包含靶向部分和触发免疫反应部分的抗肿瘤剂的制作方法

专利名称：包含靶向部分和触发免疫反应部分的抗肿瘤剂的制作方法
本申请要求2003年3月4日提交的美国临时申请No.60/451,253的利益。
背景技术：
现在肿瘤治疗，特别是癌症治疗的方法仍是次最佳的，因为它们常常不能破坏或除去全部肿瘤或癌细胞。此外，由于在靶向细胞以进行破坏或除去中缺乏特异性，所以现在的方法伴发严重的并发症和不良副作用。
开发成功抗肿瘤剂的关键是设计如下试剂的能力，所述试剂能够选择性杀死肿瘤细胞，而对正常组织即使有，也具有相对小的作用。这个目标难以实现，因为瘤组织和正常组织之间性质差异很少。为完成这个目标，研究集中在鉴定可以用作化疗和诊断的免疫靶的肿瘤特异性“标记抗原”。很多肿瘤特异性的或准肿瘤(quasi-tumor)特异性的(“肿瘤相关性的”)标记已被鉴定为可被特异性抗体识别的肿瘤细胞抗原。情况通常是这样的，即肿瘤特异性抗体不会在它们自身当中或自身发挥充分的抗肿瘤作用而使得它们在肿瘤治疗中有用。因此，可以用设计为破坏肿瘤细胞的细胞毒性试剂标记肿瘤特异性抗体。
另一个靶向方法是血管特异性靶向，其中被靶向的是肿瘤脉管系统，而不是肿瘤本身。由于肿瘤脉管系统在所有实体瘤生长和生存中的重要作用，所以它已变为癌症治疗的主要靶(Folkman，J.1997CancerPrinciples and Practice of Oncology.Lippincott-Raven，New York.pp.3075-3087)。这是因为连续的肿瘤生长需要新血管生长(血管生成)(Risau，W.1997.Mechanisms of angiogenesis.Nature 386671-674；Zetter，B.R.1998.Angiogenesis andtumor metastasis.Annu.Rev.Med.49407-424；和Bicknell，R.1997.Tumor Angiogenesis.0xford University Press，0xford.pp.19-28)。例如，已经发现αvβ3整联蛋白是肿瘤特异性的，因此是极好的肿瘤靶(Brooks，P.C.，Clark，R.A.和Cheresh，D.A.1994.Requirement of vascular integrin αvβ3 for angiogenesis.Science 264569-571)。已经开发了αvβ3整联蛋白特异性抗体(Tarli，L.，Balza，E.，Viti，F.，Borsi，L.，Castellani，P.，Berndorff，D.，Dinkelborg，L.，Neri，D.和Zardi，L.1999.A high-affinity human antibody that targets tumoral bloodvessels.Blood 94192-198；Marty，C.，Scheidegger，P.，Ballmer-Hofer，K.，Klemenz，R.和Schwendener，R.A.2001.Production of functionalized single-chain Fv antibodyfragments binding to the ED-B domain of the B-isoform offibronectin in Pichia pastoris.Protein Expression andPurification 21156-164)并用于携带免疫毒素靶向肿瘤(Carnemolla，B.，Borsi，L.，Balza，E.，Castellani，P.，Meazza，R.，Berndt，A.，Ferrini，S.，Kosmehl，H.，Neri，D.和Zardi，L.2002.Enhancement of the antitumor properties ofinterleukin-2 by its targeted delivery to the tumor bloodvessel extracellular matrix.Blood 991659-1665)。另一方面，噬菌体展示技术已经用于鉴定含有Arg-Gly-Asp(RGD)基序的一组肽并导向肿瘤，所述肽与αvβ3整联蛋白具有高亲和力(Pasqualini，R.，Koivunen，E.和Ruoslahti，E.1997.αv integrins asreceptors for tumor targeting by circulating ligands.NatureBiotech.15542-546；Assa-Munt，N.，Jia，X.，Laakkonen，P.和Ruoslahti，E.2001.Solution structures and integrin bindingactivities of an RGD peptide with two isomers.Biochemistry402373-2378)。这些肽具有携带毒素靶向肿瘤新脉管系统的潜力，如前细胞凋亡(pro-apoptotic)肽。(Ellerby，H.M.，Arap，W.，Ellerby，L.M.，Kain，R.，Andrusiak，R.，DelRio，G.，Krajewski，S.，Lombardo，C.R.，Rao，R.，Ruoslahti，E.，Bredesen，D.E.和Pasqualini，R.1999.Anti-cancer activity of targetedpro-apoptotic peptides.Nature Med.51032-1038)。
需要具有很少不良副作用或没有副作用以及对肿瘤细胞的破坏和除去具有高特异性和彻底性的肿瘤疗法。
发明概述本发明提供了包含靶向部分(TP)和触发免疫反应部分(IRTP)的抗肿瘤剂。TP可以是抗体片段或肿瘤脉管系统结合肽。在一些实施方案中，抗体片段是单链抗体。在其它实施方案中，肿瘤脉管系统结合肽包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)或甘氨酸-丝氨酸-亮氨酸(GSL)。IRTP可以是免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段，显示出与Fc区相同的生物学功能的IgG Fc片段的片段，或外源主要组织相容性复合体(MHC)的胞外结构域。在一些实施方案中，抗肿瘤剂用于抑制肿瘤生长。在其它实施方案中，抗肿瘤剂用于抑制肿瘤血管生成。在一些实施方案中，抗肿瘤剂用于治疗与新血管形成相关的疾病，如癌症。
除基因治疗方法之外，这里预期使用细菌发酵技术来大规模制备RGD/mFc融合蛋白的方法作为另一个选择。
附图简述

图1.RGD/mFc融合蛋白的图。RGD＝肽ACDCRGDCFCG；H＝小鼠IgG的铰链区；CH2和CH3＝小鼠IgG的Fc结构域的恒定区。
图2A-B.RGD/mFc表达的检测。(A)正常B16F0细胞和表达RGD/mFc的B16F0细胞(B16F0/RGD/mFc)的FACS分析，(B)上清液的蛋白印迹分析。1、来自试剂盒的阳性对照；2、来自正常B16F0细胞培养物的上清液；3、来自RGD/mFc B16F0细胞的上清液。
