专利名称：二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR及其编码的蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、细胞生物学以及农药学领域，主要是一种在二化螟中表达的鱼尼丁受体基因(核酸序列)及其编码蛋白。本发明还涉及该蛋白和受体基因(核酸序列)的制备方法和用途。
背景技术：
鱼尼丁受体(RyR)的命名来自于从南美的一种大风子科的豆科植物Ryaniaspeciosa中分离出来的植物碱杀虫剂鱼尼丁(ryanodine)。研究证明，鱼尼丁是通过作用于RyR而产生杀虫效果的(Fill and Copello，2002)。但 由于其结构复杂，难于改造，成本高和毒性高等因素，因而限制了其作为杀虫剂的使用。经过长期研究，日本农药终于(NihonNohyaku)发现了邻苯二甲酰胺类化合物(phthalic diamides)的杀虫活性,并从中商品化了氟虫酰胺(Tohnishi et al.，2005)。几乎同时美国杜邦对也该类化合物做了较大结构改变和修饰，发现了一类新的邻甲酰氨基苯甲酰胺类(anthranilic diamides)杀虫剂,并从中商品化了氯虫酰胺(Lahm et al.，2005)。该化合物不仅在结构上与氟虫酰胺相似，即都具有二酰胺基元，故称它们为二酰胺类杀虫剂，而且都作用于RyR。这类杀虫剂是一类对鳞翅目等害虫高效，对哺乳动物低毒、安全，作用机理独特，无交互抗性和对环境友好的新型杀虫剂。在农药发展史上，该类杀虫剂是继以吡虫啉为代表的新烟碱类杀虫剂后的又一个新的突破(Nauen，2006)。所以目前包括杜邦、拜耳等在内的农化巨头们正在继续加紧开发二酰胺类杀虫剂，同时试图筛选更多作用于RyR的新颖化学结构的杀虫活性物质(Lahm etal. ,2009)。细胞内游离Ca2+浓度的改变是细胞生理功能的重要物质基础，它的变化是Ca2+跨膜转运和细胞内钙库释放、摄取Ca2+等动态平衡的结果。RyR和三磷酸肌醇受体(IP3R)(Berridge,1993)共同组成了两类主要的位于细胞内质网/肌浆网(SR/ER)上的调节胞内钙库释放Ca2+的通道蛋白(Berridge et al.，2000)。哺乳动物体内共有三种不同基因编码的RyR =RyRl主要在骨骼肌中表达，参与骨骼肌的兴奋-收缩，中枢神经中也有少量表达；RyR2主要表达于心肌中，是心肌收缩偶联不可或缺的成分；RyR3表达于一些特定的肌肉及非肌肉组织中，包括脑、神经等组织。RyR由4个分子量约为560kD的相同亚单位组成，是分子量很大的膜蛋白，包含了大量伸入胞浆的决定其特性的N末端结构域，这些结构域分布着通道调节物的结合位点(Fill and Copello，2002)。虽然人们很早就通过生理生化等方法等发现昆虫的肌肉细胞中存在着大量的RyR位点(Vazquez-Martinez et al.，2003)，但是相对于哺乳动物RyR较为系统完整的研究，昆虫RyR分子水平的研究在很长时间内几乎是一篇空白，只有果蝇(Drosophilamelanogaster)的 RyR 基因全长 cDNA 被克隆(Takeshima et al. , 1994)并且进行了通道动力学的研究(Xu et al.，2000)。随着二酰胺类杀虫剂的发现和上市，昆虫RyR也逐渐成为研究热点。杜邦公司在Sf9细胞系中对不同种属昆虫的功能性RyR的全长基因进行了克隆与表达并申请了专利(W02004027042)，这些昆虫包括鳞翅目烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、同翅目桃虫牙(Myzus persicae)、棉虫牙(Aphis gossypii)和玉米飞風(Peregrinus maidis)。京都大学和日本农药公司克隆了家蚕(Bombyx mori)的RyR基因并且成功在HEK293细胞系获得稳定高效表达(W02007094408)。这些被注册专利的基因序列具有广泛的用途，如可用于大量化合物杀虫活性筛选方法的建立，用于该受体蛋白抗体的制备，用于生物农药的开发以及用于转基因作物研究等。参考文献具体如下I、Berridge MJ. 1993. Inositol trisphosphate and calcium signalling.Nature 361 :315-325 (磷酸肌醇和钙信号，《自然》)。2λBerridge MJ,Lipp P，Bootman MD. 2000. The versatility and universalityof calcium signalling. Nat. Rev. Mo I. Cell Biol. I :11-21 (I丐信号的多样性和普遍性，《自然分子生物学综述》)。3、Fill M，Copello JA. 2002. Ryanodine receptor calcium release channels.Physiol. Rev. 82 :893-922 (钙离子释放的鱼尼丁受体通道，《生理学综述》)。4λLahm GP,Cordova D，Barry JD. 2009. New and selective ryanodine receptoractivators for insect control. Bioorg. Med. Chem. 17 :4127-4133 (新型用于害虫控制的选择性鱼尼丁激活剂，《生物有机和医学化学》)。5λLahm GP,Selby TP,Freudenberger JH,Stevenson TMiMyers BJ,Seburyamo G，Smith BK，Flexner L，Clark CE，Cordova D.2005.Insecticidal anthranilic diamides a new class of potent ryanodine receptor activators. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 4898-4906 (邻甲酰氨基苯甲酰胺类杀虫剂一类新的潜在鱼尼丁受体激活剂，《生物有机和医学化学》)。