用于鉴定桃果实非酸性状的分子标记、引物对及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，涉及一种用于鉴定桃果实非酸性状的分子标记、 引物对及其应用。
【背景技术】
[0002] 桃为蔷薇科李属桃亚属多年生落叶果树，其果实柔软多汁，风味宜人，为大众喜爱 的果品。桃果实营养价值高，既富含多糖果胶质又含多种维生素和矿质元素，是老少皆宜的 水果。
[0003]目前，桃果实从风味上可以分为两种：非酸桃和酸桃。每一种类型都有相应的消费 群体以及重要的利用价值，但是对如今的桃产业体系来说，品质优良的品种仍旧很少。培育 高品质的非酸桃、酸桃成为当下急需解决的问题。
[0004]目前，育种家在桃育种工作中主要采用的是传统的杂交选育新品种的方法，该方 法育种周期长，占地面积大，耗时耗力，而且育种效率低。对非酸桃、酸桃的选育更是如此， 育种早期根本无法区分非酸桃与酸桃性状。
[0005] 而且，桃树育种工作中没有一种有效准确方便快捷的AS-PCR分子标记用于非酸 桃、酸桃的选育，育种家只能等到树体达到具有开花结果能力之后进行选择，因而培育非酸 桃与酸桃工作花费的时间长、工作量大、效率低。
[0006] 然而，随着消费者需求的不断提高，如何快速高效地培育风味更好、品质更优的非 酸桃与酸桃品种成为现在育种家面临的严峻挑战。目前急需一种准确高效的分子标记，利 用分子标记辅助选择育种技术，快速提高非酸桃与酸桃的选育效率，加速育种进程，加速中 国桃产业的发展。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定桃果实具有非酸性状还是酸 性状的引物对。
[0008] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定桃果实具有非酸性状还是酸性状的引物对， 是用于检测桃基因组第5号染色体的第541075位核苷酸的单核苷酸多态性的引物对，其上 游引物可根据桃基因组第5号染色体的第541075位核苷酸及其上游序列进行设计，下游引 物可根据桃基因组第5号染色体的第541075位核苷酸的下游序列进行设计。
[0009] 具体而言，在本发明中，所述引物对具体由序列表中序列1和序列2所示的两条单 链DNA分子组成。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定桃果实具有非酸性状还是 酸性状的试剂盒。
[0011] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定桃果实具有非酸性状还是酸性状的试剂盒， 含有所述引物对和如下中的至少一种：dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液。
[0012] 本发明的又一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定桃果实具有非酸性状还是 酸性状的分子标记。
[0013] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定桃果实具有非酸性状还是酸性状的分子标 记，具体为以桃基因组DNA为模板，采用所述引物对进行PCR扩增所得的DNA片段。
[0014] 桃基因组第5号染色体的第541075位核苷酸的单核苷酸多态性在鉴定或辅助鉴 定待测桃的果实具有非酸性状还是酸性状中的应用也属于本发明的保护范围。
[0015] 用于鉴定桃基因组第5号染色体的第541075位核苷酸为C还是T的物质在鉴定 或辅助鉴定待测桃的果实具有非酸性状还是酸性状中的应用也属于本发明的保护范围。
[0016] 其中，所述用于鉴定桃基因组第5号染色体的第541075位核苷酸为C还是T的物 质可包括如下引物对；根据所述桃基因组第5号染色体的第541075位核苷酸位点及附近序 列所设计的引物对。
[0017] 进一步，所述用于鉴定桃基因组第5号染色体的第541075位核苷酸为C还是T的 物质可为所述引物对或所述试剂盒。
[0018] 所述引物对或所述试剂盒在鉴定桃基因组第5号染色体的第541075位核苷酸为 C还是T中的应用也属于本发明的保护范围。
[0019] 本发明的还一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测桃的果实具有非酸性状还 是酸性状的方法。
[0020] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测桃的果实具有非酸性状还是酸性状的方法， 具体可为如下（A)或（B):
[0021] ⑷包括如下（al)和（a2):
[0022] (al)以待测桃的基因组DNA为模板，以所述引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；
[0023] (a2)对步骤（al)所得PCR产物进行测序，根据测序结果按照如下方法确定所述待 测桃的果实具有非酸性状还是酸性状：
[0024]若所述PCR产物为如下（I)或（II)，则所述待测桃的果实具有或候选具有非酸性 状；若所述PCR产物为如下（III)，则所述待测桃的果实具有或候选具有酸性状：
[0025] (I)单一产物：所述PCR产物中对应于桃基因组第5号染色体的第541075位核苷 酸为C;
[0026] (II)两种产物：一种产物中对应于桃基因组第5号染色体的第541075位核苷酸 为C，另一种产物中对应于桃基因组第5号染色体的第541075位核苷酸为T;
[0027] (III)单一产物：所述PCR产物中对应于桃基因组第5号染色体的第541075位核 苷酸为T;
[0028] ⑶包括如下（bl)和（b2):
