专利名称：：测定各种痕量样品中生物活性物质的荧光定量分析方法表发明涉及用荧光分析测定各种痕量样品中生物活性物质的方法，它包括用镧系螯合物进行标记，形成一种强荧光凝聚微粒并采用时间分辨荧光进行测量。将含有镧系金属离子(Eu3+，Tb3+和Sm3+)的镧系螯合物作为标记物，用荧光特别是时间分辨荧光光谱测定生物活性物质的分析方法已众所周知。美国专利No.4,058,732和No.4,374,120叙述了在以生物亲和反应为基础的分析测试中时间分辨荧光的应用。在时间分辨荧光中，以短的光脉冲激发荧光标记物，待由任何干扰源而来的荧光消逝后再检测荧光。某些镧系螯合物如铕，铽和钐的螯合物具有长寿荧光，所以它们是时间分辨荧光分析的适宜标记物。标记物荧光的测量可以在它们结合于抗原或抗体时进行，也可以将镧系元素从抗原或抗体上分离出后进行，即在测量前加入一种含有β-二酮，协同化合物和表面活性剂的低pH值溶液解离镧系离子并将其转变为新的荧光螯合物(美国专利No.4,565,790)。美国专利No.5,316,909叙述了一种改进方法，即在荧光测量前，将镧系元素螯合物的分子转变成具有很强荧光的凝聚微粒，该微粒既含有镧系螯合物，也含有一种荧光增强离子螯合物。在凝聚微粒中，特异的镧系螯合物的荧光得到了极大增强，这就是所谓的共荧光增强。本发明乃是基于将共荧光增强与控制标记组份含量在低水平相结合，通过生物亲合反应和时间分辨荧光分析定量测定各种痕量样品如耳血或指血或其他体液中生物活性物质，本发明的目的是通过上述结合和采用相应的技术实现在痕量样品中进行生物活性物质的定量测定，其测定灵敏度应满足临床要求。根据本发明所拟定的方法，既可适用于一种痕量样品，也可同时适用于多种痕量样品。这将促进临床检测生物活性物质向微量，灵敏，方便和安全的方向发展。利用亲合反应来测定生物活性物质时，测定灵敏度可用下式表示影响剂量响应曲线的斜率的因素有1.亲合反应中，反应物对的亲合常数Ka；2.标记物及其标记比活性；3.亲合反应后，检测标记物的方法，包括测量仪器和测量前对标记物的化学处理；4.用于测定的样品量。影响零剂量时信号测量误差的因素有1.零剂量时的信号水平(对非竞争法而言)；2.测量仪器的稳定性；3.分析人员的实验误差。任何以同样倍数放大或缩小S和ΔR的方法和手段均不能改变灵敏度的大小。已提出的共荧光增强法(美国专利No5,316,909)，就是在测量前对标记物作了某种特殊的化学处理，使得标记物的荧光得到了很大增强，从而提高了S值。表1列出了用一种共荧光增强法和DELFIA直接荧光增强法测定纯Eu3+离子得到的荧光水平，背景荧光，检测限及两者的比较。表1</tables>与直接荧光增强法相比，共荧光增强法虽然可以提高荧光强度71倍(也提高s值71倍)，但是检测限(灵敏度常以检测限表示)却只改进了15.6倍，这是因为背景荧光也提高了4.6倍，使ΔR也提高了大约相同倍数。当将共荧克增强法用于以Eu3+标记和双抗体夹心法为基础的时间分辨免疫荧光分析时，并不是总可以明显地提高灵敏度，这种情况往往出现在非特异结合较高的测定中。这时，虽然特异的标记物的荧光得到了很大增强，由非特异结合而来的荧光也得到了很大增强，使零剂量时信号水平上升很多。在试剂仪器条件和测定方法均已固定的情况下,提高灵敏度的一个最简单有效的方法是增加取样量，例如将取样量从25μl增加到100μl甚至200μl。但这种做法受到进行亲合反应的总体积和样品来源的限制。就DELFIA系统而言，总反应体积一般为200～250μl，最大不能超过300μl。本发明的目的就是开发出一种痕量(1～5μl)样品的荧光定量分析方法，其灵敏度可以与常规时间分辨荧光法(如DELFIA法)相比较。DELFIA法的一般取样量为25μl或50μl血清，当将取样量下降到1～5μl全血(约0.5～2.5μl血清)时，若要仍维持其原有的测定灵敏度，不采取某些特殊而有效的手段是不行的。对非竞争法而言，在荧光测量前采用共荧光增强法，固然可以将标记物的荧光水平提高几十倍之多，而零剂量时的信号水平也大大提高了，从而使ΔR明显上升，这严重影响灵敏度的提高。