专利名称：抗人雌激素受体单克隆抗体及抗人孕激素受体单克隆抗体的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类用于临床检测乳腺癌、子宫内膜癌及各种激素依赖性肿瘤患者癌组织中雌激素受体(ER)及孕激素受体(PR)水平的生物检测试剂。
乳腺癌在发达国家中的发病率高并逐年上升，以美国占首位。70年代其新的发病人数为8万人/年；美国每年的患病率以3％的速度上升。至92年据不完全统计已达18万人/年。在我国以北京为例，82年18.4人/10万人患病，92年为24.3人/10万人患病，预计2000年，36人/10万人将患有乳腺癌，也呈上升趋势。
目前对乳腺癌的治疗手段有手术切除、化疗、放疗及内分泌疗法等。化疗与放疗杀伤癌细胞同时，对人的机体免疫功能亦有很大损害，恶心、呕吐、脱发、血像改变尤其是白血球降至极低使患者难以耐受以至中断治疗，而内分泌疗法具有毒性极微，副作用少，有效时间持续长可明显改善患者的生活质量，是提高乳腺癌疗效的重要途径之一。自从1971年Jensen等报告了测定乳腺癌标本中的ER能预测病人预后及帮助选择治疗方案以后，有关乳腺癌与ER、PR关系的研究有了很大进展。测定乳腺癌组织中ER、PR含量在临床上有以下作用(1)为选择治疗方案提供科学依据。(2)预测乳腺癌的临床进展。(3)预测化疗疗效。(吕宝璋等，受体学概论P281-283，1991，科学出版社，北京)为此在治疗前对乳腺癌的生物学特性进行分类，这对乳腺癌采用何种治疗方法及其估测愈后至关重要。
临床上根据乳腺癌的生物学特性，可将其分为两类。一类乳腺癌组织含有ER称为激素依赖性乳腺癌，内分泌治疗有效，另一类乳腺癌组织一般不含有ER或含量极低，以至于检测不到，称为激素非依赖性乳腺癌，内分泌治疗无效，国外报道(Megvire WL，et alEstrogen Receptors in HumanBreast Cancer，An Overview Estrogen Receptors in HumanBreast Cancer，Meguire WL，(eds)，pl，New York RavenPress，1975.)ER阳性者，经内分泌治疗有效率可达60％左右，而ER阴性者仅为10％左右。现已达到共识的是检查ER同时检测PR表达水平更能提高估测疗效及预后的准确率。ER(+)、PR(+)双阳性者内分泌治疗有效率达74-90％(Meguire，WL，etal.Progesterone ReceptorsIntroduction and overviewProgesterone Receptors in Normal and Neoplastictissue，Pl，New York Raven Press，1977；Edwards DP，etalEstrogen and Progesterone Receptor proteins inbreast cancer.Bioc.Biop.Acta.560457，1979)因此为避免盲目用药，提高乳腺癌的疗效，同时测定乳腺癌组织中ER、PR水平是必要的。
目前国内检测ER的方法有以经典的DCC法(张慧影等。乳腺癌激素受体的研究，中华肿瘤杂志5168，1983)，也有采用酶或荧光标记雌二醇或标记抗雌二醇抗体法(许良中等，肿瘤418，1984；徐薇苓等，肿瘤8160，1988)、后者属间接反应，且存在荧光淬灭，需荧光显微镜等问题，已趋于淘汰，就DCC而言，存在下述缺陷必须用新鲜标本，检测过程必须保持低温，所需癌块大，需液闪等特殊设备，存在同位素污染，另外，每个检测周期为三天，测定中加入DCC液会破坏激素与受体之间的结合平衡，取材部位不同也影响检测结果。1986年Guylercq等(CancerRes.464233-4236，1986)报道欧洲多中心研究课题组共8个实验室分别对同一批临床乳腺癌病人的组织标本进行了抗ER单克隆抗体的酶免疫试验(ER-EIA)并同时以生化法做为对照。结果显示两种方法在检测结果上无显著性差异。但ER-酶免疫试验的重复性(实验室内变化系数为6％，实验室间为11-19％)在一定程度上较生化法(实验室间变化系数为12-32％)为好。其中六个实验室ER-酶免疫法和生化法相关分析的结果表明，完全可以用抗ER抗体的ER-酶免疫法替代生化法用于临床常规ER的检测。而且ER-酶免疫法能减少DCC法由于基质稀释和取材部位不当所致的误差。当标本组织块对DCC法不适宜或量不够时，此法提供了重现性强的检测手段。