[0029] (bl)以待测桃的基因组DNA为模板，以所述引物对（序列1和序列2)进行PCR扩 增，获得PCR产物；
[0030] (b2)检测步骤（bl)所得PCR产物的大小，根据检测结果按照如下方法确定所述 待测桃的果实具有非酸性状还是酸性状：若所述PCR产物中含有大小为370bp的DNA片段， 则所述待测桃的果实具有或候选具有非酸性状；若所述PCR产物中不含有大小为370bp的 DNA片段，则所述待测桃的果实具有或候选具有酸性状；
[0031] 具体的，所述大小为370bp的DNA片段为序列表中序列3所示DNA片段。
[0032]步骤（al)和（bl)中的所述待测桃的基因组DNA可来自于任何发育时期的所述待 测桃的任何组织或器官。在实际应用中，为了实现对待测桃果实的非酸性状/酸性状的早 期快速鉴定，通常以待测桃的苗期叶片作为基因组DNA提取样本。
[0033] 在实际应用中，判断PCR产物中是否含有目的DNA片段时，可通过将PCR产物进行 琼脂糖凝胶电泳（凝胶浓度具体可如1% )，看电泳图谱上是否含有目的条带：电泳图谱上 含有目的条带，则PCR产物中含有目的DNA片段。
[0034] 在实际应用中，判断PCR产物中是否含有序列3所示DNA片段，可通过对PCR产物 进行核苷酸序列测定来判断。
[0035] 在上述方法中，以所述引物对（序列1和序列2)进行PCR扩增的退火温度具体可 为 58°C。
[0036] 更加具体的，以所述引物对（序列1和序列2)进行PCR扩增的具体反应程序如下： 95￡€31^11;941€3〇8,58 1€3〇8,721€2〇8,30个循环；72。(：1〇111111。
[0037] 所述引物对或所述试剂盒或所述方法在如下（I)-(IV)中的应用也属于本发明的 保护范围：
[0038] (I)筛选果实具有非酸性状的桃品种；
[0039] (II)筛选果实具有酸性状的桃品种；
[0040] (III)培育果实具有非酸性状的桃品种；
[0041] (IV)培育果实具有酸性状的桃品种；
[0042] 培育果实具有非酸性状（或酸性状）的桃品种的方法，包括采用通过所述鉴定或 辅助鉴定待测桃的果实具有非酸性状还是酸性状的方法鉴定为或候选为果实具有非酸性 状（或酸性状）的桃作为亲本进行育种的步骤。
[0043] 在本发明中，所述非酸性状为果实中总有机酸含量小于等于5mg/g;所述酸性状 为果实中总有机酸含量大于5mg/g。所述总有机酸为苹果酸、柠檬酸、奎宁酸、琥珀酸和酒石 酸的加和。
[0044] 其中，所述果实中总有机酸含量是通过离子色谱法测定的。所述离子色谱法的条 件如下：柱子为 Icseq IcE-coREGEL 64H Column;柱温 65°C。流动相为 2. 5mol/L H2S0j§ 液，抑制柱再生液为50mmol/L LiCl ;流量为0. 7ml/min ;满刻度为1000 y s/cm ;定量阀（进 样量）为20 iil。根据上述5种有机酸（苹果酸、柠檬酸、奎宁酸、琥珀酸和酒石酸）的标样 进行定量。
[0045] 在本发明中，所述桃基因组第5号染色体的第541075位核苷酸具体对应桃基因组 上序列表中序列3的第19位核苷酸，该核苷酸在桃基因组中为C或T。
[0046] 本发明对92份待测桃的统计实验结果表明，采用本发明引物对（序列1和序列 2)扩增出370bp目的条带（序列3)的桃中，有100%为果实具有非酸性状的桃；未扩增出 370bp目的条带（序列3)的桃中，有92. 3%为果实具有酸性状的桃。可见，本发明所提供 的检测桃果实具有非酸性状还是酸性状的方法可靠、简便、实用，在非酸桃、酸桃的选育工 作中，可以显著降低育种的工作量，缩短育种时间，极大地提高育种效率。
【附图说明】
[0047] 图1为部分桃品种的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，a表示果实具有酸性状；n 表示果实具有非酸性状。M为DNA Marker。
【具体实施方式】
[0048] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0049] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0050] 实施例1、鉴定桃果实非酸性状或酸性状的引物对的获得及其应用
[0051] -、桃果实非酸性状或酸性状的鉴定
[0052] 以表1中92份郑州果树所资源圃中种植的常规桃品种作为实验材料，测定各桃的 果实具有非酸性状还是酸性状。具体如下：
[0053] 1、测定方法
[0054] 将新鲜果肉切块于液氮中冷冻后，用研磨仪磨成粉末状，称取2g粉末状果肉样品 至10ml离心管，加入8ml 80% (体积分数）乙醇，混匀。35°C水浴20min，4500g 4°C离心 15min，上清液转移至25ml容量瓶。重复2次，定容至25ml。取2. 5ml提取液，40°C旋转蒸 干，加lml超纯水溶解，转移至1. 5ml离心管。过0. 22 y m滤膜后上机进行离子色谱，测定 总有机酸含量。
[0055] 离子色谱测定待测样品或标准品中有机酸含量时采用的参数具体如下：
[0056] 柱子：ICSeq IcE-COREGEL 64H Column。柱温 65°C。流动相：2. 5mol/L 1^04溶 液；抑制柱再生液50mmol/L LiCl。流量0. 7ml/min。满刻度1000 ys/cm。定量阀（进样 量）：20yl。在该条件下，对照品及样品中有机酸各组分分离效果佳，峰形良好。
[0057] 实验具体采用标准曲线法分别检测待测样品中苹果酸、柠檬酸、奎宁酸、琥珀酸 和酒石酸的含量，将所得5种有机酸含量相加即为总有机酸含量。实验过程中涉及的各 有机酸标准品参见国家标准物质网（http://www. bzwz. com/plist_5/plist_5_0_0