Gspe在治疗细胞钙超载损伤靶向药物中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于医药技术领域，具体涉及一种GSPE在治疗细胞钙超载损伤靶向药物中的应用。
【背景技术】
[0002]已知钙离子通道Orai 1介导的钙池可控性钙通道或钙离子释放活化钙通道(store-operated calcium/calcium release activated calcium, SOC/CRAC)是非兴奋性细胞钙离子内流的主要机制。革兰氏阴性细菌及其释放的内毒素造成的菌血症、内毒素血症直接作用于血管内皮细胞，导致血管内皮细胞损伤及功能障碍，毛细血管通透性增加，炎症介质释放，启动脓毒症的发生，因此血管内皮细胞受损是脓毒症发生的始动信号，居于中心环节。在此背景基础上，我们创新的发现:0rail介导的钙池可控性钙离子内流机制(store-operated calcium entry, S0CE)直接造成全身毛细血管内皮细胞|丐超载损伤，启动脓毒症的发生。而针对Orai 1的靶向性药物可以有效的阻断Orai 1介导的S0CE机制，从而逆转血管内皮细胞钙超载损伤，有效的治疗脓毒症。葡萄籽原花青素提取物GSPE(grapeseed procyanidin extract, GSPE)的主要作用具有抗氧化和抗炎症反应，但对细胞|丐离子代谢的作用没有报道。
【发明内容】
[0003]针对现有技术对治疗脓毒症存在的技术难题，本发明的目的在于提供一种GSPE在治疗血管细胞钙超载损伤靶向药物中的应用。
[0004]本发明具体通过以下技术方案实现:
本发明提供了 GSPE在治疗细胞钙超载损伤靶向药物中的应用。
[0005]本发明所述细胞钙超载损伤为致脓毒症血管内皮细胞钙超载损伤。
[0006]本发明所述GSPE预处理的Orail表达正常的小鼠脓毒症模型，发现Orail显著被抑制，脓毒症小鼠的血管内皮细胞钙超载被显著逆转，从而证明GSPE是Orai 1的天然的特异性抑制剂，能阻断Orail介导的S0CE信号，逆转脓毒症Orail介导的细胞钙超载损伤。
[0007]本发明所述GSPE对LPS经典的信号通路TLR4、NFkB没有影响，特异性阻断Orail信号，实现阻断钙超载信号的目的。
[0008]本发明首次提供了Orai 1介导的S0CE机制是GSPE阻断小鼠肺血管内皮细胞钙超载损伤的药物作用靶点。
[0009]所述的GSPE在制备治疗脓毒症靶向药物中的应用，以治疗脓毒症血管内皮细胞钙超载损伤。
[0010]本发明所述的GSPE还可加入其它治疗脓毒症的药物中，起到靶向作用，其中所述的其它治疗药物为抗感染类药物或重组人活化蛋白C，所述抗感染类药物为抗生素类、抗真菌类、抗病毒类、抗支原体类、抗肿瘤类或免疫抑制剂;其中所述抗生素类为β-内酰胺类、氨基糖甙类、四环素类、酰胺醇类或大环内脂类，所述抗真菌类为多烯类、三唑类、嘧啶类或棘白菌素类。
[0011]本发明所述GSPE可和适量药学上可以接受的载体制备成药物制剂，其中所述药用载体可以是pH缓冲系统，渗透压调节剂，防腐剂，稳定剂等辅助成分，优选自:磷酸钠(Sodium Phosphate)、琥泊酸钠(SodiumSuccinate)、组氨酸(Histidine)、甘露醇(Mannitol)、聚山梨醇酯 20/80(Polysorbate20/80)、氯化钠(30(1;[1111101101^(16)、鹿糖(Sucrose)、三轻甲基氨基甲烧(Trometamol)和乳糖等。
[0012]本发明所述的药物制剂为溶液制剂或干粉制剂，所述药物制剂的给药形式为静脉给药，皮下注射，腹腔内注射或肌肉注射。
