一种胞内高温木聚糖酶基因及其蛋白表达与应用
【专利摘要】本发明属于生物工程及工业酶制剂领域，涉及一种胞内高温木聚糖酶基因xyn10B及其蛋白Xyn10B的表达与应用。高温木聚糖酶基因xyn10B来源于热解纤维素果汁杆菌(Caldicellulosiruptor kronotskyensis)。Xyn10B具有反应温度高、热稳定性好等优点，其最适反应温度与pH分别为70℃和6.0。在65℃热处理6h后仍能维持100％的酶活力。Xyn10B能直接作用于天然底物，与商业纤维素酶协同作用能明显提高天然木质纤维素生物质的降解率。Xyn10B作为新型酶制剂可广泛应用于饲料、食品和能源等领域，具有潜在的工业应用价值。
【专利说明】
一种胞内高温木聚糖酶基因及其蛋白表达与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物工程及生物质利用领域，具体地，本发明涉及了一种胞内高温木 聚糖酶基因及其蛋白的表达及应用。
【背景技术】：
[0002] 木质纤维素是地球上最丰富的生物质，由于其成本低廉被认为是生物燃料生产的 一项重要资源。木质纤维原料主要由木质素、纤维素和半纤维素组成。其中，半纤维素的完 全降解需要多种半纤维素水解酶的参与而共同完成。木聚糖酶作为主要的半纤维素酶，能 够随机水解半纤维素主要组分一一木聚糖主链上的β-1，4-糖苷键产生木糖和寡聚糖。嗜 热木聚糖酶与其它嗜中温酶相比，在生物质的降解上具有更明显的优势：高温酶可以储存 在室温下且不会失活；被微生物污染的风险显著降低；减少运输成本，减少在冷却过程中 产物的流失；增加生物质炼制的灵活性。目前，商业应用的木聚糖酶需具有高的比活力、高 耐热性、宽范围的pH值适应性和广泛的底物特异性。因此找到一个在极端的工业环境下可 以水解生物质的高稳定性和高酶活的木聚糖酶具有十分重要的意义。
[0003] 研究表明耐热性的木聚糖酶多来自高温厌氧细菌。已发现的厌氧型热解纤维 素杆菌Caldicellulosiruptor kronotskyensis能够在45-82°C的环境下生长，其生长 最适温度为70°C，并且能分解和利用纤维素、果胶、淀粉和木聚糖等（Margarita L et al.，2008)。C. kronotskyensis分泌的高温木聚糖酶具有相当可观的工业应用前景。然 而，该菌产生的木聚糖降解酶系组分复杂，分离纯化困难，加之其生长条件苛刻，生长密 度低，不适合工业化大规模生产。因此采用基因工程技术将此类嗜热微生物的重要糖苷 水解酶基因进行异源高效表达一直是研究的热点。目前该菌株的测序工作已经完成，通 过基因功能预测发现其基因组中存在多种潜在的木聚糖酶基因，我们从中选择了来源于 GHlO家族的木聚糖内切酶基因，以Escherichia coli BL21(DE3)为优选宿主菌构建了 C. kronotskyensis木聚糖酶基因 xynlOB重组工程菌，成功实现了木聚糖酶XynlOB的高效 异源表达。该木聚糖酶具有良好的热稳定性，并且在高温下拥有高效的酶活，可应用于工业 化生产。
【发明内容】
[0004] 发明目的：
[0005] 本发明的目的是提供一种高温木聚糖酶基因 xynlOB及其重组载体和重组工程 菌，以及该种酶的表达方法和应用。其发明目的包括：
[0006] 1.提供一种能够应用于工业的来源于热解纤维素菌Caldicellulosiruptor kronotskyensis的高温木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0007] 2.提供上述高温木聚糖酶的编码基因，其基因序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0008] 3.提供包含上述高温木聚糖酶基因的重组载体，包括大肠杆菌表达载体、乳酸菌 表达载体、枯草杆菌表达载体、酵母菌表达载体、丝状真菌表达载体等。将本发明的高温木 聚糖酶基因与线性质粒片段连接获得重组表达载体。重组表达质粒pET-28b-xynlOB作为 本发明的一个最优选的实施方案。
