一种二化螟Bt蛋白受体ALP4基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种新的二化螟Bt蛋白受体ALP4基因及其应用， 本发明还涉及一种检测二化螟对Bt杀虫蛋白抗性的方法。
【背景技术】
[0002] 二化螟属鳞翅目，螟蛾科，是水稻上危害最为严重的常发性害虫，国内各稻区均有 分布，以长江流域及以南稻区发生较重，近年来数量呈明显上升的态势，给农业生产造成严 重威胁。
[0003] 苏云金芽孢杆菌Bacillus thurihgiehsis，简称Bt，属于芽孢杆菌科 Bacillaceae芽孢杆菌属Bacillus，是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界中。自上世纪 30年代以来，Bt即作为生物杀虫剂被广泛用于田间害虫防治，CrylAc、Cry2Aa均为Bt中的 杀虫蛋白。
[0004] ALP (alkaline phosphatase,碱性磷酸酶）在鞘翅目、双翅目与鳞翅目昆虫中被 鉴定为Bt蛋白受体。昆虫体内存在着两类碱性磷酸酶：膜结合碱性磷酸酶和可溶性碱性 憐酸酶。ALP有13个重要的功能保守位点，包括3个底物结合位点、10个Zn2+和Mg2+结 合位点，其中疏水膜销定区位于C端。昆虫mALP为金属离子依赖性酶，含有N-乙酰半乳糖 胺（GalNAc)，通过GPI锚定到中肠 BBMV上与Bt蛋白特异性结合，参与蛋白对昆虫的毒杀作 用。另外，ALP表达量下降与昆虫对Bt的抗性密切相关，抗性品系中ALP活性约为敏感品 系的30%。
[0005] 随着转Bt基因作物种植规模的逐步扩大，昆虫对Bt产生抗性的风险也日益增加。 目前国内外的许多研宄已证明，鳞翅目、鞘翅目和双翅目的多种昆虫经过室内汰选后可以 对不同的Bt蛋白产生抗性。Bt杀虫蛋白对害虫的作用机理是研宄防止抗性形成的基础，因 此为了制定和实施合理的抗性治理策略，实现转Bt作物的可持续利用，研宄昆虫对Bt产生 抗性的机理就显得尤为重要。
[0006] 二化螟对Bt杀虫蛋白的抗性检测仍局限于生物测定方法。然而，传统的生物测 定方法有一些缺点：（1)灵敏度低：生物测定很难检测早期抗性或低频率抗性；（2)周期长： 二化螟的Bt生物测定结果一般需要2天（48小时）以上；（3)对试虫数量要求很大：测定 一个标准曲线完成一次生测至少需要约200头试虫，且对昆虫饲养的要求也很高；(4)操作 麻烦且标准性不强：方法比较繁琐，操作起来比较复杂，从虫源、饲养到测定难以做到真正 的标准化，尤其要求试虫的大小一致，不仅导致生测的工作量加大，而且诸多人为因素也会 影响生测结果；（5)传统的方法从软件绘出的标准曲线求出的LC 5tl和LC9tl值的重复性和精 确性较低；(6)传统的生物测定方法测得的昆虫抗性水平往往具有滞后性。因此，建立一种 准确、简便、快速、可靠的二化螟Bt抗性检测手段尤为迫切。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种二化螟Bt蛋白受体ALP4基因，并进一步 提供所述基因在检测二化螟对Bt杀虫蛋白抗性中的应用。
[0008] 上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0009] 本发明提供的二化螟Bt蛋白受体ALP4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。 [0010] 进一步，本发明将ALP4基因通过构建原核表达载体获得了重组ALP4蛋白，并研宄 了重组ALP4蛋白与Bt杀虫蛋白的结合能力，结果发现该重组蛋白能与Bt杀虫蛋白特异性 结合，从而验证了 ALP4基因的功能。
[0011] 在此基础上，提供了一种检测二化螟对Bt杀虫蛋白抗性的方法，它包括以下步 骤：
[0012] 1)二化螟总基因组DNA的提取；
[0013] 2)设计特异性引物，按常规方法进行PCR扩增、纯化、测序；
[0014] 3)将测序结果与所述的二化螟Bt蛋白受体ALP4基因序列进行对比，检查回收得 到的DNA是否出现突变位点；
