⑶38CARmRNA进行转染。一旦完成CARmRNA临时转染，所产生的CAR分子将随后对于朝着靶细胞系表达CD38的表达和脱粒活性进行筛选。表达CD38的不同表达水平（图11B)的靶细胞系将用于活性测试：[0345]-使用抗CD38微珠通过磁分离获得的U266CD38+和U266CD38-[0346]-L363,表达中等水平的⑶38的多骨髓瘤细胞系[0347]-Daudi，源自表达高水平的⑶38的伯基特氏淋巴瘤的细胞系[0348]-K562，源自慢性骨髓性白血病的细胞系⑶38阴性细胞系。[0349]这个第一筛选之后将进行第二筛选步骤，其中许多所选的候选物将对其诱导脱粒、IFNy释放和对所选择的靶细胞系的特异性细胞毒性活性的能力进行测试。候选者的选择随后将会缩小，而对于慢病毒载体生产和CAR活性所选择的一些候选者将在稳定表达所述CAR的⑶38K0T-细胞中进行评价。[0350]实施例2在CS1K0的背景下抗-CS1CAR的活性[0351]CS1靶的介绍[0352]多骨髓瘤(MM)是B-细胞恶性肿瘤，特征在于所述骨髓内的血浆细胞(PC)的异常克隆扩增，在2012年在美国已经确定估计有21700例MM的新病例和10，710人死亡（SiegelR，etal.CancerJClin201262:10-29)。在2013年，据估计，22350个人在美国将新诊断患有MM而10，710人将死于该病，占所有血液系统恶性肿瘤死亡的20%。尽管使用蛋白酶体抑制剂和免疫调节药物，这些已经改善了整体存活率(PalumboA，etal.Leukemia200923:449-456)，但是MM仍然是一种无法治愈的恶性肿瘤(PodarK，etal.Leukemia200923:10-24)，对此迫切需要新的治疗方法。[0353]所述细胞表面糖蛋白CS1(在文献中也称为SLAMF7，CD319或CRACC-NCBI参考序列：NP_067004.3)高度和广泛表达于所述骨髓瘤细胞的表面上(HsiED，etal.ClinCancerRes200814:2775-84)<XS1以极低水平表达于大多数的免疫效应器细胞，包括天然杀伤(NK)细胞、T-细胞的某些亚组和正常B细胞，而在髓细胞上几乎是不可检测的（HsiED，etal.ClinCancerRes200814:2775-84)。值得注意的是，CS1在人类造血干细胞中的表达可以忽略不计(HsiED，etal.ClinCancerRes200814:2775-84)，其能够用于干细胞移植以治疗血液恶性肿瘤，包括丽。CS1在丽中的功能仍然未完全理解，并且据记载，CS1可能在骨髓瘤细胞粘附、集落形成的生长和肿瘤生成中起作用(BensonDMJr，etal.JClinOncol201230:2013-5;TaiYT，etal.Blood2009113:4309-18)。[0354]所述CAR抗CS1的结构[0355]如实施例1中对于抗CD38抗原靶单链CAR，采用在铰链、跨膜结构域、共活化和转导结构域(如图11A中的描述的和表18中所示的序列)方面相同组件设计相同结构VI、V2和V3。[0356]表19中给出了8〇卩￥抗〇51的711和￥1链。5￡010勵：38-40-42-44-46和5￡010如：39-41-43-45-47分别对应于鼠类scFvLuc63、Luc90、Luc34、LucXl和LucX2的VH链和VL链。[0357]表20中给出了具有上述scFv的抗CS1CAR;这些CAR都基于图11A的所述版本V1，V2和V3，其中分别使用了短FcERy铰链，中等铰链CD8a铰链和长的IgGl铰链。下划线部分对应于通过连接物结合的scFvVH和VL链。[0358]表19:scFv抗CS1抗体的VH和VL链的序列[0359][0360]表20:基于图11A中所述V1、V2和V3版本的抗-CS1CAR的多肽序列[0363][0364]CARCS1+和K0CS1工程化的策略[0365]CS1高水平表达于来自患有多骨髓瘤的患者的浆细胞样细胞中，使之成为CAR开发的感兴趣的靶。T-细胞，尤其是⑶8亚组，表达低水平的CS1，这对于T-细胞CAR开发是一个缺点，因为它们可能会在表达抗CS1CAR时被杀死。[0366]在本实施例中，我们评价了Luc90-V2CAR(表20中所示的序列）在假转染(mocktransfect)的或用靶向所述CS1(SLAMF7)基因的TALEN转染的人类T-细胞中的活性，以观察当所述CS1基因在CAR+T-细胞中破坏时所述CAR活性是否增强。所述实验的过程如图12中所不。[0367]T-细胞从白细胞层(血沉棕黄层，buffycoat)样品中纯化并使用⑶3/⑶28涂层珠进行活化。细胞在活化之后72h采用10yg编码所述T01_左侧TAL的mRNA和10yg编码所述T01_右侧TAL的mRNA进行共转染。