[0009] 4.提供包含上述高温木聚糖酶基因的重组工程菌株，所述菌株为大肠杆菌（如 Escherichia coli BL 21 (DE3)、E.coli ToplO、E.coli Rosetta(DE3)等）、乳酸菌（如 Lactococcus Iactis 等）、酉孝母菌（如 Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae 等）、枯草杆菌（如 Bacillus subtilis BSl68 等）和丝状真菌（如 Trichoderma reesei、 Aspergillus niger 等），优选为大肠杆菌 Ε· coli BL 21 (DE3)。
[0010] 5.提供一种制备上述高温木聚糖酶的方法及其在酶解天然木聚糖和木质纤维素 原料上的应用。
[0011] 本发明的技术方案：
[0012] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0013] (1)上述高温木聚糖酶基因 xynlOB工程菌的构建
[0014] ①提取热解纤维素菌C. kronotskyensis的基因组，设计引物进行PCR扩增，得到 的木聚糖酶基因片段和载体用XhoI和NdeI进行双酶切，连接转化到宿主细胞中，筛选阳性 克隆测序，获得重组表达载体。所述表达载体，是指大肠杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、枯 草杆菌表达载体、酵母菌表达载体、丝状真菌表达载体等，优选为将本发明提供的木聚糖酶 基因 xynlOB与线性质粒pET_28b相连接，得到重组表达质粒pET-28b_xynlOB。
[0015] ②提取重组质粒，转化宿主细胞，获得含有木聚糖酶基因 xynlOB重组菌。所述菌 株为大肠杆菌（如 E.coli BL 21(DE3)、E.coli ToplO、E.coli Rosetta(DE3)等）、乳酸菌 (如 L. Iactis 等）、酵母菌（如 P. pastoris、S. cerevisiae 等）、枯草杆菌（如 B. subtilis BS168等）和丝状真菌（如T. reesei、A. niger等），优选为大肠杆菌E. coli BL 21 (DE3)。
[0016] (2)上述高温木聚糖酶XynlOB的制备
[0017] ①将含有上述木聚糖酶基因 xynlOB的重组菌进行放大培养，并诱导表达。
[0018] ②收集菌体，通过超声破碎、Ni-NAT亲和层析以及凝胶分离层析对重组蛋白进行 分离纯化。
[0019] ③利用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达和纯化情况，并测定纯化蛋白的浓度。
[0020] (3)上述高温木聚糖酶XynlOB酶学性质测定
[0021] ①对木聚糖酶XynlOB进行最适pH、最适温度及热稳定性测定。
[0022] ②对木聚糖酶XynlOB进行特异性酶活测定。
[0023] (4)上述高温木聚糖内切酶XynlOB在酶解天然木聚糖和木质纤维素原料上的应 用
[0024] 称取一定量预处理天然木聚糖和木质纤维素原料，加入一定量的重组木聚糖酶 XynlOB酶液，于65°C、pH 6. 0条件下80rpm振荡水解，每隔一段时间取样，离心取上清液用 对羟基苯甲酸酰肼（p-hydroxybenzoic acid hydrazide，PHBAH)法测定还原糖含量，用薄 层层析法定性分析天然木聚糖和木质纤维素原料水解液的成分。
[0025] (5)上述高温木聚糖内切酶XynlOB与纤维素酶在协同水解天然木聚糖和木质纤 维素原料上的应用。
[0026] 按以下实验分组分别加入一定量的酶液至混有预处理的天然木聚糖和木质纤维 素原料的缓冲液中，对照组加入等量的缓冲液。将反应液混匀后于50°C、pH 5. 5条件下 SOrpm振荡水解，每隔一段时间取样，离心取上清液用高效液相色谱法定量分析所有实验组 天然木聚糖和木质纤维素原料水解液的成分。
[0027] 表1实验分组
【附图说明】
