对玉米中的特定基因座的精确基因靶向的制作方法
【专利说明】对玉米中的特定基因座的精确基因靶向
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年12月13日提交的美国临时专利申请No. 61/736856和2013 年5月07日提交的美国临时专利申请No. 61/820231的优先权。前述每篇的全部内容在此 通过提及完整收入本文。 发明领域
[0003] 本公开内容涉及经由使用锌指核酸酶将外来多核苷酸靶向稳定整合入玉米基因 组的一个特定基因座中。
[0004] 提及电子提交的序列表
[0005] 序列表的正式拷贝以ASCII格式序列表经由EFS-Web电子提交，并且与说明书同 时提交，其中文件命名为"74381_ST25. txt"，在2013年11月26日创建，并且具有23. 7千 字节的大小。此ASCII格式文件中含有的序列表是说明书的一部分，并且通过提及完整收 入本文。
[0006] 发明背景
[0007] 玉米事件DAS-59132的基因组基因座记载于美国专利8, 273, 535, METHODS FOR DETECTION OF CORN EVENT DAS-59132。转基因表达盒作为全长T链插入物整合入 Hi-II玉米种质的B73玉米基因组衍生区的染色体8(0.0.3〇即8七&(1，￥丄.？6七618611，(1 L.Armstrong，Ame;rican Journal of Botany, Vol. 79, PP. 761-764, 1992)中。另外，转基因 基因座周围的基因组DNA相对于天然B73序列缺乏任何大的缺失，并且除了单一小重复元 件外一般缺乏重复元件。广泛的田间研究揭示了事件的存在没有不利影响携带该事件的 植物的正常生长和发育。此外，含有该事件的玉米系保留在农艺学性能上与未转化同种系 (isolines)可比的农艺学和育种特征。因此，整合有玉米事件DAS-59132的基因组基因座 代表一种在玉米中用于靶向整合其它转基因构建体的卓越内源基因组基因座，并且在下文 中称为E32或事件32基因座。
[0008] 植物的靶向性基因组修饰一直是应用和基础研究两者的长期存在且难以捉摸的 目的。正在开发通过位点特异性核酸酶靶向并切割基因组DNA的方法和组合物以达到此目 的。位点特异性核酸酶包括但不限于（锌指核酸酶（ZFN)，大范围核酸酶（Meganuclease)， TALENS 和具有工程化 crRNA/tracr RNA 的 CRISPR/Cas，参见 Burgess ;等；Nature Reviews Genetics 14, 80-81 (February 2013))。例如，可以使用ZFN对基因组基因座的位点特异 性切割来诱导靶向诱变，诱导细胞DNA序列的靶向缺失，并且促进外源供体DNA多核苷酸 在预先确定的基因组基因座内的靶向重组。参见例如美国专利公开文本No. 20030232410 ; 20050208489 ;20050026157 ;20050064474 ;和 20060188987，及国际专利公开文本 No. WO 2007/014275,其公开内容通过提及完整收录用于所有目的。美国专利公开文本 No. 20080182332描述了非规范锌指核酸酶（ZFN)用于靶向修饰植物基因组的用途，并且美 国专利公开文本No. 20090205083描述了 ZFN介导的靶向修饰植物EPSP基因组基因座。另 外，Moehle 等·（2007)Proc. Natl. Acad Sci. USA 104(9) :3055-3060 描述了使用设计的 ZFN 以在规定的基因组基因座处实现靶向基因添加。目前的靶向方法通常牵涉用含有至少一种 转基因的供体DNA多核苷酸和设计为结合并切割特定基因组基因座的位点特异性核酸酶 共转化植物组织。这引起供体DNA多核苷酸稳定插入切割的基因组基因座内，导致在指定 基因组基因座处的靶向性基因添加。
[0009] 发明概述
[0010] 目前要求保护的发明是一种用于将一种或多种功能性外源核酸序列整合入具有 E32基因座的玉米细胞基因组中的方法。该方法包括使用一种或多种包含锌指结合域的锌 指核酸酶在E32基因座中进行双链切割，所述锌指结合域结合选自表1B中显示的组的靶位 点。这导致包含一种或多种外源序列的功能性多核苷酸在E32基因座内整合入玉米细胞基 因组中。任选地，该方法包括表达由一种或多种外源序列编码并控制的基因产物。
[0011] 附图简述
[0012] 图1描绘了设计为结合E32基因座的ZFN的关系。在酵母测定法中鉴定出6个 ZFN(E32 ZFN1-6)，并且将4种ZFN进一步用于在植物中进行评估。
[0013] 图2是pDAB105906的质粒图。
[0014] 图3是pDAB111809的质粒图。
[0015] 图4是pDAB100655的质粒图，并且代表一种典型的供体构建体，其中可以用其它 期望的编码序列（包括但不限于PAT)替换AAD-I区。
[0016] 图5是E32基因座的ZFN基因座破坏图，其中箭头标示破坏的基因组基因座。
[0017] 图6是pDAB108688 (对照载体）的质粒图。
[0018] 图7是pDAB108690(靶向载体）的质粒图。
[0019] 图8显不了用于ZFN破坏qPCR的引物和探针位置。
[0020] 图9是ZFN破坏测定图（上面括号标示非破坏的事件，而下面括号显示破坏的事 件）。
[0021] 图 10 是 pDAB104179 的质粒图。
