专利名称：：一种基因靶向的小分子干扰rna在制备抑制肿瘤迁移药物中的新用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医药领域，具体涉及一个生存素survivin基因为耙标的基因靶向小分子干扰RNA(siRNA)在制备抑制肿瘤迁移药物中的用途。
背景技术：
：RNA干扰技术(RNAi)是近几年发展起来的被认为是研究功能基因组最有力工具之一。这种新兴的生物技术为肿瘤分子水平的基因治疗提供了新的技术和方法。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)dsRNA)介导的转录后的基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)现象。通过在多种生物细胞内导入外源或内源的dsRNA可以使内源性mRNA发生特异性降解，从而引起相应基因转录的阻抑。RNAi已作为一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学研究以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。恶性肿瘤是当前威胁人类生命健康的主要杀手之一，目前还没有找到真正有效的根治方法，这迫使科研工作者不断寻找新的技术和方法，试图从根本上攻克癌症。Survivin是1997年耶鲁大学Aitieric.DC等人在人类基因组库中首先筛选分离出来的IAP(凋亡抑制蛋白)家族的一个成员。它定位于17q25,该基因几乎在所有种类的肿瘤组织中特异性地表达，而正常组织几乎没有表达；该基因在肿瘤细胞中高表达后，不但促进肿瘤细胞抗凋亡、促进肿瘤细胞有丝分裂、参与血管形成和放化疗耐受多种功能，而引起了国内外学者的广泛关注。有研究者(LabInvest,1999,79(11):1327-1333;AmJPathol,1998，152(l):43-49)对正常增殖细胞中survivin基因的潜在分布进行研究发现包括皮肤表面的角化细胞、肠道的上皮细胞和正常的骨髓细胞在内，在各种有丝分裂细胞系中均没有检测到survivin基因的表达；survivin具有在肿瘤组织中表达特异性强、表达率高，而在正常组织中不表达的特点以及在肿瘤的发生、发展及抗药性等诸多方面所扮演的重要角色而使它很有可能成为肿瘤基因治疗理想的新耙点。血管形成过程取决于血管内皮细胞生存和凋亡的平衡。正常情况下，血管内皮细胞中很难检测到survivin。在血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的刺激下，静止的血管内皮表达survivin的能力约可增强4倍,VEGF的许多抗凋亡活性都是通过诱导内皮细胞表达survivin來实现的(AmJPathol，2001，158(5):1757-1765)。血管生成素一l(angi叩oietin-l，Ang-l)是胚胎血管形成过程中维持血管稳定性和管腔形成的关键因子。它没有促进内皮细胞生长，而只促进了血管网的稳定和分枝血管的形成。研究发现，Ang-l可以促进内皮细胞中survivin表达，通过Akt(或蛋白激酶B)途径激活survivin的抗凋亡活性，从而阻止内皮细胞凋亡，在体内血管形成过程中稳定血管结构(JBiolChem,2000，275(3):9102-9105)。新血管生成是肿瘤生长和转移的必要因素，因此抑制survivin的表达可能对防止肿瘤细胞的浸润、迁移起重要作用。己有多项动物实验证明，反义survivinRNA或survivin突变体可以有效抑制实体瘤的血管形成和肿瘤的侵袭增殖。因此，survivin基因可以作为肿瘤治疗的新靶点。肿瘤的难治还在于肿瘤的天然耐药以及后期治疗时产生的耐受。肿瘤本身高表达survivin能保护化疗药和放射线对肿瘤的杀伤:相反，不足量的化疗药或放射线也能诱导survivin的表达，产生对治疗的继发耐受。