2 y m -次性过滤器；
[0049] 3)取预处理的血浆按1:1比例依次加入1~104copies/ y 1 MT-NDl-pMD18-T标 准质粒，混匀，混合样本直接作为模板进行DD-PCR分析。
[0050] 实施例2利用qPCR和ddPCR分析重组质粒mtDNA拷贝数比较
[0051] 3.1引物与探针
[0052] 表1用于mtDNA拷贝数检测的引物和探针
[0053]
[0054] * :qPCR 3' 淬灭基团为 TAMRA，ddPCR 为 BHQ1
[0055] 3. 2 qPCR
[0056] 1)配制PCR反应体系
[0057]
[0058]
[0059] * :DNA模板为1~106copies/ y 1的重组质粒
[0060] 2) PCR反应条件：
[0061]
[0062] 3. 3 ddPCR
[0063] 1) PCR体系配制
[0064]
[0065] * :DNA模板分别为：
[0066] a) 1 ~104copies/ y 1 的重组质粒；
[0067] b)重组质粒 +EDTA-Na2 (5, 10, 15, 20, 25, 30mM);
[0068] c)血衆 DNA ;
[0069] d)血衆 exosome DNA ；
[0070] e)经预处理的血浆和未经处理的血浆。
[0071 ] 空白对照：除不含DNA模板外，其他均相同；
[0072] 阴性对照：pMD-18-T质粒作为模板。
[0073] 2. 3微滴生成
[0074] 4)将20 y 1体系加入微滴生成卡上Sample孔中，70 y 1的微滴生成油加入Oil孔 中，该过程操避免气泡产生和交叉污染，套上干净的专用胶条；
[0075] 5)将微滴生成卡置于微滴生成器上，进行微滴生成过程，在该过程中，Sample孔 中体系与微滴生成油在负压的作用下，一并被混合至Droplet孔（微滴孔）以形成微滴；
[0076] 6)取出微滴生成卡，吸取40 iil微滴至干净96孔板相应的孔内，盖上专用铝箱纸， 在180 °C按压封口后，普通PCR仪上进行扩增。
[0077] 2. 4 PCR扩增条件
[0078]
[0079] 以上每步升降温设置2°C /s
[0080] 2. 5读取微滴：
[0081] 将已完成PCR反应的96孔板置于BIO-RAD DX200Droplet Reader进行微滴读取， 利用QuanatSoft 1. 6软件进行分析。
[0082] 2. 6重组质粒的qPCR和ddPCR结果比较
[0083] qPCR分析10~106copies/ y 1重组质粒能达到较高的扩增效率并呈现较好的线 性（R2= 0. 995)，但在拷贝数低于lOcopies/ y 1时，Cq值大于33 (图la, b)，结果准确度降 低。但ddPCR在低拷贝时仍能较好的检测出mtDNA，且空白对照和阴性对照均未有非特异性 扩增（图2a，b)。
[0084] 对重组质粒的qPCR和ddPCR结果进行相关性分析，发现两者呈线性相关，相关系 数 R2= 0? 996(图 2c)。
[0085] 实施例3?利用ddPCR检测血浆mtDNA和血浆exosome mtDNA的拷贝数
[0086] Exosome是存在于各种体液细胞外囊泡，血衆含大量的exosome。Exosome含有多 种蛋白质和核酸，其中包括mtDNA，因此，exosome mtDNA可能是血衆mtDNA的一部分。
[0087] 利用前述ddPCR技术检测血衆和exosome内低拷贝的mtDNA，结果显不血 楽_ mtDNA 和 exosome mtDNA 分别为 117. 61 ±10.68 (Log1(): 2. 04±0. 04) copies/yl 和 21. 06±1.91(Log1Q:1.30±0.04)copies/iil。两者比例（exosome mtDNA/血衆mtDNA)为 0? 19±0. 018(图 3a，b, c)。
[0088] 实施例4利用ddPCR直接检测血浆样本mtDNA的拷贝数
[0089] 血浆成分复杂，内含大量的蛋白质和其他抑制PCR反应的干扰物，且为避免ddPCR 过程中由于血浆成分（如细胞碎片、大分子免疫球蛋白等）影响其直径250 ym的微滴形 成，因此在直接将血浆作为模板前，对血浆进行了两种方法的前处理。首先，血浆1600g离 心lOmin，进而将血衆等分为两份，一份继续16000g离心10min，另一份经0. 22ym -次性 滤膜过滤，两份血浆同时进行ddPCR。
[0090]从微滴的一维图可见，阳性微滴和阴性微滴可较好的被分开（图4a)，且总微滴 数平均值为14, 185 (图4b)，已达到作为ddPCR分析的数量。在比较血浆前处理的两种方 法中，发现结果并无明显差异，分别为157. 50±24. 16 (Log1Q: 2. 17±0. 06) copies/ y 1和 168. 83±31. 95(Log10:2. 19±0. 09)copies/y 1(图 4c)。
[0091] 实施例5重组质粒的回收实验
[0092] 将已知拷贝数的重组质粒（325copies/ y 1，Log1Q:2. 498copies/ y 1)，加入不同的 血浆样本，进行ddPCR分析，计算加入质粒前后，血浆mtDNA拷贝数的差异。结果发现，计算 的拷贝数差值为348. 40 ± 34. 30 (Logl。: 2. 540 ±0. 041) copies/y 1，与加入的质粒拷贝数差 值接近（图5)，平均回收率达101. 68%。结果提示，用血浆作为模板进行ddPCR分析可以 达到较高的准确度。
[0093] 实施例6抗凝剂EDTA-NaJ# ddPCR的影响