图3A-F.Matrigel植入物的荧光显微镜术分析。(A)不含B16F0细胞的Matrigel植入物、(B)20μm不含B16F0细胞的Matrigel植入物的冷冻切片、(C)含有正常B16F0细胞的Matrigel植入物、(D)20μm含正常B16F0细胞的Matrigel植入物的冷冻切片、(E)含有表达RGD/mFc的B16F0细胞的Matrigel植入物、(F)20μm含有表达RGD/mFc的B16F0细胞的Matrigel植入物的冷冻切片。
图4.Matrigel植入物的免疫组织化学分析。(A)无B16F0细胞的Matrigel、(B)含有B16F0细胞的Matrigel植入物、(C)含有表达RGD/mFc的B16F0细胞的Matrigel植入物。
图5.肿瘤的免疫组织化学分析。(A)表达RGD/mFc的B16F0细胞(左侧小鼠)和正常B16F0细胞(右侧小鼠)的代表性肿瘤；(B)来自注射正常B16F0细胞的小鼠的肿瘤；(C)来自注射表达RGD/mFc的B16F0细胞的小鼠的肿瘤；(D)肿瘤微血管密度。
图6.肿瘤生长研究。正方形＝来自注射正常B16F0细胞的小鼠的肿瘤；菱形＝来自注射表达RGD/mFc的B16F0细胞的小鼠的肿瘤；***＝P＜0.001。
图7.存活研究。给C57BL/6J小鼠(8只小鼠/组)皮下注射2×105个B16F0细胞或表达RGD/mFc的B16F0细胞。当肿瘤大小达到直径20mm时，认为该小鼠死亡。
图8.编码H-2Kd的胞外结构域(核苷酸1-912)、铰链区(核苷酸912-975)、抗PSMA重链可变区(核苷酸976-1326)、接头序列(核苷酸1327-1410)和抗PSMA轻链可变区(核苷酸1411-1749)的核酸序列。
图9A-B.(A)H2Kd/scPSMA融合蛋白的图。scFv＝作为单链的抗人PSMA的轻链和重链可变区；MHC＝小鼠H-2Kd的胞外结构域(B)质粒pH2-Kd/PSMAVH+VL转染的B16F0细胞克隆的RT-PCR分析。泳道1标记；泳道 2克隆#1；泳道 3克隆# 2；泳道 4克隆# 3；泳道 5克隆# 7；泳道 6B16F0。
图10A-D.pH2-Kd/PSMAVH+VL质粒转染的B16F0稳定细胞系中H2Kd/scPSMA表达的FACS分析。(A)用FITC缀合的抗H-2Kd抗体对细胞系#3细胞进行染色，(B)用FITC缀合的抗小鼠IgG抗体对细胞系#3细胞进行染色，(C)用FITC缀合的抗H-2Kd抗体对细胞系#7细胞进行染色，(D)用FITC缀合的抗小鼠IgG抗体对细胞系#7细胞进行染色。虚线是同种型对照。
图11A-B.肺转移分析。(A)肺肿瘤结节，(B)肿瘤总重量(***P＜0.001)。1组B16F0细胞；2组B16F0/PSMA细胞；3组B16F0/H2Kd/scPSMA细胞；4组B16F0/PSMA/H2Kd/scPSMA细胞，克隆#3；5组B16F0/PSMA/H2Kd/scPSMA细胞，克隆#7。
图12.存活研究。菱形＝B16F0细胞；正方形＝B16F0/PSMA细胞；圆形＝B16F0/H2Kd/scPSMA细胞；田字格＝B16F0/PSMA/H2Kd/scPSMA#3细胞；和三角形＝B16F0/PSMA/H2Kd/scPSMA#7细胞。
图13.肿瘤生长研究。菱形＝B16F0细胞；正方形＝B16F0/PSMA细胞；圆形＝B16F0/H2Kd/scPSMA细胞；三角形＝B16F0/PSMA/H2Kd/scPSMA#3细胞；和田字格＝B16F0/PSMA/H2Kd/scPSMA#7细胞。
图14.人前列腺细胞的肿瘤生长研究。正方形＝远距离肿瘤；菱形＝注射肿瘤；和圆形＝对照肿瘤。垂直箭标表示病毒颗粒直接注射入肿瘤的时间。
图15.TC-1细胞的肿瘤生长研究。正方形＝远距离肿瘤；菱形＝注射肿瘤；圆形＝对照肿瘤(LacZ)；和三角形＝对照肿瘤(PBS)。垂直箭标表示病毒颗粒直接注射入肿瘤的时间。
图16.通过腺病毒送递的RGD/mFc在DU-145人前列腺肿瘤细胞中的抗肿瘤生长。给三组裸鼠(5只小鼠/组)中的每只双胁腹皮内注射5×106个DU-145肿瘤细胞。从第21天开始，将编码RGD/mFc或LacZ的腺病毒颗粒(108PFU/50μl PBS)注射到右胁腹肿瘤中。以三天的间隔重复注射四次。从第21天开始测量肿瘤并提供平均肿瘤体积。空心圆注射编码Lac Z的腺病毒颗粒的肿瘤；空心菱形注射编码RGD/mFc的腺病毒颗粒的肿瘤；空心正方形右胁腹肿瘤接受编码RGD/mFc的腺病毒颗粒的小鼠左胁腹肿瘤。箭标表示载体注射。
图17.通过腺病毒送递的RGD/mFc在TC-1细胞中的抗肿瘤生长。给三组C57BL/6J小鼠(8只小鼠/组)双胁腹皮内注射2×105个TC-1肿瘤细胞。从第10天开始，将编码RGD/mFc的腺病毒颗粒(108PFU/50μl PBS)注射到右胁腹肿瘤中。在一个对照组中，将等量编码Lac Z的腺病毒颗粒注射到右胁腹肿瘤；在另一个对照组中，注射1XPBS。以三天的间隔重复注射四次。从第十天开始测量肿瘤并提供平均肿瘤体积。空心三角形注射PBS的肿瘤；空心圆注射编码LacZ的腺病毒颗粒的肿瘤；空心菱形注射编码RGD/mFc的腺病毒颗粒的肿瘤；空心正方形右胁腹肿瘤接受编码RGD/mFc的腺病毒颗粒的小鼠左胁腹肿瘤。箭标表示载体注射。
详述本发明提供了选择性破坏靶细胞，像癌细胞的组合物和方法。该组合物是包含与IRTP连接的TP的抗肿瘤剂。TP特异性结合靶细胞，而IRTP触发引起细胞被破坏的免疫反应。也描述了制备和使用该抗肿瘤剂的方法。
靶向部分(TP)TP可以是能够选择性结合靶细胞的任何部分。例如，TP可以是抗体片段或肿瘤脉管系统结合肽。
在一些实施方案中，TP是选择性结合靶细胞的抗体片段。本发明有效的抗体片段是F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv等等，包括杂合片段。也有用的是保留免疫球蛋白的高变抗原结合区并具有类似或小于Fab′片段大小的任何亚片段。这将包括基因工程改造的和/或重组蛋白，无论单链或多链，它整合抗原结合位点和此外以与天然免疫球蛋白片段基本相同的方式在体内起靶向载体的作用。优选抗体片段是单链抗体。
Fv片段大约为25,000道尔顿，是由含有完全抗原结合位点的IgG和IgM产生的最小片段。Fv片段具有与Fab(50,000道尔顿)相同的结合性能和相似的三维结合特征。Fv片段的VH和VL链通过非共价相互作用结合在一起。这些链在稀释后倾向于分离，因此已经开发了方法以通过戊二醛、分子间二硫化物或肽接头交联这些链。通过重组技术也可以产生二价单链抗体。
在本发明的方法中可以利用二价单链抗体片段或亚片段，如(sFv)2和(sFv′)2。(sFv)2和(sFv′)2抗体片段具有两个抗原结合位点并可以提供比具有一个抗原结合位点的单价抗体更好的对抗原的靶向和亲合力，所述单价抗体如Fab′、Fab、Fv或Fv′。片段(sFv)2和(sFv′)2分子量类似于Fab′(55,000道尔顿)，但是是二价的而不是单价的，因此提供了对损害相关抗原具有更好亲和力和特异性的抗体片段。
在本发明的实践中使用的抗体片段识别的肿瘤抗原可以位于被靶向的肿瘤的细胞表面。现在科学文献中已经描述了很多实体瘤相关抗原，并且抗体的制备和使用是本领域技术人员熟知的。当然，最终选择的肿瘤抗原将依赖于待靶向的特定肿瘤。优选的肿瘤抗原是前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、CO17-1A和HER-2/neu。在优选实施方案中，抗体片段是单链抗体。
