使用雄激素靶向疗法用于治疗肿瘤性疾病的生物标记物的制作方法
【专利说明】使用雄激素靶向疗法用于治疗肿瘤性疾病的生物标记物
[0001 ] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年8月12日递交的美国临时专利申请61/865，038，2014年5月8日 递交的美国临时专利申请61 /990，5 70和2014年5月2 2日递交的美国临时专利申请6 2/00 2， 110的优先权，其全部内容在此通过引用并入本申请。
[0003] 发明背景
[0004] 癌症是人类健康的主要负担，估计占每年全部死亡人数的13%。特别是，几种常见 的癌症和疾病都与雄激素激素信号相关联，例如，前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺 癌和多囊卵巢病。例如，前列腺癌(PCa)是男性的第二大常见癌症。大多数前列腺癌导致的 死亡是由于转移性疾病的发展，其对常规雄激素剥夺疗法没有响应。自1940年以来，雄激素 剥夺疗法一直是患有前列腺癌的对象的标准治疗方法。尽管阻断了雄激素，大多数对象最 终仍出现病情恶化。多年来该疾病的晚期阶段被称为"激素不敏感性前列腺癌"或"雄激素 非依赖性前列腺癌"。已经很清楚，雄激素剥夺治疗后出现的前列腺癌仍依赖于雄激素。存 活的前列腺癌细胞获得了导入低水平的循环雄激素(从肾上腺表达)的能力，变得对这些低 水平的睾酮敏感得多，并且在前列腺癌细胞本身内部实际上合成了睾酮。前列腺癌的这个 阶段，现在被称为"去势抵抗性前列腺癌"或CRPC。
[0005] 识别对前列腺癌的治疗可能会有响应或正在响应的那些患者是对这种疾病进行 医疗管理的目标。虽然目前的临床指导原则都集中在症状、前列腺特异性抗原(PSA)的血液 水平和成像研究上，但其它生物标记物也可能对临床决策有用。仍需要针对该疾病的生物 标记物和它们与识别治疗性化合物的功效或毒性之间的关系，和可以提供关于最可能对治 疗剂有响应的患者的识别信息的生物标记物，或用以识别正在接收治疗剂却没有响应的患 者(无论是通过原生性或获得性耐药机制），或预测那些可能会产生不良副作用的患者。
[0006] 发明简述
[0007] 下面所列的各生物标记物可以用于，例如，在治疗患者的过程中各个点评估治疗 方案。例如，可以使用生物标记物在不同的癌症治疗转变点通过对一个或多个生物标记物 或生物标记物群组的分析以识别和优化治疗选择，从而评估治疗方案。生物标记物也可以 用于预测在同一患者体内对现有抗癌治疗无反应或缺乏反应以及对盖乐特龙 (galeterone)的响应。在一个实施方案中，在前列腺癌的治疗中进行生物标记物检测并将 其与盖乐特龙(galeterone)的功效相关联。
[0008] 提供了一种治疗需治疗患者体内疾病的方法，包括:a)确定该疾病是否以雄激素 受体的改变形式为特征;和b)如果所述雄激素受体的改变形式存在时，给予所述对象包含 治疗有效量的式I化合物的药物组合物，
[0010]或其药学上可接受/的盐、N-氧化物、活性代谢物、前药、或溶剂化物;其中R^H或 乙酰基;R2是苯并咪唑。
[0011 ]例如，办是乙酰基，所述化合物是盖乐特龙的前药。
[0012] 例如，办是!1并且R2是苯并咪唑，该化合物为盖乐特龙。
[0013] 本发明提供了在需治疗的患者中治疗癌症的方法，其包括:a)从所述患者获得样 品，例如循环肿瘤细胞的样品；b)确定雄激素受体的截短形式是否是存在于样品中，例如 ARV-7或AR-V567es;和c)如果所述雄激素受体的改变形式存在时，给予所述对象包含治疗 有效量的式I化合物的药物组合物，