1987年Thorpe等(Thorpe SM etal Cancer Res.47<24pt1>6572 1987)对191例乳腺癌活检的新鲜标本也进行了ER-酶免疫法和DCC法比较，两者高度相关(r＝0.97)，获得的数据表明，ER-酶免疫法的结果在生物学上更正确，另外Graig Allred于1993年(Am J.Clin.Pathol.991-3，1993)的报告表明检测ER的免疫组化法(Immunohistochemical method)比DCC法更特异、更敏感。并指出，当标本块小、肿瘤细胞构成少时，DCC法易造成假阴性；当ER阴性的肿瘤含ER阳性的良性细胞时，DCC法又易造成假阳性。又因PR是E2和ER结合诱导的产物，PR的存在反应了ER的结构和功能均正常，不出现受体后缺陷，这说明检测PR的重要意义。无论如何应对ER和PR同时检测雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的检测方法经典常用的是葡聚糖活性炭包裹吸附法(DCC)法，其原理是利用配基配体结合，以配基标记的同位素显示结果。(LippmanME，etal，Cancer Res.391447，1979；中华肿瘤杂志，5168，1983)但DCC法存在许多问题，如需要特殊仪器设备测定结果；使用同位素必须具有防护措施；需要癌组织量大，实际工作中约有20-30％的肿瘤手术标本其体积不能满足DCC法检测的要求，而且由于取材部位不当或由于肿瘤病理类型不同而导致结果偏差，另外DCC法虽能定量但不能定位观察，故可能由于系ER、PR阴性的肿瘤含ER、PR阳性的良性细胞而出现假阳性；或是由于肿瘤的异质性以及基质稀释而致假阴性；该方法费用高又费时；故DCC法不易推广应用。既使酶免疫法因为是用癌细胞溶液检测受体水平也不能定位观察阳性反应成份是癌细胞还是正常(或良性)细胞。而免疫组织化学(IHC)法既克服了上述种种缺点，又廉价快速易于推广，仅需很少的组织甚至针吸活检标本或者普通病理石蜡切片即可，镜下直接观察ER和PR在组织细胞中的定位和表达水平，能够排除肿瘤细胞阴性而正常或良性成分是阳性所致的DCC假阳性，敏感性好特异性强。这主要是由于免疫组化法中抗体与其靶抗原—激素受体特异的免疫结合所决定。近十年来，国外经过大量的研究比较证实了测定ER与PR表达水平免疫组化法与DCC法之间高度符合(85-90％)，可以免疫组化法代替DCC法。(Graig Allred，Am J.Clin.Pathol.991-3，1993)免疫组化法虽是半定量，基本可以满足临床要求。国外多采用免疫组化法(Marvin T et al Am J.Clin.Pathol.998，1993；Heikki J. Helin etal，Cancer631761，1989).应用免疫组化法首先必须提供抗ER单克隆抗体及抗PR单克隆抗体(McAb)。但因为ER、PR抗原尤其是PR更难以获得，所以长期以来国内未见有研制抗ER及抗PR抗体的报告。国内只有抗雌二醇(E2)、抗孕酮的抗体，这只能间接检测ER、PR水平，结果不理想，已趋于淘汰。国外是以合成小肽为抗原制备了抗PR单克隆抗体(DAKO公司172M)以ER的氨基端AB区段为抗原制备抗ER单克隆抗体(ZEMED公司H08-0149B)，用这种抗原制备的抗体检测ER或PR时，切片标本必须经过微波炉抗原修复处理步骤，在以高温抗原修复过程中，即使载玻片经过特殊硅化处理后切片标本也非常容易脱落，致使得不到结果，操作繁杂，温度难以控制；而且，国外制备的抗ER单克隆抗体和PR单克隆抗体售价昂贵。
本发明的目的之一是提供特异敏感、操作简便又廉价的抗人雌激素受体(ER)及抗孕激素受体(PR)的多克隆抗体与单克隆抗体(McAb)。用于检测肿瘤患者及激素依赖性的其它疾病患者的ER、PR表达水平。目的之二是建立简单易行、特异有效的检测ER、PR的方法。
为了达到本发明目的，本发明人认为必须由抗原入手。首先对ER的分子结构进行分析。ER的C、D段为DNA结合区，C区段高度保守，富含半胱氨酸并折叠形成两个重复的“锌指环”结构。其中D段位于ER的配体和DNA结合功能区之间的折叠区段，具有绞链结构，即D段位于ER蛋白的表面，用其作抗原制备的抗体，免疫结合反应可能更敏感(Kumar V etal，Cell 1987，51941；受体学概论P276)。B区与保持ER分子生物活性有关。基于上述原理，本研究以ER-BCD区段的表达蛋白产物为抗原，具有结构明确，特异性强，D区处于ER蛋白表面，可提高抗原抗体结合的敏感性。另又根据文献报道(Glenn S.et al J.Steroid Biochem. Molec.Biol.39(5A)687-692，1991)及从PCGENE微机检索结果选定PR100-1500bP之间构建表达载体，该区段中含有两个外露的抗原决定簇。以此表达蛋白产物为抗原制备的单抗可能特异、敏感。基于上述分析基础，构建PMS-ER，PMS-PR重组质粒，诱导表达的蛋白产物，用此为抗原，制备抗ER、抗PR单抗。