所述TAL的序列如下表21所示而具有所述TAL重复的所述质粒构建体(T01，T02和T03)如图13中所示。[0368]图14显示了所述CS1(SLAMF7)基因内所述TALT01、T02和T03的靶位置:T01和T02靶向外显子1(图14A)，而T03靶向外显子2(图14B)。[0369]表21:所述CS1的靶和用于其失活的TALEN的序列[0370][0371]TALEn转染后3天，细胞用驱动所述L90-V2CAR离开EF1A启动子表达的重组慢病毒载体进行转导。所述慢病毒载体按照CAR表达通过核糖体跳跃肽（ribosoma1skippeptide)与BFP表达(蓝色荧光蛋白）结合的方式进行构建。所述L90-V2CAR通过识别所述CS1靶(scFvL90)的胞外结合域，接着是铰链和源自所述hCD8a蛋白的跨膜区进行构建。所述分子的胞内部分含有41BB衍生的共刺激结构域(costimulatorydomain)，接着是CD3y信号结构域(signalingdomain)(分别对于单个组件、scFv和CAR序列显示于前表18-19-20的序列）。[0372]转导效率通过流式细胞术，通过以下BFP表达在转导后6天内进行评价。细胞也用抗⑶8和抗CS1抗体进行染色。[0373]题[0374]CARCS1+表达[0375]图16的结果表明，转导效率在假转染的细胞中比采用靶向所述CS1基因的TALEn转染的细胞中更高。这可能是由于未转导的CS1表达T-细胞的特异性细胞杀伤所致，同时这个群体在所述细胞由于TALEN驱动基因破坏不再表达CS1时不会受到影响。[0376]在TALEN或假转染（阴性对照-无质粒转染）的细胞之间在这个时间点上没有观察到CS1水平的显著差异，因为CS1水平在T-细胞初始活化后随时间而减少。另一方面，在假转染的CAR表达细胞中相比于TALEN转染的CAR+细胞观察到⑶8+细胞的以％计的显著降低，这表明高比例的⑶8+细胞已经被所述CAR+T-细胞消除。[0377]细胞毒性活性评价[0378]通过用表达CS1的细胞系（L363细胞)或缺失CS1表达的阴性对照细胞系(M0LM13)共培养相同量的T-细胞，在CAR转导之后8天评价这些细胞的细胞毒性。所述靶细胞系的活力通过流式细胞术在开始细胞共培养之后4h进行测定。图15A中所示的结果表明当它们采用CAR+T-细胞共培养时CS1(+)细胞的细胞活力降低，而同时没有观察到对CSl(-)细胞活力的影响。所述特异性细胞分解采用所述流式细胞术数据进行计算，并且在T-细胞进行CAR转导之前用靶向所述CS1基因的TALEn进行转染时它是2倍更高。应当考虑，所述影响可能甚至更高，因为当所述细胞进行假转染时共培养物中存在的CAR+T-细胞量更高(见图16中的流式细胞术数据）。实验结果如下：[0379]-对于所述假/NTD样品，BFP+细胞的％为0.1%而⑶8+细胞的量为53.9%;[0380]-对于所述TALEn/NTD样品，BFP+细胞的％为0.2%而CD8+细胞的量为49.5%;[0381]-对于所述假/L90-2样品，BFP+细胞的％为94%而CD8+细胞的量为1.8%[0382]-对于TALEn/L90-2样品，BFP+细胞的％为61%而CD8+细胞的量为8?3%。[0383]转导效率在假转染的细胞中比采用靶向所述CS1基因的TALEn转染的细胞中更高(NTD:未转导）。[0384]转导之后再活化[0385]为了确证所述CS1基因已在TALEn转染的T-细胞中破坏，所述不同样品在转导后在Dl1处用⑶3/⑶28珠粒重新活化。重新活化之后72h，细胞用抗⑶8和抗CS1抗体染色，并通过流式细胞术分析表达。[0386]图17显示了每个样品中的转导效率和CD8/CS1表达水平。正如在下图中所示，在假转染的细胞中观察到一旦重新活化时CS1水平的增加，而在所述TALEn转染的群体中能够表达CS1的细胞数量却很低。[0387]所述实验的结果如下：[0388]-对于所述假/NTD样品，BFP+细胞的％为0.01%，CS1表达于65.2%的细胞中，而〇)8+细胞的量为80.7%;[0389]-对于所述TALEn/NTD样品，BFP+细胞的％为0.2%，CS1表达于9.7%的细胞中，而0)8+细胞的量为78.8%;[0390]-对于所述假/190-2样品，8??+细胞的％为94%，031表达于，37.5%的细胞中，而⑶8+细胞的量为16%;[0391]-对于TALEn/L90-2样品，BFP强度为61%，CS1表达为8.5%，而所述CD8表达为68.5%；[0392]在假转染的细胞中观察到一旦再活化时的CS1水平增加，而所述TALEn转染的群体中能够表达CS1的细胞数量较低。[0393]总之，这些结果表明，所述CS1基因在TALEn转染的T-细胞中被破坏，并且这增强了抗CS1CAR+细胞的细胞毒性活性，这主要是通过保存了所述细胞毒性CD8+T-细胞所致。