[0015] 或其药学上可接受的盐、N-氧化物、活性代谢物、前药、或溶剂化物;其中心是!1或 乙酰基;R2是苯并咪唑。例如，办是11，1? 2是苯并咪唑，化合物是盖乐特龙。在一些实施方案中， 雄激素受体的改变形式是缺乏配体结合域的截短的AR，例如ARV-7。所述确定可以包括，例 如，使用能结合雄激素受体的配体结合域的抗体，从而所述抗体结合的缺失导致信号缺失。 所述确定还可以包括使用两种抗体，例如一个用于AR的NH 2端并且另一个用于AR的C00H端 (配体结合域），以区分或获得存在NH2端与不存在C00H端(配体结合)的比率。在一个优选的 实施方案中，分析结果是相同的对象样品中的NH 2端和C-端的抗体检测信号的比率。所述确 定还可以包括通过定量或定性的核酸扩增或通过基因表达分析来检测缺乏配体结合域的 截短的AR。在一个实施方案中，对缺乏配体结合域的截短AR的检测是来自患者或对象的样 品，例如其中已经对所述患者/对象样品进行了循环肿瘤细胞富集。在另一个实施方案中， 对患者/对象样品进行了循环DNA富集。在又一个优选实施方案中，所述患者/对象样品是肿 瘤活检或组织样品。
[0016] 在一些实施方案中，所述疾病是前列腺疾病，例如前列腺癌。前列腺癌可以是去势 抗性的。在某些情况下，对象已经经历过去势治疗，例如化学去势或外科去势，或已经历雄 激素受体拮抗剂治疗或减少新生雄激素产生的治疗，例如干扰类固醇通路，例如CYP-17裂 解酶抑制剂，或联合治疗。在一些实施方案中，所述疾病是癌症，诸如卵巢癌、膀胱癌、胰腺 癌或乳腺癌。所述癌症可以是对抗雄激素剂(如雄激素受体拮抗剂)有抗性的，例如对恩杂 鲁胺（enzalutamide)或比卡鲁胺（13；^311^3111丨(16)或41^-509有抗性。所述癌症可以是对 CYP17裂解酶抑制剂有抗性的，例如，对阿比特龙(abiraterone)有抗性。所述癌症可以是对 紫杉烷有抗性，例如多西紫杉醇或卡巴他赛。在一些实施方案中，所述疾病对雄激素依赖。
[0017 ]患者可以确定为具有突变的雄激素受体，例如截短的AR如AR-V1、AR-V2、AR-V3、 AR-V4、AR-V5、AR-V567es、AR-V6、或AR-V7。突变的AR可以携带点突变，例如T877A(T878A)、 D879G(D878G)、W741C、W741L、M749L、R629Q、G142V、P533S、T575A、H874YSF876L。
[0018]本发明还提供一种优化对需治疗患者体内疾病的治疗的方法，包括:识别正使用 治疗方案对疾病进行治疗的患者，其中所述治疗方案包括给予式I的化合物：
[0020]或其药学上可接受的盐、N-氧化物、活性代谢物、前药、或溶剂化物;其中心是!1或 乙酰基;R2是苯并咪唑；确定至少一个生物标记物的状态；以及基于对所述生物标记物的确 定，维持或修改治疗方案。在一个优选的实施方案中，心是11并且R 2是苯并咪唑。
[0021 ]例如，所述生物标记物是雄激素受体的表达水平或功能，例如野生型或突变的AR。 突变的AR可以是剪接变体和/或截短的AR，包括AR-V1、AR-V2、AR-V3、AR-V4、AR-V5、AR-V567es、AR-V6、或AR-V7。突变的AR可以是具有点突变的AR，包括但不限于，T877A(T878A)、 D879G(D878G)、W741C、W741L、M749L、R629Q、G142V、P533S、T575A、H874Y、F876L。
[0022] 在一些实施方案中，所述疾病是前列腺疾病，例如前列腺癌。前列腺癌可以是去势 抗性的。在一些实施方案中，所述疾病是癌症，诸如卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌或乳腺癌。所述 癌症可以是对抗雄激素剂（如雄激素受体拮抗剂）有抗性的，例如对恩杂鲁胺 (enzalutamide)或比卡鲁胺或ARN-509有抗性。所述癌症可以是对紫杉烧类有抗性的，例如 多西紫杉醇或卡巴他赛。在某些情况下，对象已经经历过去势治疗或已经经历过雄激素受 体拮抗剂治疗，或两者同时治疗。在一些实施方案中，所述疾病是雄激素依赖性疾病。