本研究所应用的ER、PR抗原，其制备方法是首先以PCR技术扩增所选定的ER和PR基因片断→分别再与相同酶切位点的PMS-31表达载体定向连接构成PMS-ER和PMS-PR重组质粒(见图1.3)→以重组质粒转化大肠杆菌，使其于25-35℃生长扩增至细菌浊度为0.6-0.8时，再将温度提高到40-45℃继续培养≤8小时→收集菌体沉淀→超声破菌→离心取上清，进行制备性SDS-PAGE电泳，获取足量的ER、PR，-20℃保存备用。ER、PR表达蛋白产物经免疫结合试验证实，我们所制备的抗原具有与天然物相同的免疫原性。
用其制备的抗体包括多抗和单抗。ER和PR的多克隆抗体的获得是用ER、PR表达蛋白产物为抗原加完全和不完全福氏佐剂多次免疫动物，包括兔子、小鼠、大鼠、羊等，获得与天然ER、PR有结合活性的血清。单克隆抗体的制备方法，是采用杂交瘤技术(Kohler G.and Milstein C.Nature 1975，256495)制备小鼠抗ER单抗和小鼠抗PR单抗，但不限于小鼠，也可用大鼠(Rat Hybridoms and Rat MonoclonalAntibodies P75-115，265-270，Bazin H.CRC Press，Inc.Florida 1990).上述所获得的多抗及单抗经过三项标准检测其生物学活性。第一用免疫抗原包板5μg/ml，第二用合成小肽包板，该合成短肽的氨基酸序列取自重组表达蛋白产物(即ER、PR抗原)结构中的一段，包板物浓度5μg/ml，再以常规的ELISA方法检测自制的抗体与二者均有结合反应；第三用经过DCC法检测证实ER或PR阳性的乳癌组织的石蜡切片，以自制抗体进行免疫组化染色，产生抗原抗体特异性结合反应。经实验证实本发明的抗体具有敏感特异，价廉、免疫组化染色时不需要抗原修复处理，操作简便易行，这是优于国外单抗的特点之一。生产本发明单抗的杂交瘤株保藏于武汉大学CCTCC，其保藏号为96005，96006。
在完成研制具有上述特点的抗ER、抗PR单抗的基础上，即可达到建立特异有效，灵敏又简单易行的检测ER、PR的免疫组化方法。目前，利用进口抗ER、抗PR单抗行免疫组化染色时，组织切片均必需要经高温煮抗原修复之步骤，而利用本发明研制的抗ER、抗PR单抗进行ER、PR免疫组化染色时，不需要抗原修复，操作步骤简化，又经实验证实组织切片经微波炉高温煮与不煮无差异，均可获得良好的染色效果。两种单抗的阳性反应物分别定位于ER和PR阳性细胞的胞核，背景清晰。本发明方法的优点在于步骤简化，缩短时间，操作简便易行，重复性好，最大的优点是避免了高温处理时经常脱片之缺点。其操作程序如下石蜡切片常规脱蜡人水→0.3％H2O2甲醇浸泡，破坏内源性过氧化物酶→常规PBS浸洗，封闭→加抗ER(或抗PR)单抗→常规浸洗后加二抗→浸洗后加酶标记链亲和素→浸洗后以DAB-H2O2显色→苏木精复染，封片。本发明的抗ER单抗和抗PR单抗在科研及临床均具有广泛的应用前景及很高的实用价值，不仅能为临床制定治疗方案提供依据，也为进一步研究激素受体与各种疾病的关系提供有效的手段。
图1.ER-BCD片段与表达载体PMS-31b构成重组质粒示意图。图2.重组PMS-ER-BCD表达蛋白电洗脱结果(12.5％SDS-PAGE)1.蛋白分子量标志；2.3.4为重组质粒转化大肠杆菌，诱导表达4-8小时菌体裂解液电泳图形；5.6.7将目的带分别切下，经电洗脱浓缩后电泳图形；8.9为阴性对照。图3.PR片段与表达载体PMS-31b构成重组质粒示意图。图4.融合蛋白PMS-PR在大肠杆菌中的表达1.蛋白分子量标志；2.3为重组质粒PMS-PR转化大肠杆菌，未诱导和诱导表达的电泳图形；4.5.6.7为阴性对照，分别为空载体及大肠杆菌，未诱导和诱导表达的电泳图形。图5.重组PMS-PR融合蛋白电洗脱结果(12.5％SDS-PAGE)1.蛋白分子量标志；2.3分别为重组质粒PMS-PR转染大肠杆菌，未诱导和诱导表达的电泳条带；4.5.6分别加入10μl、5μl、2μl的电洗脱浓缩的表达蛋白量；7.示5μg牛血清白蛋白的电泳条带，为参比蛋白定量。图6.重组PMS-ER表达蛋白Western Blot分析1.蛋白分子量标志；2.3.6.7PMS-ER转化大肠杆菌；2.6诱导表达；3.7未诱导；4.5为空载体转化菌未诱导和诱导；2.3正常鼠血清为一抗，阴性对照未见着色条带。