6、Nauen R. 2006. Insecticide mode of action return of the ryanodinereceptor. Pest Manag. Sci. 62 :690-692 (杀虫剂作用机理鱼尼丁受体的回归，《有害生物治理科学》)。7、Takeshima H,Nishi M,Iwabe N,Miyata T,Hosoya TiMasai I,Hotta Y. 1994.Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calciumrelease channel in Drosophila melanogaster. FEBS Lett. 337 :81-87 (分离和解析一种果蝇的鱼尼丁受体/钙离子释放通道，《欧洲生物化学学会通信》)。8、Tohnishi M，Nakao H，Furuya T，Seo A，Kodama H，Tsubata K，Fujioka S，Kodama H，Hirooka T，Nishimatsu T. 2005. Flubendiamide,a novel insecticide highlyactive against lepidopterous insect pests. J. Pestic. Sci. 30 :354-360 (氟虫苯甲酉先胺，一种新型针对鳞翅目害虫的高效杀虫剂，《农药科学杂志》)。9、 Vazquez-Martinez 0， Canedo-Merino R， Diaz-Munoz M， Riesgo-EscovarJR. 2003. Biochemical characterization,distribution and phylogenetic analysis ofDrosophila melanogaster ryanodine and IP3 receptors，and thapsigargin-sensitiveCa2+ ATPase. J. Cell Sci. 116 :2483-2494(对果蝇鱼尼丁受体、三磷酸肌醇受体和毒胡萝卜素敏感型钙泵的生化，分布和系统发育分析，《细胞科学杂志》)。10、Xu X，Bhat MB, Nishi M，Takeshima H，Ma J. 2000. Molecular cloning ofcDNA encoding a drosophila ryanodine receptor and functional studies of the、carboxyl-terminal calcium release channel. Biophys. J. 78 :1270-1281 (分子克隆一种果蝇鱼尼丁受体并对其羧基端的钙释放通道的功能研究，《生物物理杂志》)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种鱼尼丁受体蛋白CsRyR及其编码的基因，以及利用该受体表达细胞系进行杀虫活性物质筛选的技术。为了解决上述技术问题，本发明提供一种二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR，编码具有 二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO :I中的核苷酸序列有至少70%的同源性。作为本发明的二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR的改进该二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR为SEQ ID NO : I所示的核苷酸序列。本发明还同时提供了上述二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID No :2所不的氣基酸序列。本发明还同时提供了一种重组载体，该重组载体包含上述二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR0本发明还同时提供了用上述重组载体转染的宿主细胞，宿主细胞为HEK_293，CH0，COS, Sf9, S2 或 Sm。本发明还同时提供了上述二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR的用途用来筛选和/或评价调控鱼尼丁受体活性的物质。作为本发明的二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR的用途的改进用来筛选和/或评价调控鱼尼丁受体活性的物质的方法包括如下步骤I)、将上述重组载体转染宿主细胞系；2)、用候选物质处理步骤I)所得的细胞；3)、检测步骤2)所得的细胞内钙离子浓度的变化；当钙离子浓度出现变化时，说明候选物质能调控鱼尼丁受体活性。—般而言只要和对照(如只加入溶剂时)的反应相比有显著差异即可，即，只要确认有钙离子浓度的信号变化即可。在本发明中，发明人在二化螟中克隆到鱼尼丁受体基因CsRyR。在本发明之前，尚未有任何公开或报道过本发明中提及的二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR序列及其编码的基因(核酸序列)。本发明的目的在于提供二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR及其编码的基因(核酸序列)，并可以用该序列来转染构建稳定表达该受体的细胞系，通过该细胞系可以对针对该受体靶标的杀虫活性物质进行筛选。在本发明所分离出的DNA分子包括编码具有二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO :1中从核苷酸第1-15387位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55摄氏度条件下与SEQID NO :1中从核苷酸第1-15387位的核苷酸序列杂交。较佳的，所述的序列编码具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ IDNO :1中从核苷酸第1-15387位的核苷酸序列。备注说明在SEQ ID NO 1的末尾含有终止码。