[0022] 图11显示了用于ZFN破坏qPCR的引物和探针位置。
[0023] 图12是ZFN破坏测定图（上面括号标示非破坏的事件阴性，而下面括号显示破坏 的事件）。
[0024] 图13显示了用于内外（in/out)PCR的引物位置。
[0025] 图14是一种Southern分析策略，其显示了用于探针生成的酶切割位点和引物的 位置。
[0026] 图 15 是 pDAB107855 的质粒图。
[0027] 发明详述
[0028] 用于转化玉米事件DAS-59132的全长DNA分子（PHI17662A)，基因组侧翼序列的 3'端、和PHI17662A/3'玉米基因组接合（junction)记载于美国专利8, 273, 535的公开内 容。E32基因座以SEQ ID N0:1描述，并且指玉米事件DAS-59132的基因组侧翼区，其用于 鉴定用于设计锌指蛋白结合域以插入外源基因的基因组靶序列。这些靶位点包括但不限于 表1B中描述的那些。在鉴定E32基因座为对于插入外源基因高度期望的位置（其为本发 明的一个实施方案）后，鉴定和使用E32基因座内的其它靶位点完全在熟练技术人员范围 内。
[0029] SEQ ID NO: 1以下述序列提供；
[0030] agttgggaaggcaaaacgaatataagtgcattcggattactgtttagtcgagtcatatttaaggaattc attgtaaatgttctaacctaacctaagtattaggcagctatggctgatatggatctgattggacttgatttatccat gataagtttaagagcaactcaaagaggttaggtatatatggttttgtaaaggtaaatttagttaatattagaaaaaa aaagtgtatccaataggctctataaacaactcttcaaatttagtggctttctatccatccacctttgctctctattt ttggatagcctgatttactctctattcagtccgtaggtttaatgagtctgttggattagcctacactttttctgtaa aatctattttagatagtagctaaatcagtaaatttggctagtatttttagctattctcttggagtttgctataagac cagaacatgtaaattggaagtttgtggacccggacgagaatgcatgacaaatccagagtattgatgatggaattcac ctattttacccgactcttccattgtgtccatttctcatcatccccgggcgctttctgcatccggtacagctgacatg acacgttcacgcgttacatggctgatggctcacaagtcacccccacatgtctagtgttcgcccaggcagatcgtcct cggcctgcgctgccgtgctcttgccgccgcttgcttgggccctgctggcgcccgctgccgatcacacggcctacgcg gtgcaggcagcgccaccgaacccgcagtcttgttgtgccgataggtggcagtggcagtggcactggcacggcacgcg atcgatcgctccgctcatctgctgacagtggatagagcagcgttggccgttggggccggatctccgtgaagcggteg tccctgctgtactgtgccgctatggcgtgtcgctttcgccatgttttcttttcttttttttttctttttctttttgc tagggcggtttctcgttcgctggtaacagggaccacttcggttgatccgttgaatttactgaaagagatgggaatgg tcgctgtgcccgggacattgaatgagatgttgtgtaagtgaatatggctttagccttttgcgagtggggcggcaatg cacggcatgaactataatttccggtcaaacttttgtgtggaaatggatgctaaacgaacacaaaccgggtttaaacc agaggccgacacggcacacacggcgacattcaccgccggcttcctccgtcgccactcggcacaaggctcatcagtcg ccgatgcccgatgcgatcaacggaagcggatggcccgcttctttagaattggcacaggaacactggccactgccctt gatgtgcaattatgcctgcgaaagcctaggcaacacacgcgaataaacgagcgaatgacacggaaagctgatgtggt atgaattatacaacattatgggccaaaatattattctatccaccattgtgtagccacagcatcggtatttgagttgt gcgaggacaaatccctcgtgaggtcaaaaacagcaaataataaacccatctcctgaagacaccaaaaaaaaggagca gctcctcgtgtcaatgaacaagcgtcacaagaaaagggagcacgtaaataacctcttcaattgcttcagcatgaaaa gaacgggaagaaatgcaagtctacagaggaaagtgcagctgtttcggctgccatggcaagttcctacatgggcgagg aaaagctgaactggattccagtcttcgcgctgtcatgctcagcttgctttaggatgcggcaatagttcacctggatg