检测外周血CAR‑T细胞的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒的制作方法

本发明涉及生物医学领域，尤其是关于一种针对外周血CAR-T细胞的检测技术。

背景技术：

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T－Cell Immunotherapy，CAR－T)是近年来迅速发展的肿瘤过继免疫治疗方法。CAR-T治疗已成为治疗恶性肿瘤的一种新策略，特别是在血液肿瘤方面的贡献，主要涉及急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤/白血病、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。CAR-T疗法主要分4步：一是从肿瘤患者上分离免疫系统的T细胞；二是利用基因工程技术给T细胞加入一个能识别肿瘤细胞、同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合体，成为CAR-T细胞；三是在体外选择、激活和大量扩增CAR-T细胞(一般一个病人需要几十亿乃至上百亿个CAR-T细胞)；四是给肿瘤患者输注CAR-T细胞，发挥对肿瘤细胞的杀伤效应。

CAR-T细胞发挥杀伤肿瘤效应取决于患者体内的CAR-T细胞的数量和存活时间。而CAR-T细胞的扩增和存活受到诸多因素的影响，如最初输注的CAR-T细胞数量、输注前是否进行“淋巴细胞清除”以及病人的输注后的个体治疗等。相关研究报道新一代的CAR-T细胞能够在患者体内扩增超过1000倍，并能够到达骨髓，在体内保持较高的CAR功能达6个月。但外周血中CAR-T细胞数，在患者个体间的差异大，CAR-T细胞数量成为临床预后预测，疗效评价的一项重要的参数。

技术实现要素：

本发明提供一种新的外周血CAR-T细胞检测方法。

本发明提供一种检测外周血CAR-T细胞的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，包括序列分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的上游引物、下游引物及探针。

一种TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒在外周血CAR-T细胞检测上的应用，所述试剂盒包括序列分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的上游引物、下游引物及探针。最低的有效检测浓度为1.2×10¹copies/μL。

本发明的有益效果是：该TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒具有取材量小、操作简便且检测周期短的优点，能够用于外周血CAR-T细胞的检测。

附图说明

图1是GAPDH标准曲线图；

图2是CAR标准曲线图；

图3是不同样本的扩增曲线图，其中，A-G分别为浓度1.2×10⁷-1.2×10¹copies/μL样本，即浓度分别为1.2×10⁷copies/μL、1.2×10⁶copies/μL、1.2×10⁵copies/μL、1.2×10⁴copies/μL、1.2×10³copies/μL、1.2×10²copies/μL和1.2×10¹copies/μL；H：1.2copies/μL样本；I：ddH2O样本；

图4是反映两例患者体内CAR-T细胞数随时间的变化情况图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

1材料和方法

1.1样本、试剂及仪器

样本：选取2015年1月至2016年6月深圳市第二人民医院血液内科收治的进行CAR-T治疗的淋巴系统肿瘤患者，另随机选择来深圳市第二人民医院健康体检者的血液样本为对照组。

试剂：血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，DNA纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司)，PCR Master试剂(TaKaRa公司)，TaqMan Gene Expression Master Mix试剂(ABI公司)，TaqMan Gene Expression Assay(Hs02758991_g1)试剂(ABI公司)。

仪器：ABI7500荧光定量PCR检测仪(ABI公司)，Proflex PCR仪(ABI公司)，NanoDrop2000c微量核酸蛋白分析仪(THERMO公司)。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成

根据引物设计原则，采用Primer5软件完成引物设计，引物委托华大基因生物公司合成。采用Oligo7软件完成CAR基因探针设计，委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。其中GAPDH基因探针及引物直接购于美国应用生物系统公司。

表1 PCR引物序列

1.2.2常规PCR产物回收及鉴定

参照试剂盒说明书进行操作用血液基因组DNA提取试剂盒提取CAR-T细胞的基因组DNA。

普通PCR方法扩增CAR基因(上下游引物序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:2所示)和内参GAPDH基因(上下游引物序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO:4所示)，分别制备标准品。引物序列如表1所示。反应体系：EmeraLdAmp pcr Master Mix(2×Premix)25μL，模板DNA 5μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，加入ddH₂O至总反应体积50μL。进行以下扩增：95℃预变性10min，95℃变性30S，52℃退火60S(GAPDH基因为56℃退火60S)，72℃延伸1min，扩增35个循环，72℃反应5min，4℃保存。

所获得扩增产物1.5％琼脂糖凝胶电泳，DNA纯化回收试剂盒回收，送英潍捷基公司测序验证，得到CAR基因和GAPDH基因标准品。

1.2.3TaqMan实时荧光定量PCR反应条件优化

标准品用ddH₂O以10倍浓度梯度稀释作为实时荧光定量PCR模板，每个浓度3个复孔，以ddH₂O作为阴性对照，进行TaqMan实时荧光定量PCR。

CAR基因检测：引物和探针序列如表1(序列如SEQ ID NO：5～7所示)，总反应体系20μL：TaqMan Gene Expression Master Mix(2×)10μL、探针(10μmol/L)2μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、模板DNA 4μL，ddH₂O 2μL。反应程序为：第一步，50℃2min；第二步，95℃10min；第三步，变性95℃15s，退火59℃30s，共进行40个循环。