4.7鼠抗ER-BC血清为一抗，6与4.5.7相比，呈现有明显增强的蛋白带，证实ER-BCD蛋白产物具有免疫原性。图7.免疫亲和层析纯化兔抗ER-D抗体(12.5％SDS-PAGE)M蛋白分子量标志；1.饱和硫酸铵沉淀的抗ER-D抗体；2.经ER-BCD免疫亲和层析柱纯化之ER-D抗体。图8.抗ER-BCD血清Western Blot分析1.经DCC法证实为ER阴性的乳癌组织；
2.3为ER阳性的同一乳癌组织；1.2用抗ER-BCD血清为一抗，3是用ER-BCD表达蛋白产物将抗ER-BCD抗体吸附后作一抗，其它染色步骤与1.2相同；2.在67KD处可见一特异的条带；3.67KD处条带消失。图9.本发明的抗ER单抗免疫组化染色图10.本发明的抗PR单抗免疫组化染色下面结合实施例对本发明进行详细描述，意在便于更好地理解本发明而不是限制本发明的范围。实施例1ER、PR重组蛋白的诱导表达及纯化一、ER-BCD重组蛋白的诱导、表达及纯化1.ER-BCD重组蛋白的诱导、表达根据对人ER基因全序列的分析设计一对引物，上游序列为5′-CGGC GAATTC ATG GGG GGT TTC CCCC-3’，下游序列为5’-CGGC GGATCC TTA GGC AGC TCT CAT GTC TCC-3’。进行PCR，扩增ER-BCD片段，PCR结束后，进行BamH1、EcoR1双酶切，制备ER-BCD，再与相同酶切位点的PMS-31表达载体连接构成PMS-ER-BCD重组质粒(ER-BCD表达载体的构建见图1)。用PMS-ER-BCD重组质粒转化大肠杆菌，使其于25-35℃生长扩增至细菌浊度为0.6-0.8时，将培养温度提高到40-45℃继续培养≤8小时。10000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体，以1ml菌体加0.1ml裂菌液比例，使沉淀复悬。超声处理，以最大功率处理45秒，沸水中放置10分钟，于4℃，10000rpm离心10分钟，取上清20μl+20μlSDS电泳缓冲液，行12.5％的SDS-PAGE电泳，经分析表达蛋白量可达占细菌裂解液中总蛋白量的15％。
2.ER-BCD表达产物的分离及浓缩含重组质粒PMS-ER-BCD的大肠杆菌经25-35℃扩增，40-45℃诱导后，制备超声裂菌液(见上述)，进行制备性SDS-PAGE电泳纯化浓缩PMS-ER蛋白。
(1)制备3mm厚大PAGE胶板，在电泳槽中加入电泳缓冲液。加样，设置恒流电泳，电流为25mA。
(2)电泳结束后取下胶，将胶置于平皿内，加入4℃，0.1M氯化钾染色，切下目的蛋白带并将胶放入透析袋中，在SDS电泳缓冲液中，恒压200V，电泳4-5小时，将透析袋内的胶条取出，余下的液体在蔗糖中浓缩至适当体积时终止，对PBS透析，紫外分光光度计检测定蛋白量。
(3)取样进行SDS-PAGE电泳，分析鉴定。纯度较好，呈单一条带的重组蛋白(见图2)。图2中电泳结果，行1为蛋白分子量标志，2、3、4为重组质粒转化的大肠杆菌40-45℃诱导4-6小时的菌体裂解液的电泳图形。行5、6、7为将目的带分别切下，进行洗脱浓缩后电泳，行8、9为阴性对照，分别为大肠杆菌和用PMS-31空表达载体转化的大肠杆菌，以温度诱导的结果，无特异的蛋白表达带。
二、PR重组蛋白的诱导、表达及纯化1.PR重组蛋白的诱导、表达(1)根据对人PR基因全序列的分析(受体概论)设计一对引物，上游序列为5’-CGGC GAATTC ATG GCT GCG GTGGAG GTT GAG-3’，下游序列为5’-CGGC GGATCC TTA CTCCGC GCC TTC CTC CTC-3’进行PCR。