aaaaagatacaagttagtcttgaagcagtcgagtggacatccaaagtatcaaaatcgaaagcttgtaaatggggaag gaaatatacctctacccggaaaagtttggtaggcaaaataatcccaacgccagcagagctccggaacgtttgccgaa attcagaagccgaaaagttcttgtactcaccctccgacagtttcgcaaggtttccagcagtaaggaatgcgtggcca tggattccagcgtctctgaatatcttgaggggcagatcaaaagaaaggtcagcgaaggcagacacggccagatcacc tcccaagtaatcccttccagggtcagccgagccactctccgagttattaaggacatgcctccgcgcctctgttgggc caactccccttaatctgaaacccagcagagatgacggtccgcccaagctgcacactggagaagaattacctccaaga taaaacctctctggcactgatgaagtcgaattcatgaatccccctgcaagcggtaaaatgacacccgctcctacacc aacgttgagagcagcactataaaatcccaaaggcacagcaccacgtacatcgaactcctgagagcaaacccaacggc aatatttttgtaatagtgatggtcagaactgagaagatcagataaaattatacactgatgcaattatttcatagttt cgcccatgaactgtaagggctagacaaagcaaaaagtaagacatgaagggcaagagaataacctgccggaaatatct caatcctttgctattccatagaccaccaacttgagaagttgactgaaacgcatatcctttcgttggcctaagatgtg aatccctcttatcaatcttgtatgtgtacttcaatgcagaaagaaggttatgccctaactgcctccttatggccttt gatgagacacgtgatggatcagttaaggtacgccacgcaaggttgtatgacaagtcatggttccttgttgacagca aaccaaatgaaaggccaagtaggcgctccttgtatgatgaaaacttcagccaatcttgtgatgacaaagatgcccg agccatcaatggtgttggtattgatttaaacctcggtaggcagactccaacaccaacctctgttgtttggtcccaa ccaaaggatcctgatgcatcccagatgtcaccatagccaaacaagttcttcaacttaagtgacccttccagcgacca agatcttgcctacaagagtggcaagcacagtca
[0031] 本公开内容进一步涉及使用ZFN和基因供体构建体靶向整合入玉米E32基 因座中的方法和组合物。除非另有指示，本文中公开的方法的实施以及组合物的制备 和使用采用在本领域技术内的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、 细胞培养、重组DNA及相关领域中的常规技术。在文献中完整解释了这些技术。参见 例如 Sambrook 等.MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 和第 3 版，2001 ;Ausubel 等·，CURRENT PROTOCOLS IN M0LECULARBI0L0GY, John Wiley&Sons, New York, 1987 和定期更新；呈系列的 METHODS IN ENZYM0L0GY，Academic Press,San Diego ;Wolfe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,第 3 版，Academic Press, San Diego, 1998 !METHODS IN ENZYM0L0GY, Vol. 304, "Chromatin" (P. M. Wassarman and A. P. Wolffe，eds.)，Academic Press, San Diego, 1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY，Vol.ll9，"Chromatin Protocols"(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999。
[0032] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语还适 用于其中的一种或多种氨基酸是相应天然存在氨基酸的化学类似物或经修饰的衍生物的 氨基酸聚合物。
[0033] "结合"指大分子间（例如蛋白质与核酸之间）的序列特异性、非共价相互作用。并 非结合相互作用的所有组分需要是序列特异性的（例如与DNA主链中的磷酸酯残基接触）， 只要相互作用整体上是序列特异性的。此类相互作用一般以10 6M或更低的解离常数为特 征。"亲和力"指结合强度：升高的结合亲和力与较低的结合常数（Kd)相关联。