GAPDH基因检测：引物和探针混于TaqMan Gene Expression Assay中。总反应体系20μL：TaqMan Gene Expression Master Mix(2×)10μl、TaqMan Gene Expression Assay(20×)2μL，DNA模板4μL，ddH₂O 4μL。反应程序为:第一步，50℃2min；第二步，95℃10min；第三步，变性95℃15s，退火60℃60s，共进行40个循环。

1.2.4制作标准曲线

根据公式DNA拷贝数Y molecules/μL＝[(DNA ng/μL)×10^-9/基因碱基长度bp×660]×6.022×10²³，算出两基因拷贝数为1.2×10¹⁰copies/μL(CAR基因)和1.5×10¹⁰copies/μL(GAPDH基因)。以DNA拷贝数为横坐标，CT值为纵坐标，制作标准曲线。为提高扩增效率与灵敏度，CAR基因产物选择稀释倍数10⁵～10⁹；GAPDH基因产物则取10²～10⁶浓度的产物(如表2所示)。

表2 两基因浓度表

1.2.5重复性实验

采用最优体系，以DNA浓度稀释10⁵、10⁷、10⁹倍的样本进行重复性实验，每个浓度重复5次。测得的CT值进行统计学分析，以变异系数情况确定该反应的重复性。

1.2.6灵敏度实验

选择各个梯度的标准品和ddH₂O作为模板进行实时荧光定量PCR，以CT值与水为模板有显著差别且出现较好S型增长曲线的最低浓度，为最低检测灵敏度。

1.2.7临床样本检测

用真空管(含EDTA抗凝剂)采集4名健康人以及2名CAR-T治疗的肿瘤患者各个时间点的外周血2mL。血液样本均由专业人员采集，低温运送至实验室，-80℃保存。每次200μL外周血提取基因组DNA，操作按血液基因组DNA提取试剂盒的步骤。利用已优化的TaqMan实时荧光定量PCR体系分别检测样本中的CAR基因和GAPDH基因。

2结果

2.1标准曲线

荧光定量PCR结果显示随着标准品DNA浓度被连续稀释而等比下降，所获取的荧光信号也近乎成比例地降低。GAPDH基因的回归方程y＝-3.4349x+44.439，R²＝0.999，扩增效率为95％(如图1所示)。CAR基因的回归方程分别为：y＝-3.3682x+38.594，R²＝0.999，扩增效率为98％(如图2所示)。

2.2重复性

重复性结果采用变异系数CV(％)评价，3个浓度的样本的5次CT结果都较为接近，变异系数CV均小于4％，说明本方法结果稳定，有良好的重复性(表3)。

表3 重复性实验结果表

2.3灵敏度

结果显示浓度为1.2copies/μL样本和水对应的曲线没有显著差别，两者CT值之差小于1。而1.2×10⁷-1.2×10¹copies/μL的样本扩增曲线的CT值在36以内，且具有良好的线性关系(如图3所示)。据此，本实验最低有效检测浓度为1.2×10¹copies/μL，设定检测结果CT值大于36的样本为阴性样本。

2.4样本检测结果及拷贝数分析

2名患者共13例样本，其中12例样本都检测到CAR基因，只有一例没有检测到，怀疑跟输注时间相隔6个多月体内CAR-T细胞已衰耗有关；而4名健康人都未检测到CAR(如表4所示)。GAPDH基因是表达甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的管家基因，几乎在所有组织中都高水平表达，且一般保持恒定。理论上CAR基因和GAPDH基因一样在细胞内都以单拷贝形式存在，1个拷贝数代表1个细胞。CAR拷贝数代表CAR-T细胞数，GAPDH拷贝数代表外周血中的有核细胞总数。则CAR拷贝数与GAPDH拷贝数的比值，代表外周血中CAR-T细胞占有核细胞的比例。

表4 样本检测结果表

此外，以输注时间与标本时间的相隔天数为横坐标，以CAR-T细胞占外周血有核细胞比例(1/10⁸)为纵坐标，作趋势图(如图4所示)。反映两例患者体内CAR-T细胞数随时间的变化情况。

3结论

目前常用的检测CAR-T细胞的方法包括免疫印迹法(Western blot)、流式细胞仪检测法、聚合酶链式反应(PCR)检测法等，但都存在不同程度的不足。比如Western blot无法测定具体的细胞量；流式细胞仪检测法是一种相对定量的方法，得到的结果是相对于总细胞的相对比例；而PCR检测法则相对敏感度低且难以定量。TaqMan实时荧光定量PCR技术，是在普通PCR的基础上另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间，具有高度的特异性。

本实验方法血液样本的检测灵敏度为每4μLDNA溶液12个基因组拷贝，敏感度比其它方法高10-1000倍，检测样本用量少，能在尽量减少对患者伤害的情况下，实现准确定量。可望应用于临床上CAR-T治疗患者的治疗指导、疗效评估、病情预测等方面。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市第二人民医院

<120> 检测外周血CAR-T细胞的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒

<130> 16I23205

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> CAR上游引物

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catcctccct gtctgcctct 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> CAR下游引物

<400> 2

gcctccgcca tcttatcttt 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> GAPDH上游引物

<400> 3

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<212> DNA

<213> GAPDH下游引物

<400> 4

catcacgcca cagtttcc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> CAR荧光定量上游引物

<400> 5

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<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> CAR荧光定量下游引物

<400> 6

aaacttggct cttggagttg t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> CAR荧光定量探针

<400> 7

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