研究表明，survivin能抑制某些化疗药物、IL-3，TNF-a，X射线诱导的Fas,Caspase，Bax等参与的凋亡信号通路(CancerRes，1998,58(23):5315-5320;JCancerRes，2000，91(11):1204-1209)。但假如其唯一的BIR区发生C84A的突变，survivin也就丧失对抗化疗药物Taxol诱导的凋亡的抵抗作用。最早的针对survivin的RNAi研究报导于2003年，Carvalho等用小分子干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)转染HeLa细胞，60h后蛋白印迹结果显示治疗组中己检测不到survivin的表达，细胞增殖明显受抑，部分细胞有丝分裂受到阻滞，出现凋亡(JCellSci,2003，116(14):2987-2998)。随着RNAi技术的不断完善，由原來直接导入外源的siRNA，发展到真核表达载体转录产生siRNA，以及用于RNAi的病毒载体的出现，大大提高了转染效率和干扰效率。Cheng等用靶向survivin基因的RNAi真核载体转染肝细胞癌SMMC7721细胞，发现转染细胞中几乎没有survivin基因的表达，转染细胞自发的凋亡增加，G2/M期细胞比例减少，细胞增殖减慢(WorldJGastroenterol2005,11(5):756-759)。目前针对survivin的RNAi研究进展迅速，体外实验显示了良好的效果，相信不远的将来会有更为丰富和完善的研究结果出现。应用RNA干扰技术，以小分子RNA作为靶向药物，有针对性地对survivin基因的转录后表达进行干扰，从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的有丝分裂，抑制肿瘤转移时的血管形成和降低肿瘤细胞放化疗的耐受性，多层次，多途径对肿瘤进行抑制，这可能成为了一种新的肿瘤治疗策略。而且survivin基因选择性地表达在几乎所有种类的肿瘤组织中，而正常组织几乎不表达，则可使这种基因治疗对正常组织和细胞的毒副作用降到最低，应用RNAi特异地抑制survivin等肿瘤相关基因的表达有望成为一种新的肿瘤基因治疗方式。
发明内容本发明公丌了一种高效的针对survivin基因的广谱的小分子干扰RNA(siRNA)抑制肿瘤迁移药物，由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成正义链5'-AGAAUUUGAGGAAACUGCGtt-3'，反义链5'-CGCAGUUUCCUCAAAUUCUtt-3'其中X代表tt、TT或UU。t代表脱氧胸腺嘧啶dT。X优选代表tt。本发明的小分子干扰RNA是主要针对survivin基因丌放阅读框(ORF)的功能保守区设计的双链siRNA，药理试验证明本发明的小分子干扰RNA具有广谱的抑制肿瘤迁移作用，对MDA-MB-435、胃癌MGC-803、肝癌SMMC-7721细胞在体外均有抑制它们迁移作用，该序列的正义链与survivin基因的mRNA结合，干扰survivin基因mRNA的翻译，从而抑制肿瘤细胞迁移，达到抑制肿瘤扩散的目的。本发明是一种全新作用机制的制肿瘤细胞迁移的新型药物，可能为肿瘤的治疗带来了新的希望。本发明所述的肿瘤疾病包括乳腺癌、胃癌、肝癌细胞。在临床使用中，可以将本发明小分子干扰RNA(简称YCUsiRNA2)溶于不含RNA酶的无菌水中，轻轻混匀，建议YCUsiRNA2为10微克/微升。取适量YCUsiRNA2与小分子干扰RNA转染试剂RNAi-Mate混合，在室温温育30分钟，以形成YCUsiRNA2-RNAi-Mate复合物。将制备好的YCUsiRNA2-RNAi-Mate复合物按5-500nmol/kg静脉给药，一天一次，20天左右一个疗程。