在其它实施方案中，TP是肿瘤脉管系统结合肽。用细胞毒性剂靶向肿瘤新脉管系统由于几个理由而是有利的。首先，靶细胞是静脉内施用的治疗剂可直接接近的，从而允许高百分比注射剂量迅速定位(Kennel等，1991)。其次，由于每个毛细血管为它的肿瘤围绕“带”的成千上万个细胞提供氧气和养分，因此即使肿瘤脉管系统的有限损伤亦可以导致肿瘤细胞死亡的涌至(Denekamp，1990；Denekamp，1984)。
肿瘤脉管系统结合肽可以是靶向或导向肿瘤脉管系统的任何肽。已经鉴定了靶向肿瘤脉管系统的几个肽基序。例如，通过给携带人乳腺癌异种移植物的裸鼠的循环系统注射噬菌体肽文库，Arap等鉴定了导向肿瘤的三个肽基序(Arap等，Science，279377-380，1998)。使用相似的方法或本领域技术人员熟知的其它方法可以鉴定另外的肿瘤脉管系统结合肽。本发明可用的示例性肿瘤脉管系统结合肽是包含Arg-Gly-Asp(RGD)基序、Asn-Gly-Arg(NGR)基序或Gly-Ser-Leu(GSL)基序的肽。
肿瘤脉管系统结合肽可以是任何长度。在优选实施方案中，该肽包含3-15个氨基酸。更优选，该肽包含11个氨基酸。该肽可以是线状或环状形式。在优选实施方案中，该肽是环状的。
触发免疫反应部分(IRTP)IRTP可以是能够触发免疫反应的任何部分。例如，IRTP可以是选自下组的部分免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段、显示出与Fc区相同生物学功能的IgG的Fc片段的片段、外源的主要组织相容性复合体(MHC)的胞外结构域。
免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段负责抗体诱导的免疫反应(Abbas，A.K.，Lichtman，A.H.和Pober，J.S.2000.Cellular andMolecular Immunology，W.B.Saunders Company，Philadelphia，Pennsylvania，pp.60-61)。首先，Fc可以触发嗜中性粒细胞或巨噬细胞的吞噬作用，这是因为这些细胞表达Fc受体。其次，Fc能够活化天然杀伤细胞以裂解携带Fc的细胞(Hu，Z.和Garen，A.，2000，Intratumoral injection of adenoviral vectors encodingtumor-targeted immunoconjugates for cancer immunotherapy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 979221-9225)。第三，IgG的Fc部分通过与补体蛋白C1q结合可以触发补体系统。IgG的Fc片段已被用作通过与其它靶向蛋白如组织因子融合而抑制肿瘤中的功能性基序(Hu，Z.和Garen，A.，2000，Intratumoral injection ofadenoviral vectors encoding tumor-targeted immunoconjugatesfor cancer immunotherapy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 979221-9225；Hu，Z.和Ga ren，A.2001.Targeting tissue factoron tumor vascular endothelial cells and tumor cells forimmunotherapy in mouse models of prostatic cancer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9812180-12185)。
Fc片段可以源自于任何IgG。在一些实施方案中，Fc片段源自于哺乳动物IgG。可以得到IgG的示例性哺乳动物是人、小鼠、山羊、母牛和绵羊。IRTP还可以是显示出与整个Fc片段相同生物学功能的IgG的Fc片段的片段。
在其它实施方案中，IRTP是外源主要组织相容性复合体(MHC)的胞外结构域。可以使用任何MHC的胞外结构域作为发明的抗肿瘤剂中的IRTP。已经表明外源MHC触发免疫反应。当MHC分子通过基因转移导回肿瘤细胞时，肿瘤细胞的致瘤性显著降低(Tanaka，K.，Isselbacher，K.J.，Khoury，G.和Jay，G.1985.Reversal ofoncogenesis by the expression of a major histocompatibilitycomplex class I gene.Science.22826-30；Nabel，G J.，Yang，Z.Y.，Nabel，E.G.，Bishop，K.，Marquet，M.，Felgner，P.L.，Gordon，D.和Chang，A.E.1995.Direct gene transfer fortreatment of human cancer.Ann.N.Y.Acad.Sci.772227-231)，特别是当转移外源的MHCs时(O′neil，B.H.，Kawakami，Y.，Restifo，N.P.，Bennink，J.R.，Yewdell，J.W.和Rosenberg，S.A.1993.Detection of shared MHC-restricted human melanomaantigens after vaccinia virus-mediated transduction of genescoding for HLA.J.Immunol.1511410-1418；Nabel，E.G.，Bishop，K.，Marquet，M.，Felgner，P.L.，Gordon，D.和Chang，A.E.1995.Direct gene transfer for treatment of human cancer.Ann.N.Y.Acad.Sci.772227-231.)。术语“外源的”意思指MHC源自于除待用抗肿瘤剂治疗的生物之外的生物，或MHC源自于其MHC与待用抗肿瘤剂治疗的个体不匹配的个体。示例性的MHCs是H-2Kd和HLA-A0101。
在优选实施方案中，TP是包含RGD基序的肿瘤脉管系统结合肽(ACDCRGDCFCG)，且IRTP是小鼠IgG C末端的Fc片段。RGD肽结合肿瘤脉管系统的αvβ3整联蛋白，且Fc部分激活免疫反应，包括补体系统、NK细胞、嗜中性粒细胞和/或巨噬细胞以破坏表达αvβ3整联蛋白的肿瘤的血管内皮细胞和肿瘤细胞。
近来研究证明不仅新脉管系统内皮细胞，而且大部分肿瘤细胞都表达αvβ3整联蛋白(Pasqualini等，Nature Biotech.15542-46(1997))。因此，RGD/mFc融合蛋白应该靶向新血管和现有的肿瘤细胞。结果，这些融合蛋白可以代表除抑制肿瘤生长外可以根除肿瘤的试剂。