(2)将PCR产物用内切酶BamH1、Ecor1进行酶切，再与相同酶切位点的PMS-31表达载体连接构成PMS-PR重组质粒(PR表达载体构建见图3)用PMS-PR重组质粒转化大肠杆菌，使其在25-35℃生长扩增至细菌浊度为0.6-0.8时，将培养温度提高到40-45℃继续培养≤8小时，10000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体，以1ml菌体中0.1ml裂菌液比例，使沉淀复悬。超声处理，以最大功率处理45秒，将样品在沸水中放置10分钟，于4℃，10000rpm离心10分钟，取上清10μl+10μlSDS电泳缓冲液，加样行12.5％SDS-PAGE电泳，剩余样品保存于-20℃备用。表达蛋白量，经计算机描扫分析，诱导产生的表达产物占细菌裂解液中蛋白总量的15％。(见图4)图4中电泳结果第1行为蛋白分子量标志，第2、3行为重组质粒PMS-PR转化大肠杆菌未诱导和诱导的结果，第4、5、6、7行为阴性对照，第4、5行为PMS-31载体质粒转化大肠杆菌未诱导和诱导，第6、7行为大肠杆菌未诱导和诱导。
2.PR表达产物的分离及浓缩含重组质粒PMS-PR的大肠杆菌经25-35℃扩增，40-45℃诱导后，以超声破碎制备裂菌液(方法见上述)。
(1)进行制备性SDS-PAGE电泳，纯化、浓缩PMS-PR蛋白(2)电泳结束后取下胶，以0.1M氯化钾染色。切下目的蛋白带并将胶条放入透析袋中，在SDS电泳缓冲液中，电泳3-4小时，将透析袋内的胶条取出，余下液体在蔗糖中浓缩至适当体积时终止，PBS透析，紫外分光光度计检测定蛋白量。
(3)取样进行SDS-PAGE电泳分析鉴定，呈单一条带的重组蛋白如图5，重组质粒表达融合蛋白产物电洗脱结果示意图。第1行为蛋白分子量标志，第2、3行分别为重组质粒PMS-PR转染大肠杆菌未诱导和诱导，第3行显示有明显增强的表达蛋白带；第4、5、6行分别加入10μ1、5μl、2μl的电洗脱浓缩的表达蛋白量，第7行示5μg牛血清白蛋白条带，作为参比蛋白定量。实施例2ER、PR表达蛋白产物性质的鉴定一、ER表达蛋白产物的鉴定主要试剂1.大鼠抗ER-BC血清 (本室自制)2.小鼠抗ER-D血清(本室自制)3.兔抗大鼠IgG血清 (本室自制)4.大鼠单抗PAP (本室自制)5.HRP标记兔抗小鼠IgG(本室自制)6.生物素标记马抗小鼠(Zymde)7.HRP标记的链亲和素 (Zymde)8.CNBr-Sepharose 4B (Phamasia)9.TMB显色底物 (军事医学科学院)方法(一)ELISA法鉴定ER-BCD蛋白产物的免疫原性
1.将ER-BCD蛋白产物以包被缓冲液稀释至5-10μg/ml，包被96孔板，4℃过夜。同样将BSA、HSA以相同浓度包被。
2.用0.1％的明胶封闭，37℃，30分钟。
3.分别以小鼠抗ER-D血清和大鼠抗ER-BC血清为一抗，37℃，1小时。
4.以PBS-0.05％Tween20洗涤，3分钟X3。
5.加入HRP标记的兔抗鼠IgG(1∶100)，37℃，40分钟。
6.洗涤，方法同上。
7.用TMB底物显色分别加入A、B液各1滴，室温显色15分钟。
8.加入12.5％的浓硫酸终止反应。
结果ER-BCD表达产物与小鼠抗ER-D血清及大鼠抗ER-BC段血清均显示特异性结合反应。
(二)Western Blot分析1.将分离纯化的ER-BCD蛋白产物，进行SDS-PAGE电泳后，再行电转移，恒流150mA，2小时，固相支持物为硝酸纤维素膜(NC膜)。
2.封闭，将NC膜置于平皿中，加入3％的BSA-PBS封闭液，4℃，过夜。
3.将NC膜浸于大鼠抗ER-BC血清，阴性对照以正常大鼠血清代替，1∶50-200稀释，室温下，缓摇1小时。
4.弃去一抗反应液，PBS洗涤10分钟/每次X3，缓摇漂洗5.加兔抗大鼠IgG抗血清(1∶100)，室温下，缓摇30分钟6.PBS缓摇漂洗，10分钟/次*37.滴加大鼠PAP(1∶100)，室温缓摇30分钟。
8.显色；NC膜充分漂洗(方法同上)后，侵入新鲜配制的0.5mg/ml DAB，临用前加H2O21μl/ml，室温下，当条带显色达所需深度时(1-3分钟)，立刻用水洗膜，再侵入PBS中。结果见图6重组ER表达蛋白Western Blot分析示意图。第一条为蛋白分子量标志，第2、3、6、7条为PMS-ER转化大肠杆菌，诱导，未诱导，4、5条是PMS-31转化大肠杆菌未诱导和诱导样品电转后，2、3条是正常大鼠血清为一抗染色，未见有着色的蛋白带，4-7是以大鼠抗ER-BC血清为一抗，可见第6与4、5、7相比，呈现有明显增强的蛋白带，证实ER-BCD蛋白产物具有免疫原性。
(三)ER-BCD表达蛋白免疫亲和层析柱纯化抗ER-D血清1.亲和层析柱的制备(赵强等，北京医科大学学报1990，22307)(1)ER-BCD表达蛋白电洗脱纯化浓缩后，与PBS及结合缓冲液透析，换液多次。
(2)按10-30mg ER-BCD/g载体的比例，根据需要交联的量，称取CNBr-sepharose4B.