[0029] 图1 :Α·高温木聚糖内切酶XynlOB凝胶层析图谱；B. Superdex 200凝胶层析纯化 后 XynlOB 的 SDS-PAGE 分析。
[0030] 图2 :Α.不同pH对XynlOB活性的影响；Β.不同温度对XynlOB活性的影响。
[0031] 图3 :XynlOB的热稳定性。
[0032] 图4 :XynlOB与纤维素酶协同水解玉米芯产物分析。
[0033] 具体的实施方式
[0034] 实施例1 :高温木聚糖酶XynlOB重组表达载体pET-28b-xynlOB及重组工程菌的 构建
[0035] 用细菌基因组DNA提取试剂盒提取C. kronotskyensis细菌基因组，得到基因组 DNA，-20°C冻存备用。根据预测的木聚糖内切酶基因 xynlOB核苷酸序列，设计如下引物：
[0036] xynlOB-F:5'-GGAATTCCATATGAGCGAAGATTATTATG-3'
[0037] xynlOB-R:5'-CCGCTCGAGTAAAAAGTCAATTATTCTAAAAAATG-3'
[0038] 以基因组DNA为模板进行基因 PCR扩增，反应结束后将PCR产物进行琼脂糖凝胶 电泳，目的条带用DNA胶回收试剂盒回收。回收后的目的基因与质粒pET-28b用内切酶XhoI 和NdeI进行37°C双酶切过夜处理。酶切产物用PCR产物回收试剂盒进行纯化，酶切后的 xynlOB和pET-28b用T4 DNA Ligase 4°C连接处理12小时。取连接产物5μ1加入到冰浴 的100 μ I ToplO感受态细胞中，冰浴30min。然后42°C热激60s，冰浴2min。加入200 μ 1 LB液体培养基，于37°C下200rpm培养1小时。将菌液全部涂布于含有50 μ g/ml卡那霉素 的LB平板上，于37°C培养12-16小时。挑选单菌落于450 μ 1含有50 μ g/ml卡那霉素的 LB液体培养基中，37°C培养4-6小时。进行菌液PCR，反应结束后取5 μ 1反应产物进行琼 脂糖凝胶电泳检测，确定阳性克隆。测序正确后用质粒小提试剂盒提取质粒，获得重组表达 质粒 pET-28b_xynlOB。
[0039] 将重组表达质粒pET-28b-xynlOB转化到大肠杆菌coli BL21 (DE3)感受态细 胞中，于含有50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上37°C培养12-16h获得单菌落。挑取5个单 菌落于5ml含有50 μ g/ml卡那霉素 LB液体培养基中培养过夜，用甘油保存菌种，获得以 pET-28b为载体，以E. coli BL21 (DE3)为宿主菌构建的高温木聚糖酶XynlOB工程菌。
[0040] 实施例2 :高温木聚糖酶XynlOB在大肠杆菌中的表达
[0041 ] 重组菌株按照I %的接种量转接到100mL含50 μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基， 37°C 200rpm振荡培养至0D600达到0. 6左右时，加入IPTG至终浓度0.1 mM，继续振荡培 养4-6小时。培养结束后4000rpm 15min离心收集菌体，加入3ml Binding Buffer (50mM Tris-HCl pH7.5,300mM NaCl)重悬菌体。用超声破碎仪超声破碎后，4°C 1000 Og离心30min 所得上清即为粗酶液。
[0042] 实施例3 :重组高温木聚糖酶在毕赤酵母中的表达
[0043] 以C. kronotskyensis基因组为模板，设计引物扩增得到高温木聚糖酶基因 xynlOB，连入载体pPIC9。连接产物转化至大肠杆菌ToplO感受态细胞，涂板于含氨苄的低 盐LB固体培养基上37°C过夜培养。确定阳性克隆，测序正确后提取质粒，获得重组表达质 粒pPIC9-xynlOB。线性化的质粒载体电转化进入毕赤酵母GSl 15感受态，在MD培养基平板 上30°C培养2-3d筛选阳性转化子。提取阳性转化子基因，进行PCR验证，进一步确定阳性 转换子。挑取单克隆接种至含100ml YH)的摇瓶中。在摇床中30°C，220rpm培养至0D600 =5。室温下3000g离心5min收集细胞，用BMMY诱导培养基重悬细胞，放入摇床继续培养。 每隔24h加入甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导，连续培养72h后测定诱导发酵液上清中木 聚糖酶活性。