[0015] 所述特异性引物为：
[0016] 上游引物序列为 ATGAGGTTGCGTTTATTTTTGTTAGTTG ;
[0017] 下游引物序列为 TTCGCAGACAGTTTTGCCATCACC。
[0018] 本发明的有益效果是：
[0019] 1)与传统的二化螟对Bt杀虫蛋白抗性检测方法相比，本发明所提供的方法无需 将田间试虫饲养至适宜虫龄后再进行测定以确定抗性水平，而是直接从田间采样测试，不 需饲养试虫，从而减少了中间过程，缩短了检测周期，节省了劳动力和资源。
[0020] 2)本发明具有检测速度快，检测结果准确可靠，检测灵敏度和精度高，检测所需的 试虫数量少，能实现真正的标准化操作，为二化螟对Bt杀虫蛋白抗性的实时监测提供了一 种新方法，进一步为二化螟虫害的有效治理提供了重要参考。
【附图说明】
[0021] 图1是ALP4基因3' -RACE片段、5' -RACE片段和ORF(开放阅读框）片段扩增产 物电泳图。图中：M1 为 DL2000DNAmarker ;M2 为 DLlOOODNAmarker ;第 1 道为 3' -RACE cDNA 片段；第2道为5' -RACE cDNA片段；第3道为ORF片段。
[0022] 图2是重组质粒pET-28a(+)-ALP4的酶切鉴定。图中：1是ALP4基因双酶切；M是 DL5000Marker ;2 是 pET-28a 双酶切。
[0023] 图3是重组菌株pET-28a(+)-ALP4表达产物的SDS-PAGE分析，以及重组蛋白ALP4 的蛋白纯化与结合分析。图中M :26616 (Fermentas) ;1 :CK(重组载体未诱导）；2 :表达（重 组载体IPTG诱导）；3 :重组蛋白纯化；4 :重组蛋白ALP4与CrylAc结合。（说明：图中ECL 发光显影呈现黑色条带表示重组蛋白ALP4可与Bt蛋白结合。）
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0025] 实施例1基因的克隆
[0026] L 按照 SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit 要求，设计克隆二化螟 Bt 蛋白 受体ALP4基因全长cDNA的PCR引物：
[0027] GSPl = 5'-GCAGACAGTTTTGCCATCACCGAAGC-3' ；
[0028] GSP2 = 5,-TCACCACCCGAGTATTTGATGGGGCTGTT-3,。
[0029] 2.二化螟中肠总RNA的提取：
[0030] 二化螟敏感品系在人工饲料上室内饲养多代，未接触任何Bt制剂或蛋白。
[0031] ①用于RNA提取的玻璃器皿经过去RNA酶处理（180 °C，烘烤4h);
[0032] ②准备12-15头二化螟4龄幼虫，在冰上解剖取其中肠，在预冷的0. 7% NaCl中漂 洗干净，用滤纸将缓冲液吸干，放入玻璃匀浆器；
[0033] ③加入Iml Trizol，在冰上充分匀浆后转入I. 5ml离心管，室温孵育5min ;
[0034] ④加入200 μ 1氯仿，剧烈震荡15sec，室温放置3min，4°C，12000rpm离心20min ;
[0035] ⑤小心将上清转移到另一干净离心管中，加入500 μ 1异丙醇，上下颠倒混匀，4°C 孵育15min ;
[0036] ⑥4°C，12000rpm离心lOmin，弃上清，加入800 μ 1 70%乙醇清洗沉淀；
[0037] ⑦4°C，7500rpm离心5min，用移液枪将乙醇彻底去除，干燥沉淀；
[0038] ⑧加入适量去RNA酶的水，溶解沉淀；
[0039] ⑨用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测RNA的纯度和浓度。
[0040] 3. cDNA 第一链合成
[0041] ①混匀以下试剂，并瞬时离心，将反应管室温放置：
[0042] 5X First-Strand Buffer 2 Ομ? DTT (二硫苏糖醇 20mM) 1 .Ομ? dNTP Mix (IOmM) 1.Ομ? 总体积 4 Ομ?