(3)操作流程CNBr-sepharose4B↓1mmol/L HCl液浸泡，4℃，15分钟↓lmmol/L HCl液抽滤洗涤(除去保护剂)↓0.1mol/L碳酸钠、碳酸氢钠结合缓冲液快速抽洗至pH中性，与重组ER蛋白液20mg立即混合，加适量结合缓冲液。
↓摇床慢速搅拌，室温2小时或4℃过夜↓抽滤，测定抽滤液中蛋白含量↓0.1mol/L碳酸钠、碳酸氢钠结合缓冲液悬浮装柱，洗至无蛋白流出(OD280＜0.01)，测定流下液中蛋白量。
↓1mol/L乙醇胺浸泡柱床，封闭剩余反应基团↓0.1mol/L醋酸缓冲液及结合缓冲液循环洗柱二次↓
0.1mol/L甘氨酸一盐酸缓冲液洗柱↓0.01mol/L PBS洗柱，即为待用状态(4)偶联率的计算偶联率(％)＝(交联总蛋白量一交联后抽滤洗下蛋白量)/交联总蛋白量X100％2.亲和层析纯化抗ER-D血清取抗ER-D血清以45％饱和硫酸铵沉淀二次→10000rpm离心10分钟后PBS透析，换液3-4次，紫外分光光度计测蛋白含量。留1/2作对比实验，另1/2用上述的亲和层析柱纯化。抗ER-D抗体与柱子作用30分钟，以PBS洗至OD280＜0.01→2.5mol/L NaCL液洗至OD280＜0.01→2倍柱床体积0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液洗→收集洗下之蛋白液，随时以1mol/LNaHCO3液中和pH至中性。收集亲和柱洗脱下来的抗体蜂，经计算抗体回收率为20.3％。洗脱下来的抗ER-D抗体进行SDS-PAGE检测，纯度大大提高，结果如图7所示，图7中的M为蛋白分子量标志，1为经45％饱和硫酸铵沉淀的抗ER-D抗体，有多条蛋白带；2是经ER-BCD免疫亲和层析柱纯化后的ER-D抗体，纯度明显提高。酶联免疫吸附试验(ELISA)结果表明，亲和层析纯化的兔抗ER-D血清稀释度较盐析纯提高25倍。免疫组化结果证实，亲和层析纯化的抗体明显比血清及盐析纯抗体背景清晰。
经过上述各项鉴定证实ER-BCD表达蛋白具有与天然ER相同结构，并具有与天然ER相同的抗原性。
二、PR表达蛋白产物的鉴定主要试剂1.小鼠抗PR血清(本室自制)以PR合成肽为抗原制备的小鼠抗PR血清。此合成肽氨基酸序列取自重组表达序列中的一段。具体制备方法如下将PR合成肽与虫戚钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联(分子克隆第二版P856金冬雁等译，科学出版社，北京，1992)，取此KLH-PR偶联物20μg/只小鼠/次加等量完全福氏佐剂，充分乳化，皮下多点足塾免疫，每间隔两周免疫一次，共免疫4次，间歇一个月后，以等量抗原加强，10天后放血取血清，测效价，分装，-20℃保存备用。
2.过氧化物酶(HRP)标记兔抗小鼠IgG(自制)3.TMB显色底物，(购自军事医学科学院)方法酶联免疫吸附试验(ELISA)法鉴定PR蛋白产物的免疫原性1.将PR蛋白产物以包被缓冲液稀释至5μg/ml，包被96孔板，4℃过夜，同时将BSA，HSA及其无关蛋白以同样浓度包被
2.弃掉抗原包被液，以0.1％明胶封闭，37℃，30分钟。
3.加小鼠抗PR抗血清，37℃，1小时。
4.PBS-0.05％Tween20洗涤，5分钟X3。
5.加HRP标兔抗小鼠IgG(1∶100)，37℃，40分钟6.PBS-Tween20洗，同4。
7.TMB底物显色，A、B液各1滴，室温下，15分钟。
8.12.5％硫酸终止反应。
结果，PR表达产物与小鼠抗PR血清显示特异性结合反应，而与对照的无关蛋白不发生反应。
证实PR基因表达产物具有生物活性，可作为抗原制备抗体。实施例3抗ER和抗PR单克隆抗体的制备一、抗ER单克隆抗体的制备1.免疫程序取6-8周龄雌性的BALB/C小鼠5只，取抗原ER-BCD18-60μg/只/次，(制备PR单抗时，以PR表达产物替换ER-BCD)加佐剂(第一次完全，以后用不完全福氏佐剂，并不限于福氏佐剂)皮下多点注射，每间隔7-10日免疫一次，共免疫3-5次，间歇一个月，加强免疫一次，3-5日后取脾融合2.制备免疫小鼠脾细胞悬液。
3.制备普通小鼠饲养层细胞。
4.骨髓瘤细胞的复苏及培养。
融合前7-10日将细胞由液氮中取出，快速投入37℃水中，用无血清培养基洗一次，加入含小牛血清的完全培养液中，定时换液，使骨髓瘤细胞在融合前处于旺盛对数生长状态5.融合。
(1)按常规配制选择培养液HAT、HT及PEG(30％w/v).