[0023] 生物标记物也可以是循环肿瘤细胞数量的减少，例如其中所述循环肿瘤细胞数量 是在盖乐特龙(galeterone)治疗至少一周之后确定的。合适的生物标记物包括，但不限于： 细胞凋亡的CTC增加;PSA的减少或PSA倍增时间的降低;PSMA表达的增加；肿瘤 18F-DHT-PET 信号的降低;基于组织活检的测试，例如ProMark;蛋白体降解通路成员的存在或表达;5-激 肽释放酶组;治疗前的和治疗后的睾酮血浓度;在治疗方案开始后的至少一个类固醇的水 平的变化;代谢标记物，例如P450酶的水平;CYP17蛋白的突变或变体;CTLA-4阻断的确定； 前列腺健康指数;PCA3的存在或水平;前列腺核有丝分裂测试;在细胞循环进展基因中的突 变的存在；由血清学试验来确定的血红蛋白、乳酸脱氢酶、或碱性磷酸酶的水平;和对化学 疗法的抗性(包括恩杂鲁胺或阿比特龙、比卡鲁胺或ARN-509)。
[0024] 通过引用并入
[0025]所有在本说明书中提及的出版物、专利和专利申请在此通过引用并入本发明中， 就如同每个独立的出版物、专利或专利申请被详细的并且单独的通过引用并入一样。
[0026]附图的简单说明
[0027]本发明的新颖特征具体阐述在所附的权利要求中。通过参考下面的阐明说明性实 施例(应用了本发明的原理)的详细描述以及所附的附图，可以更好地理解本发明的特征和 优点：
[0028]图1描绘了雄激素受体(AR)及其可变剪接变体。
[0029] 图2表明了盖乐特龙(galeterone)下调全长和剪接变体AR，并减少CWR22rvl细胞 系的细胞增殖。
[0030]图3表明了盖乐特龙(galeterone)克服由于AR剪接变体产生的对阿比特龙和恩杂 鲁胺(enzalutamide)的抗性。盖乐特龙，而不是恩杂鲁胺(enzalutamide)，降低了全长和剪 接变体AR-V7蛋白。
[0031] 图4表明了盖乐特龙(galeterone)在CWR22rvl细胞系中同时降低了全长和AR-V7 蛋白。
[0032] 图5表明了盖乐特龙(galeterone)在用AR-V7剪接变体转染的DU145细胞中降低了 AR-V7〇
[0033] 图6表明了在72小时的曝露时间内，盖乐特龙(galeterone)减小全长和剪接变体 AR-V7〇
[0034] 图7描绘了对去势有抗性和对恩杂鲁胺(enzalutamide)有抗性的细胞系的增殖。 [0035]图8描绘了对去势有抗性和对恩杂鲁胺(enzalutamide)有抗性的细胞系对盖乐特 龙(galeterone)的响应。
[0036] 图9A描绘了LNCaP和对恩杂鲁胺(enzalutamide)有抗性的LNCaP细胞的雄激素受 体(AR)和前列腺特异性抗原(PSA)的蛋白质免疫印迹。
[0037] 图9B描绘了盖乐特龙（galeterone)在对恩杂鲁胺（enzalutamide)有响应和对恩 杂鲁胺(enzalutamide)有抗性的LNCaP细胞中对AR和PSA蛋白水平的作用。
[0038]图10描绘了在存在或不存在恩杂鲁胺(enzalutamide)的情况下，用合成雄激素处 理的细胞内雄激素受体的定位。
[0039] 图11描绘了在恩杂鲁胺（enzalutamide)或盖乐特龙（galeterone)存在或不存在 的情况下，用合成雄激素处理的CPRC细胞系内雄激素受体的定位。