[0044] 实施例4 :重组高温木聚糖酶XynlOB的纯化
[0045] 利用重组酶含有组氨酸标签，用Ni-NAT亲和层析对重组蛋白进行纯化。用含有 500mM咪唑的Elution Buffer(50mM Tris-HCl pH 7. 5,300mM NaCl)洗脱与Ni-NAT结合的 重组蛋白并收集洗脱液。收集到的洗脱液加入处理过的透析袋，在柠檬酸缓冲液（PH6.0) 中透析24h去除咪唑和换缓冲液。将去除咪唑后的酶液进行葡聚糖凝胶层析，出现波峰时 收集蛋白，凝胶层析图谱如图IA所示。将分离得到的样品放入透析袋，用聚乙二醇浓缩样 品，用Bradford法在OD 595下测定蛋白浓度为0. 645mg/ml。取纯化后的样品5 μ 1加入20 μ 1 5Χ蛋白电泳上样缓冲液，充分混勾后煮沸10min，13000rpm离心10min，取8 μ 1上清进行 SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达和纯化情况。结果如图IB所示，可看到单一的电泳带， 蛋白分子量为39KDa。
[0046] 实施例5 :重组高温木聚糖酶XynlOB酶学性质测定
[0047] 5. 1最适反应pH和最适反应温度
[0048] 纯化的重组高温木聚糖酶XynlOB在不同pH下测定重组高温木聚糖酶的活力，测 得最适pH为6. 0,且在5. 5-8. 0的反应条件下，其活力仍能达到最高酶活的60 %以上，如图 2A所示。
[0049] 纯化的重组木聚糖酶在不同温度（40_100°C )下测定其水解木聚糖活力，测得最 适反应温度为70°C，且在60-80°C的反应条件下，仍能达到最高酶活的85%以上，如图2B所 不。
[0050] 5. 2热稳定性
[0051] 重组酶XynlOB在65、70、75°C下，处理0、0· 5、1、2、3、4和6小时，然后在其最适反 应条件下用PHBAH法测定其剩余酶活。重组酶在65°C下孵育6小时能维持稳定，在70°C时 其半衰期为2h，在75°C时其半衰期为5min，结果如图3所示。
[0052] 5. 3特异性酶活测定
[0053] 木聚糖酶活力单位定义：在特定条件下（最适反应温度和pH)，每分钟产生1 μ mol 木糖所需要的酶量为一个酶活力单位（U)。
[0054] 重组酶XynlOB在70°C、pH 6. 0的条件下，加入到70°C预热5min的榉木木聚糖或 燕麦木聚糖溶液中反应2min。用PHBAH法测定还原糖含量，计算XynlOB对不同底物的比活 力（表2)。 「00551 弃2 _异柿_法
L0057」 买施例6 :里组高温木聚糖_ XynlOB ^^觯桦木木聚糖和低聚木糖
[0058] 取重组粗酶液，分别加入到50 μ 1含有1 %榉木聚糖或2%低聚木糖的底物溶液 中，在65°C，pH 6.0条件下水解4h，水解产物进行薄层层析检测。榉木木聚糖水解产物主 要为木二糖、木四糖和少量的木糖。低聚木糖的最终水解产物主要为木二糖及少量的木糖。 [0059] 实施例7 :利用重组木聚糖酶XynlOB降解甘蔗渣木聚糖
[0060] 用碱抽提法从甘蔗渣中提取木聚糖，用pH 6. 0柠檬酸缓冲液配制甘蔗渣木聚糖 悬浊液，13000rpm离心10min，离心上清即为可溶性甘蔗渣木聚糖。加入一定量的重组高 温木聚糖酶XynlOB，在pH 6.0、65°C条件下600rpm振荡水解12h。反应结束后将样品煮沸 IOmin灭活，水解样品13000rpm离心20min，上清液用PHBAH法测定还原糖含量，用薄层层 析法分析甘蔗渣木聚糖水解液中产物的成分。结果显示，酶解12h后，酶解液主要成分为木 糖和木二糖。酶解产物木寡糖含量为87. 5 %，木二糖含量超过60 %，木糖含量为2. 1 %，木 聚糖降解率达到80. 0%。