(2)将骨髓瘤细胞及免疫脾细胞以1∶5-10比例混合后，将0.5-1ml 30％PEG逐滴加入细胞团中，1分钟内加完，轻微转动或弹动离心管。
(3)在不断转动离心管时，加入无血清培养液1-5ml，1-5分钟内加完。
(4)另外20ml无血清培养液在5分钟内加完。
(5)低速离心500-1000rpm，5-10分钟，弃上清，加入含有HAT的完全培养液50-100ml，轻轻悬浮混匀。
(6)将(5)细胞悬液种置于带饲养层的96孔板中，每孔加100-200ul。
(7)置于5％二氧化碳温箱中培养，2-3周出现杂交瘤细胞集落，要及时检测、筛选、克隆。
6.杂交瘤细胞检测、克隆(1)以ER-D段合成肽(检测PR单抗时PR合成肽包板)包板5μg/ml，50μl/孔，4℃过夜。
(2)PBS洗板，0.1％明胶封闭，室温30-60分钟。
(3)弃去多余的封闭液，按标记次序加入有杂交瘤细胞集落生长孔内的上清，50μl/孔，同时设阴性对照及阳性对照孔。室温反应1小时。
(4)含0.05％Tween-20的PBS洗板3-4次。
(5)加过氧化物酶标记兔抗小鼠IgG，50μl/孔，室温1小时(6)洗板，TMB底物显色15分钟，12.5％硫酸终止反应。
(7)选择阳性反应孔，取杂交瘤细胞，以有限稀释法克隆。
(8)以上述方法反复筛选、克隆，至少连续克隆3次，仍稳定分泌单抗的杂交瘤细胞液氮冻存，取其上清，进一步做免疫组化检测。
(9)免疫组化检测A.取已知ER阳性及ER阴性的(检测PR单抗时取已知PR+及PR-)乳癌组织石蜡切片，常规脱蜡入水，0.3％H2O2-甲醇浸泡30-40分钟，PBS洗。
B. 0.1％明胶封闭，30-60分钟。
C.弃去多余的封闭液，加待检上清，37℃，1小时或4℃过夜。
D. PBS洗5分钟X3。
E.加Bioten标记马抗小鼠IgG，室温30-40分钟。
F. PBS洗5分钟X3，加HRP标链亲和素，室温30-40分钟G. PBS洗5分钟X3，加新鲜配制的DAB(0.5mg/ml)+H2O2(1μl/ml)，3-5分钟。
H.常规脱水、封片、镜检。
结果阳性反应物定位于胞核，呈棕黄色染色。
二、抗PR单克隆抗体的制备抗PR单抗的制备方法同ER单抗的制备方法。免疫用的抗原改为PR表达蛋白产物，检测PR单抗时，用PR合成肽为抗原包板，免疫组化鉴定时取用已知PR阳性及PR阴性的乳腺癌组织石蜡切片，除此外，其它实施步骤同ER。实施例4抗ER单抗、抗PR单抗性能的鉴定一、抗ER单抗性能的鉴定
1.抗ER单抗效价检测以ER-D合成肽为抗原包板，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测抗ER单抗效价为1∶800-1600。并且ER单抗与无关蛋白呈阴性反应。
2. Western Blot分析将经DCC值证实ER阴性及阳性的乳腺癌标本在TED缓冲液中匀浆，再行SDS-PAGE电泳后再转膜，一抗分别用(1)小鼠抗ER-BCD抗体(2)用ER表达蛋白产物预吸附以后的小鼠抗ER-BCD其余操作步骤同前。经抗ER-BCD血清染色结果见图8。图中1是经DCC法证实为ER阴性的乳癌组织，2、3为ER阳性的同一乳癌组织。1、2均用小鼠抗ER-BCD血清作一抗，3是将小鼠抗ER-BCD血清用ER-BCD表达蛋白产物吸附以后作一抗以后的染色步骤与1、2同步进行。最后1无特异带显示出来；2在67KD处可见有一特异的增强带；而一抗血清经ER-BCD预吸附后，该增强带消失，如图中3。
3.免疫组化检测抗体的性能用抗hER单抗为一抗，其它的免疫组化操作步骤同前。