合成方法抗肿瘤剂的TP和IRTP通过键合相互作用彼此连接。在一些实施方案中，TP和IRTP通过TP肽主链中的原子和IRTP肽主链中的原子之间形成的键连接。这里这类连接称作“主链-主链”连接。在其它实施方案中，TP和IRTP通过TP肽主链中的原子和IRTP氨基酸侧链(表面)的原子之间形成的键连接。TP和IRTP也可以通过TP氨基酸侧链(表面)的原子和IRTP肽主链的原子之间形成的键连接。这里这类连接称作“主链-侧链”连接。在一些实施方案中，TP和IRTP彼此直接连接，而在其它实施方案中，TP和IRTP之间有连接区。
TP和IRTP可以通过宿主细胞表达融合蛋白以主链-主链连接而连接。在这个实施方案中，抗肿瘤剂作为TP和IRTP的融合蛋白以分泌形式表达。使包含编码信号肽的核酸序列之后的编码TP和IRTP的核酸序列的表达载体转染宿主细胞。该宿主细胞表达融合蛋白并使用标准纯化技术纯化该蛋白。宿主细胞表达所需融合蛋白的方法是本领域技术人员熟知的。
TP和IRTP也可以以主链-侧链连接进行连接。本领域普通技术人员可以容易地完成IRTP和TP之间的主链-侧链连接。通过主链-侧链连接使IRTP和TP连接的任何方法适于本发明。本领域普通技术人员熟悉实现这种偶联的方法。使用本领域技术人员熟知方法可以化学修饰TP，以致主链的每个末端是羧酸基团。二羧化TP可以通过IRTP的表面胺与IRTP偶联。赖氨酸侧链中发现的胺可以用作表面胺。使用本领域技术人员熟知方法也可以化学修饰TP，以致主链的每个末端是氨基。二胺衍生的TP可以通过IRTP的表面羧酸或碳水化合物部分与IRTP偶联。天冬氨酸或谷氨酸残基的侧链中发现的羧酸可以用作表面羧酸。例如，IgG的Fc区的碳水化物部分可以与已被衍生而在其C末端具有NH2基的TP偶联。
或者，使用本领域技术人员熟知方法可以化学修饰IRTP，以致主链的每个末端是羧酸基团。二羧化IRTP可以通过TP的表面胺与TP偶联。使用本领域技术人员熟知方法也可以化学修饰IRTP，以致主链的每个末端是氨基。二胺衍生的IRTP可以通过TP的表面羧酸或碳水化合物部分与TP偶联。
实现这种偶联的示例性方法是EDC介导的TP的C末端羧酸与乙二胺的偶联，其中EDC是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐。然后衍生的TP通过它的碳水化物部分经由碳水化合物氧化、席夫碱形成和还原作用与IRTP偶联。许多蛋白含有由于糖基化作用产生的碳水化合物部分。例如，碳水化物部分位于IgG的Fc区。
在一些实施方案中，IRTP和TP通过剪接方法偶联。Muir等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 6705-6710(1998)和Evans，Jr.等.Protein Science 7 2256-2264(1998)描述了示例性的剪接方法，它们的整体内容并入这里。
在其它实施方案中，连接可以是“侧链与侧链”连接。这种连接可以通过IRTP上的表面羧酸与TP上的表面胺偶联或通过TP上的表面胺与TP上的表面羧酸偶联而实现。
药物组合物本发明的另一个方面是包含本发明抗肿瘤剂和药物适合载体或赋形剂的药物组合物。在本发明的一些方面，该药物组合物包含含有编码本发明抗肿瘤剂的DNA序列的载体和药物适合载体或赋形剂。
虽然本发明的抗肿瘤剂或含有编码本发明抗肿瘤剂的DNA序列的载体可以单独施用于患者，但是本发明的抗肿瘤剂或载体也可以作为药物制剂的一部分存在。药物合适的赋形剂通常包括本领域技术人员已知的载体，包括药物佐剂。通常，这些药物可接受载体包括水、盐水、缓冲液和如在MERCK INDEX，Merck & Co.，Rahway，N.J.中描述的其它化合物，也见Bioreversible Carriers in Drug Design，Theory and Application，Roche(ed.)，Pergamon Press，(1987)。这些制剂通常包含治疗或药物有效量的药理学试剂(即抗肿瘤剂)连同一种或多种药物或治疗可接受载体和任选其它治疗成分。在Gilman等.(eds.)(1990)Goodman和GilmanThe Pharmacological Basesof Therapeutics，8th Ed.，Pergamon Press；Novel Drug DeliverySystems，2nd Ed.，Norris(ed.)Marcel Dekker Inc.(1989)和Remington′s Pharmaceutical Sciences中描述了各种考虑事项，其全部公开内容并入这里作为参考。
该组合物可以配制成适合于所需施用途径的任何药物形式。这种组合物的实例包括口服施用的固体组合物，如片剂、胶囊、丸剂、粉末和颗粒，它们可被肠溶衣包衣或受到其他保护而不被水解，特别是酶水解，口服施用的液体组合物，如溶液、悬浮液、糖浆或酏剂，和肠胃外施用的制剂，如无菌溶液、悬浮液或乳剂。该组合物也可以制成无菌固体组合物的形式，它可以在使用之前立即溶于无菌水、生理盐水或一些其它无菌注射介质。
由于本发明的抗肿瘤剂是两性的，所以它可以用作游离碱，用作酸加成盐或用作金属盐。该盐必须是药物可接受的，且这些将包括金属盐，特别是碱和碱土金属盐，合适地是钾或钠盐。可利用各种药物可接受的酸加成盐。这些包括由有机和无机酸制备的那些，优选无机酸。可以举例提及的一般的酸类包括柠檬酸、琥珀酸、乳酸、盐酸和氢溴酸。用本领域技术人员熟知方法可容易地制备这些产物。
在所有这种组合物中，抗肿瘤剂或载体通常将是主要的生理活性成分。然而，抗肿瘤剂或载体可以与另外的药物试剂一起配制用于组合治疗。例如，当用于治疗癌症时，它可以与相容的常规化疗剂一起配制。
在前述Gilman等(eds.)(1990)和Norris(ed.)中也探讨了施用方法。尤其是，本发明的药物组合物可以静脉内、皮下、口服、经皮施用，如在(Prausnitz，M.R.，Bose，VG，Langer，R，Weaver，JCElectroporation of Mammalian skina mechanism to enhancetransdermal drug delivery.Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.，9010504-10508(1993)；和Wallace，B M，Lasker，J SStand andDelivergetting peptide drugs into the body.Science 260912-912(1992)的方法中。也可以使用脂质体来施用本发明的细胞毒素原(procytotoxin)。(见Woodle，M C，Storm，G，Newman，M S，Jekot，J J，Collins，L R，Martin，F J，Szoka F CProlonged systemicdelivery of peptide drugs by long circulating liposomesillustration with vasopressin in the Brattleboro rat.Pharmaceut.Res.9260-265(1992)。
本领域技术人员可容易地确定对于给定哺乳动物宿主的最佳送递途径、剂量和方案。当然，将认识到使用的实际剂量将根据配制的特定组合物、使用的特定化合物、应用模式和特定部位、宿主和要治疗的疾病而变化。将考虑改变药物作用的许多因素，包括年龄、体重、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄率、患者的状况、药物组合、反应敏感性和疾病的严重性。