[0094] 血浆中存在一定量的抗凝剂，EDTA是临床上常用的抗凝剂。将不同浓度 EDTA-Na 2 (5, 10, 15, 20, 25, 30mM)按照1:1加入重组质粒，进行ddPCR分析。结果发现浓度 低于20mM时，EDTA-Na2并不能抑制ddPCR的扩增（图6a, b)，而该浓度已远远超过常规浓 度5mM，即说明ddPCR分析并不受常规用量的EDTA-NaJ^干扰。
[0095] 综上所示，本专利所建立的新方法可用于分析提取的血衆DNA、exosomeDNA中低 水平的mtDNA含量。此外，可以直接用血浆作为样本，进行ddPCR分析，该法不仅减少了因 提取DNA所致的含量损失，结果可靠，而且便于临床实验室进行样本分析。
【主权项】
1. 一种利用微滴式数字化PCR检测外周血游离线粒体DNA含量的方法，主要包括以下 步骤： 1) 重组质粒的构建：通过PCR扩增MT-NDl基因，将MT-ND1PCR产物通过T-A克隆至 pMD?18_T载体，并转化大肠杆菌E. coli DH5 a . 2) 样本制备：利用质粒小提试剂盒提取E. coli DH5 a的重组质粒，调整质粒拷贝数， 并稀释成1~IO6Copies/ U 1。 3) 提取血浆DNA和Exosome DNA :采集外周血至EDTA-NaJjt凝管，分离血浆。将500 y 1 血浆分为两等分，其中250 y 1血浆采用磁珠法直接提取DNA，250 y 1首先分离exosome，在 exosome沉淀中加含有IU DNaseI溶液中重悬并在37°C孵育Ih以去除exosome外的DNA。 4) 对血浆进行预处理：取500 y 1血浆，1600g离心5min，上清转至新I. 5ml EP管； 16000g离心5min，取上清过0. 22 y m -次性过滤器；取预处理的血浆按1:1比例依次加入 1~IO4Copies/ y I MT-NDl-pMD18-T标准质粒，混匀，混合样本直接作为模板进行DD-PCR 分析。 5) 利用ddPCR分析重组质粒mtDNA拷贝数，包括设计引物和探针，利用重组质粒、血 浆DNA、血浆exosome DNA以及经处理或未处理的血浆作为模板，扩增体系形成微滴后在 PCR仪上进行扩增，扩增完毕后，将已完成PCR反应的96孔板置于BIO-RAD DX200Droplet Reader进行微滴读取，利用QuanatSoft 1. 6软件进行分析。2. 根据权利要求1所述的一种利用微滴式数字化PCR检测外周血游离线粒体DNA含 量的方法，其特征在于，所述方法步骤1中PCR扩增MT-ND1基因的引物序列如下：前向引物 为 5' CAGCCGCTATTAAAGGITCG3'，反向引物为 5' AGAGTGCGTCATATGITGTTC 3'，扩增片段长度 1041bp[Homo sapiens mtDNA(GeneBank No. NC_012920)np3017-4057]〇3. 根据权利要求1-2所述的一种利用微滴式数字化PCR检测外周血游离线粒体DNA含 量的方法，其特征在于，所述方法步骤2中质粒拷贝数使用以下公式调整：MWdna(daltons) =(pMD18-T vector+Insert)X660 (daltons/bp) = (2692bp+1041bp)X660(daltons/bp) =2. 46XIO6(daltons)； CNDNA(copies/y I) =Cdna (ng/y I) X 6. 02 X 1014/MffDNA= C DNA (ng/y I) X 6. 02 X 1014/2. 46 X IO6= C DNA (ng/ y I) X 2. 45 X 108. (CNdna:质粒拷贝数；Cdna:质粒DNA浓度；MWdna:质粒分子量）。4. 根据权利要求1-3所述的一种检测线粒体DNA含量的方法，其特征在于，所述方法 步骤 5 中所用引物和探针如下：F:CCCTAAAACCCGCCACATCT ;R:GAGCGATGGTGAGAGCTAAGGT ;探 针：CCATCACCCTCTACATCACCGCCC，使用 BHQl 作为淬灭基团。5. 根据权利要求1或3或4所述的一种利用微滴式数字化PCR检测外周血游离线粒体 DNA含量的方法，其特征在于，所述方法步骤5的扩增体系中还包含空白对照和阴性对照， 其中空白对照为不含DNA模板的PCR体系，阴性对照为使用pMD-18-T质粒作为模板。6. 根据权利要求1所述的一种利用微滴式数字化PCR检测外周血游离线粒体DNA含量 的方法，其特征在于，所述方法步骤5生成微滴的步骤如下： 将20 y 1体系加入微滴生成卡上Sample孔中，70 y 1的微滴生成油加入Oil孔中，该过 程避免气泡产生和交叉污染，套上干净的专用胶条； 将微滴生成卡置于微滴生成器上，进行微滴生成过程，在该过程中，Sample孔中体系与 微滴生成油在负压的作用下，一并被混合至Droplet孔（微滴孔）以形成微滴； 3)取出微滴生成卡，吸取40 y 1微滴至干净96孔板相应的孔内，盖上专用铝箱纸，在 180 °C按压封口后，普通PCR仪上进行扩增。7.权利要求1至6的任一项所述的方法在检测外周血游离线粒体DNA含量中的应用。
【专利摘要】本发明建立了一种利用微滴式数字化PCR检测外周血游离线粒体DNA含量的方法。所述方法包括重组质粒的构建、样本制备、提取血浆DNA和Exosome？DNA、对血浆进行预处理，以及使用微滴式数字化PCR分析重组质粒mtDNA拷贝数等步骤。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105132571
【申请号】CN201510616340
【发明人】叶薇, 汤晓君, 刘楚, 杨政权, 吕建新
【申请人】温州医科大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月24日