[0061] 实施例8 :利用重组木聚糖酶XynlOB与商业纤维素酶协同水解玉米芯
[0062] 用粉碎机将玉米芯粉碎，玉米芯渣用自来水反复冲洗直至浸出液体变为无色。然 后用蒸馏水冲洗3次，放入干燥箱烘干。实验组1加入2 μ g重组木聚糖酶粗酶液；实验组2 加入终浓度150 μ g/ml的商业纤维素酶Cellic CTec2 (诺维信）；实验组3加入2 μ g重组 木聚糖酶和终浓度150 μ g/ml的Cellic CTec2 ;实验组4加入终浓度150 μ g/ml的商业纤 维素酶（苏柯汉）；实验组5加入2 μ g重组木聚糖酶和终浓度150 μ g/ml的纤维素酶（苏 柯汉）。将所有样品置于80°C下振荡酶解48h后分别抽取反应液，离心取上清液用PHBAH 法测定还原糖含量，用高效液相色谱法分析玉米芯水解液中单糖的成分。结果显示，重组木 聚糖酶XynlOB与Cellic CTec2协同水解玉米芯效果最好。如图4所示，酶解48h后，实验 组3水解液中葡萄糖产量增加32. 8% ;葡萄糖产量增加58. 0%。
【主权项】
1. 一种高温木聚糖酶基因 xynlOB，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；来 源于热解纤维素果汁杆菌（Caldicellulosiruptor kronotskyensis)。2. 权利要求1所述的高温木聚糖酶基因表达的高温木聚糖酶XynlOB，其特征在于：其 氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3. 权利要求2所述的高温木聚糖酶XynlOB，其氨基酸序列SEQ ID NO: 2中的氨基酸经 过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白质。4. 一种用于扩增如权利要求1所述的高温木聚糖酶基因 xynlOB的方法，其特征在于： 所使用引物对为： xynlOB-F:5'-GGAATTCCATATGAGCGAAGATTATTATG-3' xynlOB-R:5' ~CCGCTCGAGTAAAAAGTCAATTATTCTAAAAAATG~3, 〇5. -种高温木聚糖酶重组载体和重组工程菌，其特征在于含有权利要求1所述的 木聚糖酶基因 xynlOB ;所述高温木聚糖内切酶基因的重组表达载体，是指大肠杆菌表达 载体、乳酸菌表达载体、枯草杆菌表达载体、酵母菌表达载体、丝状真菌表达载体等；所述 重组工程菌株为大肠杆菌（如 Escherichia coli BL 21 (DE3)、E.coli ToplO、E.coli Rosetta(DE3)等）、乳酸菌（如 Lactococcus lactis 等）、酵母菌（如 Pichia pastoris、 Saccharomyces cerevisiae 等）、枯草杆菌（如 Bacillus subtilis BS168 等）和丝状真 菌（如 Trichoderma reesei、Aspergillus niger 等）。6. -种制备高温木聚糖酶的方法，其特征在于： 1) 用权利要求5所述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2) 培养权利要求5所述的重组工程菌，诱导高温木聚糖酶表达； 3) 回收和纯化所表达的高温木聚糖酶XynlOB。7. 权利要求2所述的高温木聚糖酶在酶解天然木聚糖和木质纤维素原料上的应用，其 酶解的最佳温度和pH分别为70°C和6. 0,并且能在65°C孵育6小时内维持稳定。8. 权利要求2所述的高温木聚糖酶与其他半纤维素酶或纤维素酶在天然木聚糖和木 质纤维素原料上的协同应用，天然木聚糖和木质纤维素原料酶解效果提高10-60%。
【文档编号】C12N15/56GK105861527SQ201510035909
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月23日
【发明人】韩业君, 乔玮博, 贾晓静
【申请人】中国科学院过程工程研究所