治疗方法本发明的抗肿瘤剂在各种治疗方法中有用。抗肿瘤剂可以单独或作为如上所述的药物组合物施用。在一些实施方案中，抗肿瘤剂用在抑制肿瘤生长的方法中。在其它实施方案中，抗肿瘤剂用在抑制血管生成的方法中。在一些实施方中，抗肿瘤剂用于治疗与新血管形成相关的疾病，如癌症的方法中。
该抗肿瘤剂可用于治疗各种癌症，如原发或转移性实体瘤，包括肺、结肠直肠、膀胱、前列腺、乳房、肾、脑、胰腺、黑素瘤、头和颈部和卵巢的癌症。
该方法可以在体外或体内实施。示例性的体外方法可以包括使细胞接触有效量的抗肿瘤剂。示例性的体内方法包括给有需要的患者施用有效量的抗肿瘤剂。如这里使用的，术语“患者”包括人和其它物种；因此本发明兼具医学和兽医应用。
下列实施例举例说明了这些治疗方法。例如，注射表达RGD/mFc融合蛋白的B16F0细胞的小鼠肿瘤具有显著较少的新血管，并且小于注射B16F0细胞的小鼠肿瘤。参见图5和6。另外，注射表达RGD/mFc融合蛋白的B16F0细胞的小鼠具有比注射B16F0细胞的小鼠更好的存活率。参见图7。静脉内注射B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA细胞的小鼠与对照组相比产生显著较少的肿瘤结节。参见图11A。注射B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA细胞的小鼠的肿瘤大小小于对照小鼠的肿瘤。参见图11B。存活研究表明融合蛋白H2Kd/scPSMA显著提高了总存活。参见图12。当小鼠皮内注射时获得类似的结果。参见图13。另外，注射包含含有RGD/mFc融合基因的腺病毒载体的腺病毒颗粒的小鼠肿瘤小于注射包含含有LacZ基因的腺病毒载体的腺病毒颗粒的小鼠肿瘤。参见图14和15。
实施例实施例1-3的材料和方法动物。6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠购自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)并饲养在无病原体的动物设施中。
细胞系。在含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone，Logan，Utah)和50μg/ml庆大霉素(GIBCO BRL)的DMEM(GIBCO BRL，Grand Island，NY)中培养B16F0小鼠黑素瘤细胞(ATCC#CRL 6322，Rockville，MD)。如这里使用的，术语“正常B16F0细胞”意思是没有以任何方式改变的B16F0细胞(即这些细胞没有被改变而表达RGD/mFc或已表达PMSA)。
蛋白印迹和FACS分析。将B16F0细胞和表达RGD/mFc的B16F0的上清液在SDS-PAGE上电泳并转移到硝酸纤维素膜上。融合蛋白被抗Fc片段抗体(Bethyl Laboratories，Montgomery，TX)和SuperSignal West Pico Chemi luminescent检测试剂盒(Pierce，Rockford，IL)识别。也通过细胞内荧光激活细胞分类术(FACS)分析表达RGD/mFc的稳定细胞系。简言之，蛋白分泌物被阻断，并用Cytofix/Cytoperm Plus试剂盒(BD PharMingen，San Diego，CA)透化细胞。然后用FITC缀合的抗小鼠Fc抗体对细胞进行染色并使用FACS Calibur(Becton/Dickinson，San Jose，CA)分析细胞。
Matrigel栓。将基因工程改造而表达RGD/mFc蛋白的5×105个B16F0细胞与0.2ml液体Matrigel(Becton/Dickinson)混合并皮下注射给雌性C57BL/6J小鼠。也完成两个对照实验。在一个对照实验中，将0.2ml的液体Matrigel皮下注射给雌性C57BL/6J小鼠。在第二对照实验中，将5×105个B16F0细胞与0.2ml的液体Matrigel混合并皮下注射给雌性C57BL/6J小鼠。在第8天，给小鼠静脉内注射50μg/小鼠的FITC凝集素(Sigma，St.Luis，MI)/小鼠。三十分钟后，分离Matrigel植入物。在荧光显微镜下迅速观察后，冷冻它们用于制备切片。制备厚切片(20μm)并使用荧光显微镜观察。
免疫组织化学分析。将溶于0.2ml PBS的5×105个表达RGD/mFc的B16F0细胞皮下注射给C57BL/6J小鼠。作为对照实验，将溶于0.2ml PBS的5×105个B16F0细胞皮下注射给C57BL/6J小鼠。十四天后，切下肿瘤并制备冷冻切片。使用这些冷冻切片制备载玻片。接着固定载玻片并用抗CD31抗体进行免疫组织化学染色，用VectastainElite ABC试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)显像。
也通过免疫组织化学分析研究以上所述的Matrigel植入物。用冷冻切片制备载玻片。接着固定载玻片并用抗CD31抗体进行免疫组织化学染色，用Vectastain Elite ABC试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)显像。
动物研究。将溶于0.2ml PBS中的2×105个表达RGD/mFc的B16F0细胞皮下注射给C57BL/6J小鼠。作为对照实验，将溶于0.2ml PBS中的2×105个B16F0细胞皮下注射给C57BL/6J小鼠。用数字测径器测量肿瘤，进行统计学分析并记录。肿瘤体积计算为长×宽2。对于存活研究，当肿瘤达到直径20mm的大小时，认为携带它的小鼠死亡。每组有8只小鼠。用斯氏T检验分析肿瘤体积数据。
实施例1RGD/mFc融合蛋白的构建RGD/Mfc融合蛋白载体的构建和转染入B16F0肿瘤细胞。使用PCR扩增小鼠IgG cDNA序列(ATCC#MGC-6628)的Fc片段(从铰链区至cDNA末端，741bp)。设计一对引物(显示如下)用于PCR反应。在5′引物N-末端，在酶切位点(HindIII)之后，添加编码ACDCRGDCFCG肽的序列。将BamHI酶切位点添加到3′引物N-末端。
5’引物CCAAGCTTGCCTGCGACTGCCGAGGAGATTGTTTCTGCGGCGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGC3’引物CGGGATCCCGTTTACCAGGAGAGTGGGAGAG在上游引物5′末端，HindIII酶切位点之后，添加编码ACDCRGDCFCG肽的序列。将BamHI酶切位点添加到下游引物5′末端。
然后将PCR产物插入表达载体pSecTag2B(含有有用的组氨酸标签)中，其在阅读框中，位于信号肽序列之后。经测序证实全部序列。然后，使用Lipofectamine转染试剂，根据制造商的规程(Gibco BRL)将产生的载体pRGD/mFc转染入B16F0肿瘤细胞。从含有200或500μg/ml Zeocin(Sigma，St.Louis，MO)的DMEM中选择稳定细胞系3-4周。