具体实施例方式头'施例1siRNA的设计与合成仪器OligoPilotIIDNA/RNASynthesizer(瑞典Pharmacia公司)，HP-1100型高效液相色谱仪(美国惠普公司)，DU2640紫外分光光度计(美国Backman公司)。材料和试剂合成柱(6.3mL)，分子筛(3ASigma)，30HL载体(批号256723)，RNAPacPA100分析柱(美国Dionex公司)，5种核苷酸单体(A,U，C，G,dT),乙腈，二氯乙酸，四唑,N2甲基咪唑，除注明厂家外，其余为瑞典Pharmacia公司产品。siRNA的设计根据survivin基因丌放阅读框(ORF)的序列，设计小分子干扰RNAYCUsiRNA2和1对负对照siRNA，将他们的序列在人类EST数据库中比对，确定没有与他们相同的其它基因序列。YCUsiRNA2正义链正义链5'-AGAAUUUGAGGAAACUGCGtt-3'，反义链5'-CGCAGUUUCCUCAAAUUCUtt-3'。负对照siRNA的正义链5，-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'，反义链5，-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3，。siRNA的设计后送上海吉马公司合成。siRNA的化学合成用乙腈将5种单体(A，U,C,G，dT)配制成0.2mol/L溶液，分别将5种单体、乙腈、二氯乙酸、四唑安装到合成仪相应位置，其中单体、乙腈、四唑应加入适当分子筛。合成歩骤(1)利用二氯乙酸处理结合于固相载体的核苷酸或寡核苷酸，脱去其5'羟基官能团上的二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基团，露出反应性的5'端；(2)偶联反应山四唑催化完成，形成3'—5'磷酸酯链；(3)封闭反应将未反应5'羟基在N2甲基咪唑催化下由乙酸酐来完成。RNA合成仪按照设计好的程序合成出YCUsiRNA2和负对照siRNA的单链RNA。应用紫外分光光度计检测D260nm值，并计算产量。合成粗产品的HPLC色谱分析色谱柱DNA2PacPA2100(4mmX250mm);样品20OD/mL,进样的量20UL;流动相A:25腿ol/LTris，1mmol/LEDTA，10%乙腈,pH8;流动相B:25mmol/LTris,1mmol/LEDTA，3mol/LNH4C1，pH8;洗脱梯度流动相B在40min内从10%到70%;流速1mL/min;检测波长260nm;柱温50。C。合成的单链RNA的正义链和反义链后，退火成双链的YCUsiRNA2和负对照siRNA，之后进行HPLC纯化的纯度大于97%的双链YCUsiRNA2和负对照siRNA。实施例2YCUsiRNA2改变肿瘤细胞与IV型胶原蛋白间黏附能力实验材料—人胃癌细胞MGC-803人乳腺癌细胞株MDA-MB-435人肝癌细胞株SMMC-772124孔培养板Thincert侵袭小室(孔径8pm)主要试剂RPMI1640培养基干粉胰蛋白酶MTT主要仪器水平电泳槽恒温振荡器中国药科大学肿瘤药理实验室中国药科大学肿瘤药理实验室中国药科大学新药筛选中心Corning公司Greiner公司Gibco公司Amcrsco公司Sigma公司南京大学仪器厂上海智诚分析仪器制造公司荧光倒置显微镜Leica公司实验方法肿瘤细胞与IV型胶原蛋白间黏附能力的检测参照He订en等的方法，采用MTT法测定癌细胞与IV型胶原蛋白间的黏附能力。具体操作如下IV型胶原蛋白包被96孔培养板将IV型胶原蛋白储液用PBS稀释成0.1mg/mL，按50^L/孔加入到96孔培养板中，4。C过夜后再于37。C下孵育2h，然后吸去上情。用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1.5X104个/孔接种到己包被IV型胶原蛋白的96孔培养板中；于37'C，5。