本发明分离出的二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR包括具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或者其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO: 2序列的多肽。本发明DNA分子转化的宿主细胞是真核细胞。在本发明中，“分离的”、“纯化的” DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本发明中，二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR编码的核酸序列指编码具有二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO 1中第1-15387位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO :I序列编码框第1-15387位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产 生的序列。由于密码的简并性，所以与SEQ ID NO :1中第1-15387位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO :I所述的序列。还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO:中从核苷酸第1-15387位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO :1中从核苷酸第1-15387位的核苷酸序列的同源性至少70 %，较佳地至少80 %，更佳地至少90 %，最佳地至少95%的核苷酸序列。还包括能编码具有天然的二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR相同功能的蛋白的SEQ ID NO :1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR指具有二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR活性的SEQ ID NO :2序列的多肽。该术语还包括具有与天然二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR相同功能的、SEQ ID NO :2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地以5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又别如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR的活性片段和活性衍生物。在本发明中二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR保守性变异多肽指与SEQ ID NO 2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行替换而产生。表I
最初的残基代表性的取代优选的取代
Ala(A)Val ；Leu ；IleVal
权利要求
1.ニ化螟鱼尼丁受体基因CsRyR，其特征在于编码具有ニ化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO 1中的核苷酸序列有至少70%的同源性。
2.根据权利要求I所述的ニ化螟鱼尼丁受体基因CsRyR，其特征是所述ニ化螟鱼尼丁受体基因CsRyR为SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列。
3.如权利要求I或2所述的ニ化螟鱼尼丁受体基因CsRyR编码的蛋白质，其特征在于该蛋白质具有SEQ ID No :2所不的氣基酸序列。
4.ー种重组载体，其特征在于所述重组载体包含权利要求I或2所述的ニ化螟鱼尼丁受体基因CsRyR。
5.用如权利要求4所述的重组载体转染的宿主细胞，其特征在干所述宿主细胞为HEK-293, CHO, COS, Sf9, S2 或 Sm。
6.如权利要求I或2所述的ニ化螟鱼尼丁受体基因CsRyR的用途，其特征在于用来筛选和/或评价调控鱼尼丁受体活性的物质。
7.根据权利要求6所述的ニ化螟鱼尼丁受体基因CsRyR的用途，其特征在于用来筛选和/或评价调控鱼尼丁受体活性的物质的方法包括如下步骤 .1)、将如权利要求4所述的重组载体转染宿主细胞系； .2)、用候选物质处理步骤I)所得的细胞； .3)、检测步骤2)所得的细胞内钙离子浓度的变化；当钙离子浓度出现变化时，说明候选物质能调控鱼尼丁受体活性。
全文摘要
本发明公开了一种二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR，其编码具有二化螟鱼尼丁受体蛋白CsRyR的核苷酸序列，核苷酸序列与SEQ ID NO1中的核苷酸序列有至少70％的同源性。本发明还同时公开了上述二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列。本发明的二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR的用途为用来筛选和/或评价调控鱼尼丁受体活性的物质。
文档编号C12N5/10GK102628049SQ20121009794
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者叶恭银, 吴顺凡, 黄佳 申请人:浙江大学