RGD/mFc表达。图1显示了融合蛋白RGD/mFc的图。它含有前面的RGD肽序列(ACDCRGDCFCG)，后面是小鼠IgG的铰链区、CH2和CH3区。为证实融合蛋白的表达，将载体pRGD/mFc线性化并转染入B16F0黑素瘤细胞，获得稳定表达的细胞系。使用抗小鼠Fc片段抗体的细胞内FACS分析证明蛋白在这些细胞中表达(图2A)，且蛋白印迹分析表明该蛋白分泌到培养基中(图2B)。
实施例2RGD/mFc融合蛋白引起的肿瘤血管生成的抑制使用荧光显微镜观察Matrigel植入物的切片。对于第一个对照实验(仅仅Matrigel皮下注射给小鼠)，观察到Matrigel植入物表面上的一些血管，如图3A所示。植入物内没有观察到血管。对于第二个对照实验(B16F0细胞和Matrigel皮下注射给小鼠)，B16F0肿瘤细胞显著促进Matrigel植入物中新血管形成，如图3C和3D所示。相反，对于B16F0细胞被基因工程改造而表达RGD/mFc蛋白和Matrigel皮下注射给小鼠的实验，Matrigel植入物中新血管的形成显著减少，如图3E和3F所示，表明RGD/Fc融合蛋白具有抗血管生成活性。
来自Matrigel植入物的切片的免疫组织化学分析表明与含正常B16F0细胞的Matrigel植入物相比，在含表达RGD/mFc的B16F0细胞的Matrigel植入物中不仅血管显著减少，而且肿瘤细胞块也小得多(参见图4)。在另一个肿瘤模型TC-1中，观察到类似的抗血管生成作用(数据未显示)。
为进一步证实这些观察结果，将肿瘤细胞(溶于PBS的B16F0细胞或溶于PBS的表达RGD/mFc的B16F0细胞)皮下注射给小鼠。十四天后，切下肿瘤和制备冰冻切片载玻片，用抗CD31抗体进行免疫组织化学染色。与来自正常B16F0细胞的肿瘤相比，在来自表达RGD/mFc的B16F0细胞的肿瘤中再次观察到显著较少的新血管(参见图5B和5C)。注意到B16F0细胞和表达RGD/mFc的B16F0细胞的肿瘤大小之间有显著差异(见图5A)。图4C和5C中Matrigel植入物中表达RGD/mFc的肿瘤和无Matrigel的肿瘤之间的肿瘤细胞数目的明显差异是这两个肿瘤模型中不同细胞密度的假象。
实验3RGD/mFc融合蛋白引起的肿瘤生长抑制为统计测定RGD/mFc融合蛋白是否抑制肿瘤生长，将表达RGD/mFc蛋白的B16F0肿瘤细胞皮下注射给雌性C57BL/6J小鼠。作为对照实验，将B16F0肿瘤细胞注射给单独小鼠组。测量肿瘤体积，进行统计学分析和绘图。如图6所示，观察到来自对照实验小鼠的肿瘤和来自注射了表达RGD/mFc的B16F0细胞的小鼠的肿瘤之间有显著的大小差异。来自对照实验的小鼠肿瘤比来自注射了表达RGD/mFc的B16F0细胞的小鼠肿瘤大。例如，在第21天，观察到肿瘤大小有统计学上的显著差异(p＜0.001)。
也监控注射了表达RGD/mFc的B16F0细胞的小鼠的存活情况。如图7所示，RGD/mFc融合蛋白显著延长小鼠的存活时间。当肿瘤达到直径20mm的大小时，认为小鼠死亡。在第45天，携带表达RGD/mFc的细胞的75％的小鼠仍活着，而对照组的所有小鼠(注射未改变的B16F 0细胞的小鼠)在第20天之前死亡(图7)。
实施例4-5的材料和方法实施例4DH2-Kd/PMSAVH+VL的构建和转染与H2Kd/scPSMA的表达从BALB/c小鼠的淋巴细胞分离总RNA并通过RT-PCR产生H2-KdcDNA，所用引物为5′-CAGTGCGATGGCACCCTGCACGC-3′和5′-GGCAGCTGTCTTCACGCTAGAGAATG-3′，并将H2-KdcDNA插入载体pCR2.1(pH2-Kd)。通过反转录和5’-RACE从分离自7E11杂交瘤细胞系(ATCC#HB10494)的总RNA克隆编码抗人PSMA重链的cDNA序列，其中反转录使用恒定区3′引物5′-GACACTGGGATCATTTACCAGGAGAG-3′而5′-RACE使用引物5′-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3′和5′-GACACTGGGATCATTTACCAGGAGAG-3′。
然后将该cDNA插入载体pCR4-TOPO(pPSMAH)。类似地，通过用寡聚dT引物反转录及使用如下引物的扩增来克隆编码抗人PSMA轻链的cDNA序列5′-CGACUGGAGCACGAGGACACUGA-3′和5′-GAGCTGGTGGTGGCGTCTCAG-3′(pPSMAL)。
通过PCR从pH2-Kd扩增H-2KdcDNA的胞外结构域，所用引物为5′-GGAATTCATGGCACCCTGCACGCTGC-3′和5′GCTTACGTTAACCACAATCCCTGGGCAGGCGCGCCCGAGACAGTGGATGGAGGAAG-3′。
为保留下游引物5′末端的铰链区，添加Hpa I限制酶切位点和铰链区序列的一半。类似地，通过PCR从pPSMAH扩增抗人PSMA重链的可变区，所用引物为5′-ATTGTGGTTAACGTAAGCCTTGCATATGTACAGGCCGIACGACCAAGAGCACACCTGCAAATG-3′和5′-CCGCTCGAGGCTCTAGATTACCAGGTGCTGGAGGGGACAGTCAC-3′。
将Hpa I限制酶切位点和铰链区序列的另一半添加在上游引物的5′末端。然后分别用HpaI/EcoR I和Hpa1/Xho I消化两个PCR产物、连接并克隆入pCR2.1(pH2-Kd/PSMAH)。使用类似的策略，通过两个独立的PCR和PCR片段连接将抗人PSMA的轻链可变区添加到pH2-Kd/PSMA。对于pH2-Kd/PSMAH，引物是5′-GGAATTCATGGCACCCTGCACGCTGC-3′和5′GCCCCCCCGGGGGGCCCACCAGAAGCAGGGCCTCCGCTCGCCCAGGTGCTGGAGGGGACAGTC-3′且对于pPSMAL为5′GCCCCCCGGGGGGGCCTCCGGTGGCCCGGCCAGTGGGGGACCCGCATCAGGAGGCCCTGATGTTGTGATGACCCAGACTC-3′和5′-CCGCTCGAGTCACCGTTTTATCTCCAGCTTGGTCCCCCC-3′。
在重链可变区和轻链可变区之间引入接头序列。最后的质粒pH2-Kd/PSMAVH+VL含有下列组分H-2Kd的胞外结构域、铰链区、抗PSMA重链可变区、接头序列和抗PSMA轻链可变区，如图8所示。
然后使用Lipofectamine转染试剂根据制造商的规程(Gibco BRL)将pH2-Kd/PSMAVH+VL分别转染入B16F0肿瘤细胞和B16F0/PSMA5细胞。使用G418抗性选择稳定的细胞系并维持在培养物中。
H2Kd/scPSMA表达。图9A显示了H2Kd/scPSMA融合蛋白的图。将质粒pH2-Kd/PSMAVH+VL转染入B16F0肿瘤细胞并选择稳定的细胞克隆。进行RT-PCR以检测融合基因的转录物。在分析的四个稳定克隆中，三个是RT-PCR阳性的(参见图9B)。在RT-PCR阳性克隆当中，分别使用抗小鼠IgG和H-2Kd抗体，通过细胞内FACS分析进一步证实融合蛋白表达。图10显示了FACS分析选择的两个示例性克隆。两个克隆都表达高水平的H-2Kd的胞外结构域(图10A和10C)。对于融合蛋白的VHVL部分也检测到信号(图10B和10D)。