/。CO2条件下培养0.5h后，将细胞分为两组(1)黏附细胞组，用PBS小心洗涤23遍除去未黏附的细胞，然后采用MTT法测定黏附细胞的吸光度值；(2)总细胞组，不用PBS洗涤，直接采用MTT法测定吸光度值(A)。每组设6个平行孔。同时，测定IV型胶原蛋白包被但未接种细胞的孔作为空白对照(control)。按照如下公式计算黏附率(Adhesionrate):n化"a八iAtdhaac'liAcawrei、，lrmn/Adhe加nfate(%)=1--^-^->■100%实验结果表l小分子干扰RNA改变肿瘤细胞对IV型胶原蛋白间黏附能力Ceii/YCUsi隨2QnM25nM50nM100nM150nM200nMMDA-MB-435100%44.0**±3.1%33.9**±1.7%22.5**±2.1%18.6**±1.9%15.1**±3.0%MGC-803100%75.1*±3.5%61.0**±2.7%56.8**±1.8%51.2**±3.1%36.4**±1.7%SMMC-7721i00o/o80.2±3.2%73.2*±0.9%66.8*±2.3%63.9*±1.7%57.1**±2.0%注n=8,mean±SD,重复3次，*为卩<0.05(有显《差异)；"为P〈0.01(有极显^差异)实验结果表明小分子干扰RNA能明显改变乳腺癌细胞MDA-MB-435、胃癌细胞MGC-803和肝癌细胞SMMC-7721对IV型胶原蛋白间黏附能力。实施例3YCUsiRNA2抑制肿瘤细胞二维水平细胞迁移能力实验材料与主要试剂实施例2二维水平细胞迁移实验参照Nakayama等的方法，采用划痕损伤模型分析小分子干扰RNA在二维水平上对肿瘤细胞的迁移能力的影响，操作歩骤如下(1)用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按6乂104个/孔接种到24孔培养板中，于37°C，5%C0条件下培养；(2)次R，待细胞长成均匀单层后，用无菌的1000nL移液器吸头延孔的中轴线轻轻划过。用37'C预热的PBS轻轻洗涤23遍除去漂起的细胞残骸后，加入37'C预热的培养基，放入培养箱中继续培养；(3)培养0.5lh后(待细胞恢复)，以这一时间作为零时间点，分别在O、12、24h时通过倒詈显微镜下(50X)观察细胞迁移情况并利用目镜刻度尺测量划痕宽度(S)，每孔测量5处(即两端、中点、左l/4处和右l/4处)求平均值，直至细胞完全汇合。每组细胞均设三个平行孔。按照如下公式计算细胞迁移率(Migrationrate):s—stimezero"tunepomtMigrationrate(%)=^X100%。hmezeio表lYCUsiRNA2抑制乳腺癌、胃癌、肝癌细胞二维水平细胞迁移能力乳腺癌MDA-MB-435胃癌细胞MGC-803肝癌细胞SMMC-7721<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实验结果表明小分子干扰RNA能明显改变乳腺癌细胞MDA-MB-435、胃癌细胞MGC-803和肝癌细胞SMMC-7721二维水平细胞迁移能力。实施例4YCUsiRNA2抑制肿瘤细胞三维水平细胞迁移能力实验材料与主要试剂实施例2采用侵袭小室模型分机小分子千扰RNA在三维水平上对肿瘤细胞的迁移能力的影响，具体操作如下(1)将细胞用无血清DMEM培养基培养12h后，用0.25%胰蛋白酶消化、无血清RPMI-1640培养基制备单细胞悬液，调整浓度为2.5X105个/mL;(2)向24孔培养板中加入600含0%小牛血清的RPMI-1640培养基，然后将Thincert侵袭小室浸入，再向小室中加入200nL无血清单细胞悬液(即5.0乂104个细胞)；(3)37°C，5%C02培养20h后，取出Thincert小室，用棉签小心将膜上表面的细胞擦拭去除；(4)用手术刀片小心沿小室边缘将膜切下，把膜下表面向上放在一个洁净的24孔培养板的孔中；(5)将膜用甲醇冰醋酸(3:1)固定10min，然后用10%姬姆萨染液染色1530min;将膜用蒸馏水漂洗干净后在倒詈显微镜下(200X)随机选取6个视野(上、下、左、右各一，中央两个)计数细胞(呈紫红色)。