[0043] ②分别向这些管中加入对应的以下试剂：
[0044] 准备 5'-RACEcDNA RNA Ι.ΟμΙ 5'-CDS PrimerA 1 Ομ? (IdH2O 1.75μ1 准备 3'-RACEcDNA
[0045] RNA 1 .Ομ? 3'-CDS Primer y\ I .Ομ? ddH20 2.75μ1
[0046] 混勾试剂，瞬时离心，72°C孵育3min，然后42°C冷却2min，最后14, OOOrpm离心 IOsec0
[0047] ③向5' RACE反应管中各加入1 μ I SMARTer IIA oligo,混匀后瞬时离心。
[0048] ④室温下，按顺序混匀以下试剂：
[0049] 预混缓冲液 4.0μ] RNase 抑制剂(4〇υ/μ1) 0.25μ? SM ARTScribe? Reverse Transcriptase (IOOU) I ·0μ1 总体积 5.25μ1
[0050] ⑤分别向5' -RACE、3' -RACE的RNA反应管中加入步骤④中的5. 25 μ 1混合物，每 管体积均为10 μ 1，使用枪轻柔地混匀试剂，瞬时离心。
[0051] ⑥42°C孵育90min，70°C加热IOmin终止反应。
[0052] ⑦用150 μ I EDTA缓冲液稀释第一链反应产物，-20 °C保存。
[0053] 4. cDNA 5' 末端快速扩增一 5'-RACE
[0054] 根据SMARTer? RACE cDNA扩增试剂盒中5' -full race试剂盒说明书进行，具体 方法如下：
[0055] ①准备预混液用于PCR反应，每次的反应总体积是50 μ 1，混合以下试剂：
[0056] 超纯水 34.5μ1 IOxPCR反应缓冲液 5.()μ1 dNTP Mix(IOmM) Ι.ΟμΙ 5〇xAdvantage 2 Polymerrse Mix I .ΟμΙ 总体积 41.5μ1
[0057] ②PCR反应体系：
[0058] 5'-RACE cDNA 2.5μ1 UPM(IOx) 5μ1 GSPl(K^M) Ιμ?
[0059] 预混液 41.5μΙ 总体积 50μ1
[0060] PCR反应程序：
[0061] 94°0预变性31^11;94°0变性3〇8,72°0复性延伸21^11，5个循环 ：94°0变性3〇8， 70°C复性 30s，72°C延伸 2min，5 个循环；94°C变性 30s，68°C复性 30s，72°C延伸 2min，25 个 循环；72°C延伸IOmin。
[0062] 扩增完成后，取PCR产物用6X核酸上样缓冲液点样，1. 0%琼脂糖凝胶，IXTAE缓 冲液，120V，电泳20分钟观察结果。扩增结果如图1第2道所示得到1069bp的DNA片段。
[0063] 将DNA片段纯化后连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌TOPlO感受态细胞中，筛 选阳性克隆子送南京金斯瑞公司进行测序分析。
[0064] 5. cDNA 3' 末端快速扩增一 3'-RACE
[0065] ①准备预混液用于PCR反应，每次的反应总体积是50 μ 1，混合以下试剂：
[0066] 超纯水 34.5μ1 IOxPCR反应缓冲液 5.0μΙ dNTP Mix(IOmM) Ι.ΟμΙ 5〇xAdvantage 2 Polymerrse Mix Ι.ΟμΙ 总体积 41.5μ1〇
[0067] ②PCR反应体系：
[0068] 3r RACE cDNA 2.5μ1 UPM(IOx) 5μ1 GSP2(1(^M) 1 μ? 预混液 41.5μ1 总体积 50μ1〇
[0069] PCR反应程序：
[0070] 94°0预变性31^11;94°0变性3〇8,72°0复性延伸21^11，5个循环：94°0变性3〇8， 70°C复性 30s，72°C延伸 2min，5 个循环；94°C变性 30s，68°C复性 30s，72°C延伸 2min，25 个 循环；72°C延伸IOmin。
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