零剂量时的信号主要有两个来源1.所使用的共荧光增强液的背景荧光。2.亲合反应进行过程中产生的非特异结合。前者可以通过选择合适的试剂和合适的配制方法控制在合理的水平，如表1所示的1,450cps。但是要将非特异结合控制在较低水平却往往不易做到。我在一个采用了共荧光增强法的测定LH的时间分辨免疫荧光分析中考察了标记抗体用量对非特异结合和LH信号水平的影响，结果见表2和图1.当标记抗体用量下降时，一定量LH的特异信号和非特异结合均呈下降趋势，但非特异结合的下降速度却比LH信号快得多。这就提示，控制标记抗体用量在低水平，例如1～20ng，最好为2～10ng，可以提高灵敏度。我发现，将共荧光增强法与控制标记组份含量在低水平相结合是使灵敏度不致下降而又能定量测定痕量(0.5～10μl，最好为1～5μl)样品中生物活性物质的一个巧妙选择，这一做法的成功也意味着通过上述结合，提高了测定的绝对灵敏度。表2对竞争法而言，上述结合对提高灵敏度同样可以起到很好的作用。在竞争法中，影响灵敏度的最重要因素是亲合常数Ka值的大小。在Ka值足够大的情况下，可以通过控制标记抗原的量在低水平，以提高灵敏度，但这要受到下述因素的限制，即反应体系的总的信号水平不可太低，否则测量误差太大。在控制标记抗原量在低水平的同时，又采用共荧光增强法，就大大减轻了这一限制因素的作用，使得能够以合适的灵敏度测定极少量样品中生物活性物质。本发明的重要意义是显而易见的。目前尚没有一个常规临床分析方法能够应用生物亲合反应在1～5μl全血等各种痕量样品中定量测定多种生物活性物质。一般常规的方法如放射免疫分析(RIA)，酶免疫分析(EIA)和荧光免疫分析(FIA)等，其做法一般是由静脉穿刺取血数毫升。分离出血清后用于各种化验。在某些新生儿筛查的特殊测定中，可采用少量干血作为样品，但由于灵敏度的限制，这种类型的测定尚不能用于测定许多其他生物活性物质。当采用耳血或指血作为样品时，则可以避免穿刺静脉即可进行常规定量测定许多生物活性物质，这无疑将会受到广大患者的欢迎。而且，用于测定的样品不限于液态，可以将样品采于滤纸上，干燥后，用穿孔器取下一个3～5mm直径的纸片干样用于分析，采用纸片干样作为样品的好处是样品便于保存和运输，甚至可放在信封中邮寄。这种做法给某些疾病(例如癌症)的普查和早期诊断提供了一个切实可行的方法，而且特别适用于边远山区的人群，只要是邮政能达到的地方，即可进行本发明所提供的常规定量化验检查，其化验检查的项目数量并不会亚于RIA，EIA和FIA等。另外，本方法还可以设计成同一个方法同时适用于多种痕量样品(血清，血浆，全血，尿和其他体液的液态样品或纸片干燥样品，这给临床应用进一步带来方便。以下实施例对本发明作进一步说明例1用时间分辨免疫荧光分析测定耳血中hAFP单克隆抗-hAFP抗体的标记在pH9.5的碳酸盐缓冲液中以50倍克分子过量的N1-(对-异硫氰基苄基)-二乙三胺四乙酸的铕螯合物进行标记。用凝胶过滤将标记抗体从游离标记试剂中分离出来。用单克隆抗-hAFP抗体包被样品板用于包被的单克隆抗-hAFP抗体与标记用抗体不同，它是直接针对hAFP分子上不同的特异抗原结合位点的。包被在pH9.5的碳酸盐缓冲液中进行，每孔加1μg抗体，在室温下温育过夜，洗涤后用0.1％BSA饱和封闭。样品收集血斑样品的获取是通过穿刺耳垂将耳血滴到滤纸上，使血全部覆盖和浸透滤纸上的取样圆圈，平放滤纸至少2小时以使血斑干燥。采用液态耳血作为样品，可取耳血68μl加入到500μl试验缓冲液(见下)中，混匀后取25μl作为样品进行测定。免疫分析在pH7.7的0.05MTris-HCl试验缓冲液中进行免疫反应，缓冲液还含有9g/lNaCl，0.05％NaN3，0.5％BSA，0.05％牛球蛋白和0.01％吐温40.