[0394]实施例3:CD70革巴[0395]CD70靶的介绍[0396]所述CD70是结合至CD27的细胞因子，是TNF家族的部分(GoodwinR.G.etal，1993，Cell73:447-456)。这种蛋白在适应性T-细胞响应中具有作用，会诱导共刺激的T-细胞增殖，并增强溶胞T-细胞(cytolyticT-cell)的产生。其登录号为P32970(Uniprot)。如在文献Schiirch，C?etal?(J?Clin?Invest?，2012;doi:10?1172/JCI45977)中的一些研究表明，阻断⑶27-⑶70相互作用可能有助于治疗慢性髓性白血病(CML)。[0397]CD70K0的策略[0398]如实施例1和实施例2,进行针对CD70基因K0的相同策略。设计并产生了靶向所述CD70基因中通过15pb间隔子(spacer)隔开的两个49pb长序列的异源二聚体TALE-核酸酶和革巴向通过23bp间隔子隔开的57-pb长序列的一个TALE核酸酶。每个半革E标(halftarget)通过以下表2中所列出的半TALE核酸酶的重复体(r印eat)识别。[0399]表22:所述⑶70靶和用于其失活的TALEN的序列[0401]抗CD70CAR的表达策略[0402]如实施例1和实施例2所述，进行表达CAR抗⑶70的相同策略。[0403]如实施例1-2，采用在信号肽、所述VH和VL链之间的连接物（1inker)、跨膜结构域、共活化和转导结构域方面相同的组件（图11A中所示的一般结构和表18中所示的单个组件的序列）设计相同的结构V1，V2和V3。在所述3个版本V1、V2和V3之间只有铰链不同，其中分别使用了短FcERy铰链、中等铰链⑶8a铰链和长IgGl铰链。[0404]表23中给出了scFv抗CD70的VH和VL链。SEQIDN0:81-82,85-86,89-90和SEQIDNO:83-84,87-88,91-92分别对应于来自AMGEN的scFvAb4、Ab8和来自SeattleGenetics的1F6的VH链和VL链。[0405]表24中给出了具有上述scFv的抗CD70CAR;这些CAR都基于根据图11A的版本V1、V2和V3，其中分别使用了短FcEy铰链，中等铰链CD8和长IgGl铰链。[0406]表23:所述scFv抗CD70Ab4、Ab8和1F6抗体的VH链和VL链的多核苷酸和核酸序列[0408][0409]表24:基于根据图11A的所述V1、V2和V3版本的抗⑶70CAR的多肽序列[0411][0412]参考文献[0413]Bardenheuer?ff.?K.Lehmberg?etal?(2005),Resistancetocytarabineandgemcitabineandinvitroselectionoftransducedcellsafterretroviralexpressionofcytidinedeaminaseinhumanhematopoieticprogenitorcells.Leukemia19(12):2281-8?[0414]Betts，M?R?，J?M?Brench1ey，etal?(2003)?〃Sensitiveandviab1eidentificationofantigen-specificCD8+Tcellsbyaflowcytometricassayfordegranulation,JImmunolMethods281(1-2):65-78.[0415]Boch，J?，H?Scholze，etal?(2009)."BreakingthecodeofDNAbindingspecificityofTAL-typeIIIeffectors."Science32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中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞源自原生干细胞，iPS或hES细胞。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述免疫细胞源自获得自受所述病理细胞的发展影响的所述患者的iPS细胞。10.根据权利要求1~9中任一项所述的方法，其中步骤a)使用稀切核酸内切酶进行实施。11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤a)使用TAL-核酸酶进行实施。12.根据权利要求10所述的方法，其中步骤a)使用RNA-引导的核酸内切酶进行实施。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述RNA-引导的核酸内切酶是Cas9。