[0040] 图12描绘了在恩杂鲁胺（enzalutamide)或盖乐特龙(galeterone)存在或不存在 的情况下，用合成雄激素处理的对恩杂鲁胺(enzalutamide)有抗性的细胞系中雄激素受体 的定位。
[0041 ] 图13描绘了在恩杂鲁胺（enzalutamide)或盖乐特龙(galeterone)存在或不存在 的情况下，用合成雄激素处理的对恩杂鲁胺(enzalutamide)有抗性的细胞系中雄激素受体 的定位。
[0042] 图14描绘了用恩杂鲁胺（enzalutamide)或盖乐特龙（galeterone)处理的细胞系 中AR荧光素酶报告基因的活动。
[0043]图15A表明了免疫荧光实验的设计，以使得所使用的测试化合物的核定位可视化。 [0044]图15B描述了图15A中描述的实验的结果，并显示了盖乐特龙(galeterone)，而不 是恩杂鲁胺(enzalutamide )，降低AR核易位。
[0045] 图16表明了对去势有抗性的表达AR-V7的肿瘤对盖乐特龙(galeterone)的响应。 采用RT-PCR在LuCaP136去势抗性的异种移植肿瘤中检测到了 AR-V7。
[0046]图17表明了盖乐特龙(galeterone)下调携带AR-T878A突变的雄激素受体。
[0047]图18表明了盖乐特龙(galeterone)对野生型AR和AR点突变的结合测定结果。
[0048]图19表明了盖乐特龙(galeterone)降低在具有野生型AR的细胞中和具有AR点突 变的细胞中的AR-依赖性基因表达。这些细胞也表达具有F876L突变的AR受体。
[0049] 图20表明了由PSA引起的在CRPC和恩杂鲁胺(enzalutamide)抗性细胞系中的PSA 减少。
[0050]图21描绘的方案示出对AR变体的检测，其中C-末端域已丢失。
[00511图22表明了一个研究的结果，其中用盖乐特龙(galeterone)治疗的具有丢失C-末 端AR的患者(4/4)显示最大的PSA响应(>50%)。
[0052] 发明详述
[0053] 定义
[0054] 本发明所用的"对象"指的是临床试验的患者或对象和更广泛地含有表达的遗传 材料的生物实体。也包括组织(包括活组织检查材料）、细胞和来自对象体内或体外培养获 得的它们的后代。
[0055] "样品"是指从对象中移除的流体、固体或组织，并且包括全血、血清、血浆、组织、 精液、细胞、组织活检、粘液、粪便、骨、牙齿、鼻或喉或脸颊拭子、尿、皮肤、眼泪、器官活检 (肝、肾、结肠、肺、胰腺）、肿瘤活检、或肿瘤组织、循环肿瘤细胞、来自原发肿瘤或转移组织 的外来体(exosomes)。样品还可以包括所收集的来自对象的流体、固体或组织的一部分，例 如循环肿瘤细胞或分析物。"经处理的样品"是指来自对象的流体、固体或组织通过实验室 技术进行处理、处置、或管理以富集分析物。"经处理的全血样品"是指该全血样品通过体外 实验室技术进行处理来分析全血样品的组成部分包括细胞、DNA、RNA、蛋白质、肽、或如下所 述的分析物;例如，在全血样品中发现的细胞可被富集、洗涤、并单独分析;更具体地，循环 肿瘤细胞可以从全血样品中富集并用于生物标记分析，并且这些生物标记物可以包括雄激 素受体的突变形式。另一例子是富集全血样品中的DNA(例如循环DNA或肿瘤细胞DNA)，其可 用于生物标记物分析，并且这些生物标记物可以包括雄激素受体的突变形式。