[0013]本发明的有益效果为:首次发现Orai 1介导的S0CE机制是GSPE阻断小鼠肺血管内皮细胞钙超载损伤的药物作用靶点，经试验证明，GSPE预处理的脓毒症小鼠肺血管内皮细胞Or a i 1表达被显著抑制，而T L R4、NF kB表达则没有被抑制，因此证明G S PE特异性抑制Orail，阻断Orail介导的S0CE机制，抑制细胞外钙离子内流，从而逆转细胞钙超载损伤。
【附图说明】
[0014]以下结合附图所示实施例的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。
[0015]图1为GSPE对脓毒症小鼠肺血管内皮细胞表达0ra1、TLR4、NFkB水平的影响。
[0016]图2为GSPE对脓毒症小鼠肺血管内皮细胞钙离子内流的影响。
[0017]图3为GSPE对脓毒症小鼠的死亡率的影响。
【具体实施方式】
[0018]下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0019]本研究采用基因敲除的方法构建Orai1基因表达缺陷的BALB/c小鼠模型，采用盲肠结扎穿孔CLP方法复制BALB/c小鼠腹腔感染脓毒症模型。应用钙成像及分子生物学的方法确定Orail介导的S0CE是参与脓毒症细胞钙超载损伤的主要机制。LPS通过识别和活化TLR4信号、NFkB信号，进一步活化Orail信号，启动Orail介导的S0CE，引发细胞外钙离子内流机制，导致脓毒症血管内皮细胞钙超载损伤。应用GSPE预处理的Orail表达正常的小鼠脓毒症模型，发现Orai 1显著被抑制，脓毒症小鼠的血管内皮细胞钙超载被显著逆转，从而证明GSPE是Orail的天然的特异性抑制剂，能阻断Orail介导的S0CE信号，逆转脓毒症Orail介导的细胞钙超载损伤。
[0020](一)实验材料:
1、构建Orai 1基因敲除小鼠模型:采用RNA干扰技术原理，成功敲除的Orai 1基因，制备Orail基因表达沉默小鼠，并获得子代，通过鉴定符合Orail基因表达缺陷。
[0021]2、构建Or a i 1基因表达缺陷的脓毒症小鼠模型:采用CLP法(盲肠结扎穿孔)构建Orai 1表达缺陷的脓毒症动物模型。
[0022]3、获得原代血管内皮细胞(HUVEC细胞)、以及原代腹腔巨噬细胞:摘取脓毒症小鼠肺组织分离小鼠肺血管内皮细胞;采用腹腔灌洗法获取小鼠腹腔巨噬细胞。
[0023]4、葡萄籽原花青素提取物GSPE，浓度200mg/kg，具有抗氧化和抗炎症的功效。
[0024]5、0rai 1、TLR4、NFkB抗体，钙离子荧光探针，钙成像仪等。
[0025](二)实验原理:
l、0rail基因缺陷表达的脓毒症小鼠原代肺微血管内皮细胞和腹腔巨噬细胞的获得原理:
A)获得Orai 1基因敲除小鼠:利用基因打靶技术和RNA干扰技术构建BAB/c小鼠Orai 1纯合子表达缺陷小鼠，委托广州赛业有生物技术有限公司给予构建和鉴定。Orail基因缺陷的小鼠的特点是肺血管内皮细胞膜S0C钙离子通道被关闭，细胞外钙离子无法通过S0C进入细胞内从而完成细胞钙内流。
[0026]B)0rail表达缺陷小鼠脓毒症模型建立:采用盲肠结扎穿孔(CLP)实验的原理，在麻醉状态下给予Orail表达缺陷小鼠开腹手术，暴露盲肠，对盲肠用4号注射器针头进行穿刺打孔，并横向贯穿盲肠，并使适量肠内容物流出，结扎盲肠，还纳经过穿孔并结扎的盲肠于腹腔，逐层关腹，手毕腹腔注射500ul无菌生理盐水进行液体复苏，然后正常饲养，观察小鼠的死亡率。CLP模型小鼠的死亡率为90%以上。
[0027]C)获得脓毒症小鼠肺血管内皮细胞:采用酶消化、免疫磁珠二次分选法分离纯化小鼠原代肺微血管内皮细胞。根据Orai 1是否被敲除，分离Orai 1基因敲除小鼠肺微血管内皮细胞，以及Orail基因表达正常的小鼠肺微血管内皮细胞。
[0028]D)获得脓毒症小鼠腹腔巨噬细胞:采用腹腔灌洗的方法收集获得脓毒症小鼠原