(1).自制抗ER-BCD血清与进口ER抗体免疫组化结果比较。检测了17例乳腺纤维腺瘤、乳腺增生和8例乳腺癌石蜡切片。阴阳性总符合率88％(22/25)。本发明的抗体与进口抗体的免疫组化结果呈正相关。(P＜0.001)(2).自制抗ER-BCD抗体免疫组化结果与DCC值的比较。共检测47例乳腺癌标本。阴阳性符合率为95.5％(43/45)。P＜0.001。阳性反应物定位于ER阳性细胞核，呈棕黄色。(见图9)图中乳癌细胞胞核被染成棕黄色。该图中示为黑色。
二、抗PR单抗性能的鉴定1.抗PR单抗效价检测以PR合成肽为抗原包板，酶联免疫吸附法(同前)检测其效价培养上清效价为1∶100-1000，腹水效价为1∶106-107。与无关蛋白呈阴性反应。
2.免疫组化检测抗体的性能分别以进口PR抗体及本发明的PR抗体为一抗检测30例乳腺癌组织石蜡切片，操作步骤分别如下(1)进口抗PR单抗操作步骤石蜡切片常规脱蜡入水→0.3％H2O2甲醇溶液浸泡30分钟→PBS浸洗5分钟X3→枸橼酸缓冲液中于92℃-98℃，8-10分钟后在室温冷却10分钟→0.1％明胶封闭→PBS洗5分钟X3→加一抗PR抗体，4℃过夜，以后步骤同前。
(2)本发明的抗PR单抗操作步骤平行检测两个标本，一个标本完全按进口抗体的操作程序，将切片予以抗原修复，高温处理(以下简称煮片)，另一标本不进行抗原修复(以下简称不煮片)。其它步骤同上。其结果是自制抗PR单抗对煮与不煮的标本染色效果无差别，而进口抗体要求标本必须煮，使之操作复杂，致使经常脱片。自制抗PR抗体免疫组化染色结果与DCC值与进口抗体结果符合率达90-95％。PR免疫组化阳性反应物定位于PR阳性细胞胞核，呈棕黄色。如图10所示。图中心及右上角处圆形或近圆形的黑色着染的即是乳癌细胞胞核。
经上述各项检测，证实本发明的抗ER单抗及抗PR单抗性能良好，与天然ER、PR具有特异结合能力。用其进行免疫组化染色时操作步骤比进口同类产品简单易行，染色效果好，具有广泛的临床及科研应用前景。
权利要求
1.一类检测激素依赖性肿瘤及其它疾患的雌激素受体(ER)水平之生物试剂，包括由具有96005鉴定特征的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞，它是由用PMS-ER-BCD抗原免疫的小鼠之脾细胞与骨髓瘤细胞融合、筛选、克隆而成。
3.根据权利要求2所述的PMS-ER-BCD抗原，是以ER之BCD段片与表达载体构建PMS-ER-BCD重组质粒，诱导表达的蛋白产物。
4.一类检测激素依赖性肿瘤及其它疾患的孕激素受体(PR)水平之生物试剂。包括由具有96006鉴定特征的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的杂交瘤细胞，它是由用PMS-PR抗原免疫的小鼠之脾细胞与骨髓瘤细胞融合、筛选、克隆而成。
6.根据权利要求5所述的PMS-PR抗原，是以PR之片段与表达载体构建PMS-PR重组质粒，诱导表达的蛋白产物。
7.一种检测ER、PR水平的免疫组化方法，其特征在于用此权利要求1、4所述的ER、PR两种单克隆抗体，进行对ER、PR水平的免疫组化检测。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于对病理组织切片不需要进行高温处理的抗原修复之步骤。
全文摘要
本发明涉及一类用于临床及科研检测雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)的生物试剂,包括有多克隆抗体、单克隆抗体,其意义在于可用于临床检测乳癌及多种激素依赖性疾病患者的ER、PR水平,指导临床实施内分泌治疗及估测预后,亦可用于研究ER、PR与肿瘤及各种疾病的关系。
文档编号G01N33/577GK1183560SQ9612072
公开日1998年6月3日 申请日期1996年11月26日 优先权日1996年11月26日
发明者孙素莲, 张蕾, 何洛文 申请人:北京市肿瘤防治研究所, 北京盛京高科技开发公司