实施例5H2Kd/scPSMA引起的肿瘤生长抑制和总存活改善用pH2-Kd/PSMAVH+VL转染B16F0/PSMA5细胞。获得了几个克隆并通过RT-PCR和细胞内FACS分析证实H2Kd/scPSMA表达。将两个克隆B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#3和B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#7，连同其它对照细胞如B16F0、B16F0/PSMA5和B16F0/H2Kd/scPSMA用于下列动物肿瘤研究。
将5×105个细胞通过尾静脉静脉内注射给雌性C57BL/6J小鼠进行肺转移测定。三周以后，杀死小鼠并计数肺上的肿瘤结节。与对照组相比，B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA细胞(克隆#3和#7)产生显著降低数目的肿瘤结节(图11A)。B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA细胞产生的肿瘤结节大小显著小于对照细胞产生的那些结节。这通过肿瘤总重量测量来监测并在图11B中示出。存活研究表明融合蛋白H2Kd/scPSMA显著增加总存活(P＜0.01，图12)。
通过在雌性C57BL/6J小鼠(8只小鼠/组)的右胁腹注射溶于0.2mlPBS中的2×105个肿瘤细胞来进行皮内肿瘤研究。8天后，每隔一天测量肿瘤。肿瘤体积计算为长×宽2。B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA肿瘤细胞生长显著慢于对照细胞。(B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#3对B16F0，p＜0.02；B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#3对B16F0/PSMA，p＜0.002；B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#3对B16F0/H2Kd/scPSMA，p＜0.02；B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#7对B16F0，p＜0.03；B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#7对B16F0/PSMA，p＜0.003；B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#7对B16F0/H2Kd/scPSMA，p＜0.05)在肿瘤发展早期，这尤为正确(图13)。在第11和14天，B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#3和对照细胞之间的p值，以及B16F0/PSMA5/H2Kd/scPSMA#7和对照细胞之间的p值全部小于0.001。
实施例6-7的材料和方法动物。6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠购自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)并饲养在无病原体的动物设施中。
细胞系。在含有10％FBS、0.2mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和50μg/ml庆大霉素的RPMI 1640培养基中，37℃、5％CO2下培养鼠肿瘤细胞TC-1。在含有10％热灭活马血清、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、1.5g/L碳酸氢钠和50μg/ml庆大霉素的EMEM培养基中，37℃、5％CO2下培养HEK293细胞。在含有10％FBS、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、1.5g/L碳酸氢钠和50μg/ml庆大霉素的EMEM培养基中，37℃、5％CO2下培养人前列腺肿瘤细胞DU-145。
含有RGD/mFc融合基因的腺病毒载体的构建。将融合基因(RGD/mFc)首先克隆入穿梭载体。然后通过同源重组将含有融合基因的穿梭载体插入腺病毒载体(pAdEasy-1)形成重组Ad质粒。线性化后，将质粒转染入HEK293细胞，该细胞含有腺病毒复制的必需基因。从细胞收获病毒颗粒并滴定。
含有LacZ基因的腺病毒载体的构建。将LacZ基因首先克隆入穿梭载体。然后通过同源重组将含有LacZ基因的穿梭载体插入腺病毒载体(pAdEasy-1)形成重组Ad质粒。线性化后，将质粒转染入HEK293细胞，该细胞含有腺病毒复制的必需基因。从细胞收获病毒颗粒并滴定。
实施例6RGD/mFc引起的前列腺肿瘤生长抑制将人前列腺肿瘤细胞(DU-145)皮下注射到裸鼠(每个部位5×106个细胞)左和右胁腹。在DU-145细胞初次注射后的11、28、32和35天，将包含含有RGD/mFc融合基因的腺病毒载体的病毒颗粒直接注射到肿瘤中(在50μl溶液中1×108PFU/肿瘤)。作为对照，在DU-145细胞初次注射后的同一天，以相同剂量注射包含含有LacZ基因的腺病毒载体的腺病毒颗粒。在DU-145细胞初次注射后的第8、11、28、32、35、38、41和44天，进行肿瘤大小的测量。肿瘤大小计算为长×宽2(参见图14)。
用包含含有RGD/mFc融合基因的腺病毒载体的病毒颗粒注射的肿瘤大小小于用包含含有LacZ基因的腺病毒载体的腺病毒颗粒注射的肿瘤大小。另外，未注射包含含有RGD/mFc融合基因的腺病毒载体的病毒颗粒的远距离肿瘤的大小小于用包含含有LacZ基因的腺病毒载体的腺病毒颗粒注射的肿瘤大小。
因此，如图17所示，与对照相比时，RGD/mFc有效抑制DU-145在裸鼠中的生长，表明抗肿瘤作用是通过补体系统或天然杀伤细胞或二者实现的。意外地，远距离肿瘤上RGD/mFc的抑制作用几乎与裸鼠模型中注射的肿瘤一样有效；而在TC-1肿瘤模型中，远距离的肿瘤被抑制，但是不如注射的肿瘤有效。不同类型细胞的RGD/mFc的抗血管生成作用可能不同，尤其是当肿瘤细胞来自于不同物种时。有可能它们可以不同水平地表达靶分子αvβ3并且体内转导效率也可以不同。
实施例7RGD/mFc引起的TC-1肿瘤细胞生长抑制将TC-1鼠肿瘤细胞皮下注射到C57BL/6J小鼠(每个部位1×105个细胞)左和右胁腹。在TC-1细胞初次注射后的10、13、16和20天，将包含含有RGD/mFc融合基因的腺病毒载体的病毒颗粒直接注射到肿瘤中(在50μl溶液中1×108PFU/肿瘤)。作为对照，在TC-1细胞初次注射后的同一天，以相同剂量注射包含含有LacZ基因的腺病毒载体的腺病毒颗粒。在TC-1细胞初次注射后的10、13、16、20、23和27天，进行肿瘤大小的测量。肿瘤大小计算为长×宽2(参见图15)。
用包含含有RGD/mFc融合基因的腺病毒载体的病毒颗粒注射的肿瘤大小小于用包含含有LacZ基因的腺病毒载体的腺病毒颗粒注射的肿瘤大小。另外，未注射包含含有RGD/mFc融合基因的腺病毒载体的病毒颗粒的远距离肿瘤的大小小于用包含含有LacZ基因的腺病毒载体的腺病毒颗粒注射的肿瘤大小。
