利用微滴式数字化pcr检测外周血游离线粒体dna含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用微滴式数字化PCR技术建立检测外周血游离线粒体DNA含量 的方法及其试剂盒，以及上述方法或上述的试剂盒在检测外周血游离线粒体DNA含量中的 应用。
【背景技术】
[0002] 在对外周血的分子诊断研究中，认为外周血循环的核酸成分可成为反映疾 病状态较好的指标。外周血循环DNA主要包含核DNA和线粒体DNA(mtDNA)。不同于 核DNA，mtDNA来自于细胞线粒体，为环状双链、多拷贝的DNA，且具有致炎作用。因此， 检测外周血游离mtDNA含量可能有助于监测疾病，如肿瘤、创伤、慢性炎症等。目前用 于检测外周血游离线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)含量的方法主要是利用实 时焚光定量 PCR(quantitativereal_time PCR，qPCR)的绝对定量法（Ajaz S, Czajka A,Malik A:Accurate measurement of circulating mitochondrial DNA content from human blood samples using real-time quantitative PCR. Methods in molecular biology (Clifton, NJ 2015, 1264:117-131. h该法首先通过普通PCR扩增线粒体基因组相 关基因，如ND1，C0X2基因等，将其克隆至质粒载体，构建含有线粒体基因的重组质粒。经过 浓度测定和计算后获得质粒的拷贝数，建立标准曲线，常用的浓度为10~10 sc〇pieS/iil。 在含量检测中，DNA样本与标准质粒同时进行qPCR反应，利用标准曲线计算样本mtDNA拷贝 数。然而，该方法在实验中发现在低拷贝数时准确度下降，并且可能会出现非特异性扩增， 从而影响实验的准确性。此外，目前的检测方法在对样本进行分析前均需提取DNA，然而目 前商品化的DNA提取试剂盒均存在提取过程DNA的丢失情况，且得率不一，可能造成结果评 判上的差异。因此，迫切需要一种准确性更高的检测方法用于外周血DNA分子的诊断研究。
[0003] 微滴式数字化PCR (droplet digital PCR，ddPCR)是新一代的PCR技术，不同于传 统的qPCR技术，其原理是通过形成油包水微滴，将PCR反应分配至20000个微滴内（nl/微 滴），进行PCR反应后，逐一对每个微滴进行荧光信号的检测，含有荧光信号的微滴判读为 1，没有荧光信号的微滴判读为〇,根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例，计算得出靶 分子的起始拷贝数。因此，ddPCR无需建立标准曲线，可直接确定低至单拷贝待检靶分子的 绝对数目。
[0004] 因此，ddPCR在稀有突变的检测、基因拷贝数变异分析，以及基因表达分析等方面 的应用中已显示其优势。目前尚无关于利用ddPCR检测mtDNA拷贝数方法的研究报道。
【发明内容】
[0005] 本发明涉及一种利用微滴式数字化PCR检测外周血游离线粒体DNA含量的方法， 主要包括以下步骤：
[0006] 1)重组质粒的构建：通过PCR扩增MT-ND1基因，将MT-ND1PCR产物通过T-A克隆 至pMD?18-T载体，并转化大肠杆菌E. coli DH5 a .
[0007] 2)样本制备：利用质粒小提试剂盒提取E. coli DH5 a的重组质粒，调整质粒拷贝 数，并稀释成1~l〇6copies/ y 1。
[0008] 3)提取血浆DNA和Exosome DNA :采集外周血至EDTA-NaJjt凝管，分离血浆。 将500 y 1血浆分为两等分，其中250 y 1血浆采用磁珠法直接提取DNA，250 y 1首先分离 exosome，在exosome沉淀中加含有1U DNasel溶液中重悬并在37°C孵育lh以去除exosome 外的DNA。
[0009] 4)对血衆进行预处理：取500 y 1血衆，1600g离心5min，上清转至新1. 5ml EP管； 16000g离心5min，取上清过0. 22 y m -次性过滤器；取预处理的血浆按1:1比例依次加入 1~104copies/ y 1 MT-NDl-pMD18-T标准质粒，混匀，混合样本直接作为模板进行DD-PCR 分析。
[0010] 5)利用ddPCR分析重组质粒mtDNA拷贝数，包括设计引物和探针，利用重组质粒、 血浆DNA、血浆exosome DNA以及经处理或未处理的血浆作为模板，扩增体系形成微滴后在 PCR仪上进行扩增，扩增完毕后，将已完成PCR反应的96孔板置于BIO-RAD DX200Droplet Reader进行微滴读取，利用QuanatSoft 1. 6软件进行分析。
[0011] 在一个实施方案中，所述方法步骤1中PCR扩增MT-ND1基因的引物序列如下：前 向引物为 5' CAGCCGCTATTAAAGGITCG3'，反向引物为 5' AGAGTGCGTCATATGITGTTC 3'，扩增片 段长度 1041bp[Homo sapiens mtDNA(GeneBank No. NC_012920)np3017-4057]〇
[0012] 在一个实施方案中，所述方法步骤2中质粒拷贝数使用以下公式调整：
[0013] MffDNA (dal tons) = (pMD18-T vector + Insert) X 660 (dal tons/bp)= (2692bp+1041bp) X 660 (daltons/bp) = 2. 46 X 106 (daltons)；
[0014] CNDNA(copies / y 1) = CDNA (ng/ y 1) X 6. 02 X 1 014/MffDNA = C DNA(ng/ y 1) X 6. 02 X 1014/2. 46 X 106= C DNA(ng/ y 1) X 2. 45 X 108.