14.根据权利要求12所述的方法，其中RNA-引导的核酸内切酶分裂成至少2种多肽，一种包含RuvC而另一种包含HNH。15.根据权利要求10所述的方法，其中所述核酸内切酶表达自转染的mRNA。16.根据权利要求1~15中任一项所述的方法，其中所述方法包括失活编码T-细胞受体(TCR)的组件的基因的进一步的步骤。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述T-细胞受体的组件是TCRa。18.根据权利要求1~15中任一项所述的方法，其中所述方法包括失活编码HLA的组件的基因的进一步的步骤。19.根据权利要求1~15中任一项所述的方法，其中所述方法包括失活编码i32m的基因的进一步的步骤。20.根据权利要求1~15中任一项所述的方法，其中所述方法包括失活编码选自CTLA4，PPP2CA，PPP2CB，PTPN6，PTPN22，PDCD1，LAG3，HAVCR2，BTLA，CD160，TIGIT，CD96，CRTAM，LAIR1，SIGLEC7，SIGLEC9，CD244，TNFRSF10B，TNFRSF10A，CASP8，CASP10，CASP3，CASP6，CASP7，FADD，FAS，TGFBRII，TGFRBRI，SMAD2，SMAD3，SMAD4，SMAD10，SKI，SKIL，TGIF1，IL10RA，IL10RB，HM0X2，IL6R，IL6ST，EIF2AK4，CSK，PAG1，SIT1，F0XP3，PRDM1，BATF，⑶CY1A2，⑶CY1A3，⑶CY1B2和⑶CY1B3的免疫检查点蛋白的基因的进一步的步骤。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述基因座涉及PD1或CTLA-4基因的表达。22.根据权利要求1~15中任一项所述的方法，其中所述方法包括使为所述免疫细胞提供对于化疗或免疫抑制药物的敏感性的基因失活的进一步的步骤。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述进一步的基因编码⑶52。24.根据权利要求22所述的方法，其中所述进一步的基因是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)。25.根据权利要求22所述的方法，其中所述进一步的基因编码糖皮质激素受体(GR)。26.根据权利要求22所述的方法，其中所述进一步的基因涉及DCK调节路径，具体而言是DCK表达。27.根据权利要求1~26中任一项所述的方法，其中步骤a)中的所述免疫细胞源自炎性T-淋巴细胞，细胞毒性T-淋巴细胞，调节性T-淋巴细胞或辅助性T-淋巴细胞。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述T-细胞源自⑶4+T-淋巴细胞和/或⑶8+T-淋巴细胞。29.根据权利要求1~28中任一项所述的方法，其中所述转化的免疫细胞在体外扩增。30.根据权利要求1~28中任一项所述的方法，其中所述转化的免疫细胞在体内扩增。31.根据权利要求1~30中任一项所述的方法，其中所述病理细胞选自恶性细胞或受感染细胞。32.根据权利要求1~30中任一项所述的方法，其中所述病理细胞是B-细胞。33.根据权利要求1~30中任一项所述的方法，其中所述病理细胞是实体肿瘤细胞。34.根据权利要求1~30中任一项所述的方法，用于制备有待用作药物的免疫细胞。35.根据权利要求31所述的方法，用于制备用于在需要其的患者中治疗癌症、免疫疾病或感染的免疫细胞。36.根据权利要求32所述的方法，用于治疗淋巴瘤。37.根据权利要求32所述的方法，用于治疗白血病。38.根据权利要求34所述的方法，用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)。39.根据权利要求1~35中任一项所述方法能够获得的工程化免疫细胞。40.根据权利要求39所述的工程化免疫细胞，产生表型[CAR⑶38]+[⑶38Γ。41.根据权利要求39所述的工程化免疫细胞，产生表型[CAR⑶70]+[⑶70Γ。42.根据权利要求39所述的工程化免疫细胞，产生表型[CARCS1]+[CSlΓ。43.-种用于治疗患者的方法，包括：(a)诊断所述患者存在递呈与免疫细胞共同的特异性抗原标记的病理细胞；(b)根据权利要求38~42或根据权利要求1~35中任一项所述的方法制备工程化免疫细胞的群体;和(c)将所述工程化免疫细胞给予针对所述病理细胞诊断的所述患者。【文档编号】A61P35/00GK106029875SQ201580008739【公开日】2016年10月12日【申请日】2015年2月13日【发明人】菲利普·迪沙泰奥,劳伦特·普瓦罗【申请人】塞勒克提斯公司