在包被孔中加入不同量的标准hAFP或直径为3mm的干血纸片样品(含全血3.0μl)或上述稀释后的25μl液态耳血，在上述介质中作第一次温育(室温下1小时)，洗涤后每孔加入5ngEu标抗体作第二次温育(室温下1小时)，洗涤6次后每孔加入200μlEa溶液(Ea溶液组成30μMTTA，1.5μMY3+，0.06％(W/V)曲拉通X-100，20％乙醇，溶液用乙酸调节pH至3.2)，振荡3分钟以解离Eu3+离子，然后每孔加入20μlEb溶液(Eb是含有0.4mM邻菲罗啉的0.2MTris溶液)，振荡7分种以提高荧光强度，用时间分辨荧光仪测定每孔荧光强度，荧光仪测量参数激发光脉冲固期1ms，延迟时间400μs，计数时间400μs。图2是本测定的标准曲线。从同一个人静脉取血分出血清，并取耳血制干血纸片样品和稀释的液态样品(见上)，用DELFIAhAFP商品试剂盒测定血清样，用本法(CFES)测定纸片干血样品和液态样品，分析63人样品所得到的结果的比较如图3，图4和图5所示。这三个图表示了DELFIA血清法(DELFIA.CFES干血法(CFES(干))和CFES液态样品法(CFES(液))两两之间的相关性。相关方程分别为DELFIA＝0.165+1.933CFES(液)，r＝0.98；DELFIA＝0.139+2.101CFES(干)，r＝0.94；CFES(干)＝0.151+0.863CFES(液)，r＝0.97。例2用时间分辨免疫荧光分析测定耳血纸片样品中CEA标记和包被方法，样品收集和免疫分析过程均与例1类似，只是标记和包被抗体均为单克隆抗-CES抗体，它们分别针对CEA分子上不同的结合位点。测定CEA的标准曲线如图6所示。图1标记抗体用量对非特异结合和LH信号水平的影响非特异结合LH信号水平图2用时间分辨免疫荧光分析测定耳血中hAFP的标准曲线图3测定hAFP的液态全血CFES法与DFLFIA血清法的相关性图4测定hAFP的干血CFES法与DELFIA血清法的相关性图5测定hAFP的液态全血CFES与干血CFES法的相关性图6用时间分辨免疫荧光分析测定耳血纸片中CEA的标准曲线权利要求1.一种用于测定各种痕量样品中生物活性物质的荧光定量分析方法，其特征在于它包括下列步骤(1)用镧系螯合物标记一个或几个生物亲合性组份；(2)标记组份参加生物亲合反应，反应中控制标记组份的含量在低水平，以下降非特异结合；(3)解离镧系螯合物，并形成具有强荧光的凝聚微粒；(4)用荧光特别是时间分辨荧光测定镧系离子的含量。2.按照权利要求1，标记组份的低水平为1～20ng，最好为2～10ng。3.按照权利要求1，生物活性物质是抗原，抗体和体液中其他生物活性物质。4.按照权利要求1，样品的痕量是指0.5～10μl，最好是1～10μl。5.按照权利要求4，样品是包括干血在内的全血，血清，血浆，尿和其他体液。6.按照权利要求1，镧系离子是Eu3+，Tb3+，Sm3+和Dy3+。7.按照权利要求1，凝聚微粒是将Eb加入到Ea中形成，Eb是含有1，10-菲罗啉和缓冲剂的水溶液，Ea是含有一种β-二酮，一种荧光增强离子和一种表面活性剂的水溶液或水-乙醇溶液。8.按照权利要求7，β-二酮是噻吩甲酰三氟丙酮或三甲基乙酰基三氟丙酮。9.按照权利要求7，荧光增强离子是Y3+，Gd3+或Tb3+。10.按照权利要求7，表面活性剂是曲拉通类型的表面活性剂。11.按照权利要求1，荧光定量分析方法可设计成只适用于一种痕量样品测定，也可以设立成同时适用于两种或更多种痕量样品的测定。全文摘要本发明涉及测定各种痕量样品中生物活性物质的定量分析方法。它基于使用荧光,特别是时间分辨荧光来定量测定生物活性物质,例如抗原,抗体等。本分析法包括用镧系螯合物标记一个或几个参与生物亲合反应的生物亲合性组分,反应中控制标记组分的含量在低水平以下降非特异结合,反应后形成可用于荧光测量的镧系螯合物,然后测定该螯合物的荧光,在荧光测量前,形成一种由镧系元素参与的镧系螯合物和荧光增强离子螯合物所组成的具有强荧光的凝聚微粒。文档编号G01N33/53GK1181501SQ96120258公开日1998年5月13日申请日期1996年10月30日优先权日1996年10月30日发明者杨祺,徐照红申请人:杨祺,徐照红