表lYCUsiRNA2抑制乳腺癌、胃癌、肝癌细胞三维水平细胞迁移能力乳腺癌MDA-MB-435胃癌细胞MGC-803肝癌细胞SMMC-7721负对照R100nm负对照R100nm负对照R100nm127.858.3197.6162.6111489916.717.439.635.213.6m6肌SD29.6实验结果表明小分子干扰RNA能明显改变乳腺癌细胞MDA-MB-435、胃癌细胞MGC-803和肝癌细胞SMMC-7721三维水平细胞迁移能力。一种基因耙向的小分子干扰RNA在制备抑制肿瘤迁移药物中的新用途序列<110〉申请人姓名宜春学院<120〉发明名称一种基因靶向的小分子干扰RNA在制备抑制肿瘤迁移药物中的新用途〈160〉序列表中序列的个数6〈210〉序列相对应的序列标识符1〈211〉序列长度21〈212〉序列的类型RNA〈213〉生物体人工序列〈400〉序列标识符1AGAAUUUGAGGAAACUGCGtt〈210〉序列相对应的序列标识符2〈211〉序列长度21〈212〉序列的类型RNA〈213〉生物体人工序列〈400〉序列标识符2CGCAGUUUCCUCAAAUUCUtt〈210〉序列相对应的序列标识符3〈211〉序列长度21〈212〉序列的类型RNA〈213〉生物体人工序列〈400〉序列标识符3AGAAUUUGAGGAAACUGCGTT〈210〉序列相对应的序列标识符4〈2.11〉序列长度21〈212〉序列的类型RNA〈213〉生物体人工序列〈400〉序列标识符4CGCAGUUUCCUCAAAUUCUTT〈210〉序列相对应的序列标识符5〈211〉序列长度21〈212〉序列的类型RNA〈213〉生物体人工序列〈400〉序列标识符5AGAAUUUGAGGAAACUGCGUU〈210〉序列相对应的序列标识符6〈211〉序列长度21〈212〉序列的类型RNA〈213〉生物体人工序列〈400〉序列标识符6CGCAGUUUCCUCAAAUUCUUU权利要求1、一种双链小分子干扰RNA，其特征是由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成正义链5′-AGAAUUUGAGGAAACUGCGtt-3′，反义链5′-CGCAGUUUCCUCAAAUUCUtt-3′其中X代表tt、TT或UU。2、权利要求1的双链基因靶向的小分子干扰RNA，其中X代表tt，t为脱氧胸腺嘧啶。3、权利要求1或要求2的双链基因靶向的小分子干扰RNA在制备抑制肿瘤转移药物中的用途。其特征在于所还的基因靶向的小分子干扰RNA可以改变乳腺癌、胃癌、肝癌细胞的黏附力，显著抑制乳腺癌、胃癌、肝癌细胞的迁移能力。4、权利要求3所述的特征在于基因靶向的小分子干扰RNA可以改变乳腺癌、胃癌、肝癌细胞对IV型胶原蛋白的黏附力，抑制乳腺癌、胃癌、肝癌细胞二维、三维水平上的迁移能力。5、权利要求3或要求4所还的特征在于可以制备抑制肿瘤转移药物。全文摘要本发明涉及一种基因靶向的小分子干扰RNA在制备抑制肿瘤转移药物中的用途，这种基因靶向的小分子干扰RNA可以沉没survivin基因表达，可以改变乳腺癌、胃癌、肝癌细胞的黏附力，显著抑制乳腺癌、胃癌、肝癌细胞的迁移能力。可以改变乳腺癌、胃癌、肝癌细胞对IV型胶原蛋白的黏附力，抑制乳腺癌、胃癌、肝癌细胞二维、三维水平上的迁移能力。这种基因靶向的小分子干扰RNA可以制备抑制肿瘤转移的药物。文档编号C07H21/02GK101445537SQ200810136600公开日2009年6月3日申请日期2008年12月24日优先权日2008年12月24日发明者陆云华申请人:宜春学院