实施例8RGD/mFc抗肿瘤剂的合成(“主链-侧链”连接)通过在C末端羧酸基团偶联二胺，将蛋白序列ACDCRGDCFCG衍生化而在N和C末端含有胺。该肽溶于0.1M MES、0.5M NaCl、pH6.0中形成溶液A。mFc溶于0.1M MES、0.5M NaCl、pH6.0，浓度为1mg/ml而形成溶液B。向1ml溶液B中添加0.4mg EDC(～2mM)和0.6mg NHS。允许溶液在室温下反应15分钟。添加1.4μl 2-巯基乙醇(终浓度20mM)以淬灭EDC。添加一定量的溶液A以提供相等摩尔/摩尔比的ACDCRGDCFCG和mFc。在室温下继续反应2小时。通过添加羟胺至终浓度为10mM来淬灭反应。通过凝胶过滤纯化反应。
实验9转移性肺癌人患者的治疗向诊断为转移性肺癌的175磅男性人患者可以施用RGD/mFc抗肿瘤剂的治疗。可以给该患者静脉内输注治疗有效量的抗肿瘤剂，如50mg RGD/mFc，且这种初步治疗之后，可以每周一次重复治疗合适的一段时间，如4周。在最后一剂RGD/mFc后合适的时间，如四个月，患者的计算机化断层显象扫描极好地显示无肺癌的迹象，并且该疾病的所有病征和症状都不明显。
实施例10肿瘤转移的RGD/mFc抑制为了测定RGD/mFC是否可以抑制肿瘤转移，将5×105个B16F0/模拟品或表达RGD/mFC的B16F0细胞通过尾静脉静脉内注射给雌性C57BL/6J小鼠。作为对照，也以同样方式注射B16F0/模拟品细胞。表1提供了肿瘤接种后24天以肺结节衡量的肺转移。表达RGD/mFc的两个克隆都产生比对照肿瘤细胞(＞200)显著减少的肺肿瘤结节(分别是9.625±4.09和23.875±7.98)。
表1.肺转移试验
将不同肿瘤细胞系静脉内(i.v.)注射给C57BL/6J小鼠(5×105个/小鼠)。二十四天后，杀死小鼠并计数肺上的肿瘤结节。
实施例11腺病毒载体构建以表达RGD/mFc使用AdEasy腺病毒载体系统(Stratagene，La Jolla，CA)构建含RGD/mFc融合蛋白的编码序列的重组腺病毒载体。简言之，从pRGD/mFc扩增RGD/mFc序列并克隆入pShuttle-CMV载体；接着将所产生的pShuttle-CMV/RGD/mFc转化入BJ5183-AD-1电穿孔感受态细胞而产生重组腺病毒载体pAd-RGD/mFc。Pac I消化而线性化pAd-RGD/mFC病毒载体后，使用Transfection MBS哺乳动物转染试剂盒(Stratagene)将它转染入AD-293细胞。十天后，从转染细胞制备原代病毒原种并用BD Biosciences′Adeno-X Rapid滴定试剂盒测定病毒滴度。通过以MOI为3感染125×106个AD-293细胞约四天直到致细胞病变效应完成而进行重组病毒的扩增。最后，收获重组病毒并使用BD Biosciences′Adeno-X病毒纯化试剂盒根据提供的说明书进行纯化。然后滴定纯化的病毒，等分试样，并在-80℃存储以备将来之用。通过来自pAd-RGD/mFc感染的不同细胞(AD-293细胞，TC-1细胞等等)的蛋白印迹证实RGD/mFc融合蛋白的产生。扩增来自Stratagene的AD-LacZ并如上所述滴定且用作对照。
在将1×108PFU病毒直接注射到肿瘤(C57BL/6J小鼠中的TC-1肿瘤和裸鼠中的DU-145肿瘤)后，在两个肿瘤模型中都观察到肿瘤生长显著延缓(图16和17)。对于TC-1肿瘤细胞，第一次病毒注射后三天观察到病毒注射的肿瘤和对照肿瘤(AD-LacZ注射的肿瘤或PBS注射的肿瘤)之间的显著差异(P＝0.017和P＝0.016)。对于DU-145肿瘤细胞，第二次病毒注射后三天观察到病毒注射的肿瘤和AD-LacZ注射的肿瘤之间的显著差异(P＝0.023)。此外，与对照的肿瘤生长相比，小鼠左胁腹(未注射)的肿瘤生长也被显著抑制。
为检验RGD/mFc作为试剂的抗肿瘤生长作用，构建了编码RGD/mFc融合蛋白的腺病毒载体并转染入AD-293细胞，腺病毒颗粒分离自该细胞。将这些复制缺陷型病毒颗粒直接注射到肿瘤。结果显示病毒感染的细胞表达的RGD/mFc抑制鼠和人肿瘤两者的肿瘤生长。更重要地，表达的融合蛋白进入循环系统并到达远距离肿瘤且抑制它们的生长(图7)，而没有明显的副作用。不可能向人所有的肿瘤直接递送基因或蛋白；因此，新开发的抗肿瘤剂必须全身递送并能够到达远距离的肿瘤。
权利要求
1.一种包含靶向部分和触发免疫反应部分的抗肿瘤剂，其中(a)所述靶向部分选自抗体片段和肿瘤脉管系统结合肽；和(b)所述触发免疫反应部分选自免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段、显示与Fc区相同生物学功能的IgG的Fc片段的片段和外源的主要组织相容性复合体(MHC)的胞外结构域。
2.权利要求1的抗肿瘤剂，其中所述抗体片段体是单链抗体。
3.权利要求2的抗肿瘤剂，其中所述抗体片段结合选自前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CEA、CO17-1A和HER-2/neu的肿瘤抗原。
4.权利要求1的抗肿瘤剂，其中所述肿瘤脉管系统结合肽包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)或甘氨酸-丝氨酸-亮氨酸(GSL)。
5.权利要求1的抗肿瘤剂，其中所述IgG来自哺乳动物。
6.权利要求5的抗肿瘤剂，其中所述哺乳动物选自人、小鼠、山羊、母牛和绵羊。
7.权利要求6的抗肿瘤剂，其中所述哺乳动物是人。
8.权利要求1的抗肿瘤剂，其中所述外源的MHC选自H-2Kd和HLA-A0101。
9.权利要求1的抗肿瘤剂，还包含药物可接受的载体。
10.权利要求1的抗肿瘤剂，其中所述靶向部分和所述触发免疫反应部分通过主链-主链连接而融合。
11.权利要求1的抗肿瘤剂，其中所述靶向部分和所述触发免疫反应部分通过主链-侧链连接而融合。
12.一种包含编码权利要求10的抗肿瘤剂的核苷酸序列的表达载体。
13.一种抑制肿瘤生长的方法，包括给有需要的患者施用有效量的权利要求1的抗肿瘤剂。
14.一种抑制肿瘤血管生成的方法，包括给有需要的患者施用有效量的权利要求1的抗肿瘤剂。
15.一种治疗与新血管形成有关的疾病的方法，包括给有需要的患者施用有效量的权利要求1的抗肿瘤剂。
16.权利要求15的方法，其中所述疾病是癌症。
全文摘要
本发明提供了包含靶向部分和触发免疫反应部分的抗肿瘤剂。靶向部分可以是抗体片段或肿瘤脉管系统结合肽。触发免疫反应部分可以是免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段，显示出与Fc区相同的生物学功能的IgG的Fc片段的片段，或外源主要组织相容性复合体(MHC)的胞外结构域。该抗肿瘤剂具有抑制肿瘤生长，抑制肿瘤血管生成和治疗与新血管形成相关的疾病的用途。
文档编号A61K47/48GK1787838SQ200480012112
公开日2006年6月14日 申请日期2004年3月4日 优先权日2003年3月4日
发明者T·E·瓦纳, 魏彦章 申请人:格林维尔医院系统公司