[0056] 所谓"分析物"是指待分析的样品的物质或组成。示例性的分析物包括一种或多种 以下的一种或多种物质：蛋白质、肽、多肽、氨基酸、核酸、寡核苷酸、mRNA、RNA、微小RNA、长 的非编码RNA、DNA、循环DNA、cDNA、抗体、碳水化合物、多糖、葡萄糖、脂质、气体(例如，氧气 或二氧化碳）、电解质（例如，钠、钾、氯化物、碳酸氢盐、BUN、镁、磷酸盐、钙、氨、乳酸、锌、柠 檬酸盐）、脂蛋白、胆固醇、脂肪酸、糖蛋白、蛋白聚糖、脂多糖、细胞表面标记物(例如，CD3、 0)4、0)8、11^1?、或0)35)、肿瘤标记物(8(^-2、1(卜6741?1(5)、前列腺特异性抗原(？34)、胞质 标记物、治疗剂、治疗剂的代谢物、细胞(例如，全细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、干细胞、白 血细胞、T细胞(例如，显示003、004、008、几21?丄035、或其他表面标记物）、或用一个或多个 具体的标记物识别的另一细胞）。如本发明所用，术语"小分子"是指一种药、药物、药品、或 其它被考虑用于人类治疗用途的化学合成的化合物。如本发明所用，术语"生物的"是指来 源于生物源而非合成的物质，且其被预期用于人类治疗用途。生物标记物可以用作生物体 的特定疾病状态或特定的生理状态的指标的生物物质，通常生物标记物是体液中测量的蛋 白质或其它天然化合物，其浓度反映疾病状态或机能障碍的存在与否或严重程度或所处阶 段，可用于监测治疗疾病或病症或功能障碍的治疗进展，或可作为临床结果或进展的替代 测量。如本发明所用，术语"代谢生物标记"是指一种物质、分子、或合成的或生物衍生的化 合物，其用于确定患者或对象的肝或肾功能的状态。如本发明所用，"基因分型"指的是确定 在特定基因中可能会影响或不影响该特定基因表型的遗传差异的能力。如本发明所用，术 语"表型"是指由基因型设定的作为(代谢或生理的）结果的蛋白质的生物表达。如本发明所 用，术语"基因表达图谱"是指以时间或空间的方式，确定生产的基因产物的速率或量，或在 特定组织中基因转录的活性的能力。如本发明所用，术语"蛋白质组分析"是指蛋白质图样 或阵列，以确定在正常和病变组织中的蛋白质或肽的关键差异。另外的示例性分析物也在 本发明中有所描述。术语分析物还包括样品的组分，所述组分是初始靶分析物用生化方法 扩增的直接产物，如核酸扩增反应的产物。
[0057]联合治疗:如本发明所用的术语"联合治疗"，是指的那些情形:两个或更多不同的 药物试剂以重叠方案施用使得对象同时暴露于两种或多种试剂，或使用时间方案施用从而 使得对象依次暴露于两个或多个试剂。
[0058]给药方案：在本发明中使用的术语"给药方案"，是指一组单位剂量(通常超过一 个），其通过时间周期分隔开单独施用。特定药剂的推荐剂量的集合（即，量、时间、给药途径 等)构成其给药方案。
[0059] 起始:如本发明所用术语"起始"，当其应用于给药方案时，可以被用来指第一次施 用药剂给先前没有接受过所述药物试剂的对象。或者或另外，术语"起始"可被用来指在对 象的治疗期间，施用特定单位剂量的药物试剂。
[0060] 药物试剂:如本发明中所使用的，短语"药物试剂"是指当施用于对象，具有治疗作 用和/或得到所需的生物和/或药理学作用的任何试剂。
[0061] 药学上可接受的酯：如本发明所用，术语"药学上可接受的酯"是指在体内水解的 酯，并且包括那些在人体内易分解，以留下母体化合物或其盐的酯。
[0062] 治疗有效量:术语药物试剂或试剂组合的"治疗有效量"是指试剂以任何医学治疗 的合理益处/风险比，赋予经受治疗的对象治疗效果的量。治疗效果可以是客观的（即，可通 过一些测试或标记物测量的）或主观的（即对象给出的表示或感觉到效果）。治疗有效量通 常以给药方案施用，其可以包括多个单位剂量。对于任何特定的药物试剂，治疗有效量(和/ 或有效给药方案中的适当单位剂量)可以变化，例如，根据给药途径，与其它药剂组合。同 时，具体的治疗有效量(和/或单位剂量)对于任何特定对象可能取决于多种因素，包括所治 疗的病症和病症的严重程度;所使用的具体药剂的活性;所使用的具体组合物;对象的年 龄、体重、一般健康状况、性别和饮