[0015] (CNdna:质粒拷贝数；CDNA :质粒DNA浓度；MffDNA:质粒分子量）
[0016] 在一个实施方案中，所述方法步骤5中所用引物和探针如 下：F : CCCTAAAACCCGCCACATCT ;R:GAGCGATGGTGAGAGCTAAGGT ;探针： CCATCACCCTCTACATCACCGCCC，使用 BHQ1 作为淬灭基团。
[0017] 在一个实施方案中，所述方法步骤5的扩增体系中还包含空白对照和阴性对照， 其中空白对照为不含DNA模板的PCR体系，阴性对照为使用pMD-18-T质粒作为模板。
[0018] 在一个实施方案中，所述方法步骤5生成微滴的步骤如下：
[0019] 1)将20 y 1体系加入微滴生成卡上Sample孔中，70 y 1的微滴生成油加入Oil孔 中，该过程避免气泡产生和交叉污染，套上干净的专用胶条；
[0020] 2)将微滴生成卡置于微滴生成器上，进行微滴生成过程，在该过程中，Sample孔 中体系与微滴生成油在负压的作用下，一并被混合至Droplet孔（微滴孔）以形成微滴；
[0021] 3)取出微滴生成卡，吸取40 iil微滴至干净96孔板相应的孔内，盖上专用铝箱纸， 在180 °C按压封口后，普通PCR仪上进行扩增。
[0022] 本发明利用ddPCR技术的检测原理，建立检测mtDNA拷贝数的方法并应用于外周 血游离mtDNA的分析。所述方法不仅具备优于qPCR的高灵敏度、特异性和重复性的特点， 且其对干扰物（如抗凝剂等）耐受能力高于qPCR。此外，本发明在建立检测方法的基础上， 进一步利用血浆样本直接作为ddPCR的模板，进行血浆mtDNA的分析，不仅消除由于提取所 带来检测不确定性，更加便于临床检验。
[0023] 附图简述
[0024] 图1显示了重组质粒的qPCR实验结果，其中图la为10~106copies/ y 1重组质 粒的扩增曲线，图lb为标准曲线。
[0025] 图2显示了重组质粒的ddPCR结果，其中图2a为1~104copies/y 1重组质粒 的ddPCR -维微滴图，图2b为血浆DNA、重组质粒（102copies/ y 1)、空白对照、阴性对照的 ddPCR -维微滴图；图2c为qPCR和ddPCR的相关性分析结果。图3显示了 ddPCR检测血 衆 mtDNA 和 exosome mtDNA 的结果，其中图 3a 为血衆 mtDNA 和 exosome mtDNA 的 ddPCR - 维微滴图；图3b和图3c为18例血浆mtDNA和exosome mtDNA拷贝数结果。
[0026] 图4为血浆样本ddPCR检测结果，其中图4a是血浆样本的ddPCR -维微滴图；图 4b是血浆样本阳性微滴数和总微滴数分布图，P1~P6为样本编号；图4c是两种血浆前处 理方法的结果比较
[0027] 图5为各血浆样本mtDNA拷贝数分析结果，灰色部分代表原血浆样本的mtDNA拷 贝数，黑色部分代表加入的质粒拷贝数。
[0028] 图6为抗凝剂EDTA-NaJ# ddPCR的影响，其中图6a为模板含量低的结果，图6b为 模板含量高微滴饱和的情况。 具体实施方案
[0029] 实施例1重组质粒的构建和样品制备
[0030] 1、重组质粒的构建
[0031] 首先，通过 PCR 扩增 MT-ND1 基因，前向引物为 5' CAGCCGCTATTAAAGGITCG3'， 反向引物为 5'AGAGTGCGTCATATGITGTTC 3'。扩增片段长度 1041bp[Homo sapiens mtDNA(GeneBank No. NC_012920)np3017-4057]〇
[0032] 1)配制PCR反应体系
[0033]
[0034] 2) PCR反应条件：
[0035]
[0036] 3)PCR产物电泳：配制1%琼脂糖凝胶，于120V电压下电泳20min
[0037] 将MT-ND1PCR产物通过T-A克隆至pMD?18-T载体，并转化大肠杆菌E. coli DH5a .
[0038] 2?样本制备
[0039] 2. 1重组质粒
[0040] 利用质粒小提试剂盒提取E. coli DH5 a的重组质粒，根据以下公式调整质粒拷贝 数，并稀释成1~l〇6copies/ y 1。
[0041 ] MffDNA (dal tons) = (pMD18-T vector + Insert) X 660 (dal tons/bp)= (2692bp+1041bp) X 660 (daltons/bp) = 2. 46 X 106 (daltons)；
[0042] CNDNA(copies / y 1) = CDNA (ng/ y 1) X 6. 02 X 1 014/MffDNA = C DNA(ng/ y 1) X 6. 02 X 1014/2. 46 X 106= C DNA(ng/ y 1) X 2. 45 X 108.
[0043] (CNdna :质粒拷贝数；CDNA :质粒DNA浓度；MffDNA:质粒分子量）
[0044] 2. 2 血衆 DNA 和 Exosome DNA
[0045] 采集外周血至EDTA-Na2抗凝管，分离血浆。将500 yl血浆分为两等分，其中 250 y 1血衆采用磁珠法直接提取DNA，250 y 1首先分离exosome，在exosome沉淀中加含有 1U DNasel溶液中重悬并在37°C孵育lh以去除exosome外的DNA。
[0046] 2. 3血浆预处理
[0047] 1)取500 y 1血衆，1600g离心5min，上清转至新1. 5ml EP管；
[0048] 2) 16000g离心5min，取上清过0? 2