一种蚜虫共生菌多重pcr检测的引物组和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种蚜虫共生菌多重PCR检测的引物组和 检测方法。
【背景技术】
[0002] 姐虫，属于半翅目，胸卩彖亚目（Sternorrhyncha)，是一类重要的经济害虫。姐虫和 细菌的关系密切，共生菌在蚜虫中发挥着多样化的功能，如补充营养、增强蚜虫对高温的忍 耐，增强蚜虫对寄生蜂寄生和真菌感染的抵抗能力，扩大蚜虫的寄主范围等。但是蚜虫共生 菌对生存环境要求苛刻，基本上都不能在蚜虫体外进行纯培养，因此蚜虫共生菌的感染检 测都是通过分子手段进行鉴定的。蚜虫共生菌作为除了蚜虫核糖体和线粒体DNA外第三种 可遗传的物质，以其为对象开展的蚜虫种群遗传结构分析、真核和原核生物互作，以及利用 共生菌作为介体开展对蚜虫的生物防治都是目前国内外研究的热点。如何对蚜虫中共生菌 的物种多样性进行准确的分析，是开展上述研究工作的前体前提，但是目前对蚜虫共生菌 的检测工作基本上都是单个物种进行的，需要耗费大量的人力物力。多重PCR是在环境微 生物物种多样性检测中一种高效的分子检测方法，已经广泛的应用在土壤微生物、植物病 原微生物多样性的检测中，并取得了很好的结果。
[0003] 沃尔巴克氏菌（Wolbachia pipientis)、杀雄菌属（Arsenophonus)和!lj牙虫 U 型共生菌（Regiella insecticola)是姐虫中常见的三种共生菌，本发明中成功建立了 一套快速、准确、直观并兼有高灵敏度的多重PCR反应体系，力图一次性阐明待测蚜虫 总DNA中三种共生菌的感染情况。本发明中以三种蚜虫共生菌相关的蛋白质基因作为 靶标基因，相较于目前细菌鉴定中常用的16S rRNA基因具有更强的灵敏度和特异性。 wsp基因编码的是细菌外膜蛋白，是国际上对沃尔巴克氏菌进行检测和分型的通用基因 (Zhou ff, Rousset F, O'Neill S. 1998. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological sciences，265:509-515) ;yaeT 基因编码的是外膜 蛋白组装因子，已经广泛的应用于虫牙虫杀雄菌属的多基因分型中（Jousselin E，Coeur d'Acier A,Vanlerberghe-Masutti F,Duron 0.2012.Evolution and diversity of Arsenophonus endosymbionts in aphids. Molecular Ecology, 22:260-270) ;gltA 基因 编码细菌中的柠檬酸合成酶，已经成功的用于蚜虫U型共生菌的检测（Li T，Xiao JH，Wu YQ, Huang Dff. 2014.Diversity of bacterial symbionts in populations of Sitobion miscanthi (Hemiptera:Aphididae) in China. Environmental Entomology, 43:605-611) 〇 本发明中使用的引物组合分别扩增wsp基因435bp片段、yaeT基因294bp片段、gltA基因 174bp片段，扩增片段间长度差异都超过100bp，普通的1%的琼脂糖凝胶电泳就可以完全 清楚分辨不同的扩增产物，从而直观的反应出待测的蚜虫样品中共生菌的感染情况。本发 明所使用的引物序列均为独立设计出来的。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中存在的问题，本发明体提供一种蚜虫共生菌多重PCR检测的引物 组和检测方法，该多重PCR检测方法可同时快速、准确鉴定蚜虫样品是否感染三种常见共 生菌，克服了现有技术中对蚜虫共生菌检测耗时耗力的缺点，为下游的相关研究节省一定 的人力物力。
[0005] 本发明采用的技术方案为：
[0006] -种蚜虫共生菌多重PCR检测的引物组，所述引物组是由检测尔巴克氏菌 (Wolbachia pipientis)、杀雄菌属（Arsenophonus)和！lj牙虫 U 型共生菌（Regiella insecticola)的引物对组成；
[0007] 所述检测沃尔巴克氏菌引物对（Wol-F/R)的上下游引物的核苷酸序列为：
[0008]上游引物 Wol-F :5' -ATAGCTGGTGGTGGTGCATT-3'（SEQ ID NO. 1)，
[0009]下游引物 Wol-R :5'-TGCACCAACAGTGCTGTAAAC-3'（SEQ ID NO. 2);
[0010] 所述检测杀雄菌的引物对（Ars-F/R)的上下游引物的核苷酸序列为：
[0011] 上游引物 Ars-F :5' -AGCGCTATTTTCAACGGGTA-3'（SEQ ID N0. 3)，
[0012] 下游引物 Ars-R :5'-CGATTACTCGGTAGCGGTGT-3'（SEQ ID NO. 4);
[0013] 所述检测蚜虫U型共生菌的引物对（Reg-F/R)的上下游引物的核苷酸序列为：
[0014] 上游引物 Reg-F :5' -ACTGCTCCATCGTGGITITC-3'（SEQ ID N0. 5)，
[0015] 下游引物 Reg-R :5' -CCACGAAAAAGATGCCAAAT-3'（SEQ ID NO. 6)。
[0016] -种蚜虫共生菌多重PCR检测的方法，该方法是将上述的引物组与待测蚜虫样品 的总DNA进行多重PCR反应，反应结束后对PCR反应产物进行电泳分析，以确定蚜虫样品中 是否含有蚜虫共生菌，具体包括以下步骤：
[0017](1)引物合成：合成权利要求1所述的引物组中的三种引物对；
[0018] (2)DNA |旲板提取：提取!lj牙虫样品的总DNA ;
[0019] (3)多重PCR扩增反应：以步骤⑵提取得到的总DNA为模板，以步骤⑴中合成 的引物组为引物，进行PCR扩增反应；
[0020] (4)多重PCR产物分析：将步骤（3)中得到的多重PCR扩增产物进行电泳分析。
[0021] 根据上述蚜虫共生菌多重PCR检测的方法，其中，PCR扩增反应的反应体系为 50yl :10XPCRBufTer(100mM/LTris-HCl，500mM/LKCl)5yl，2.5mM/I^9dNTPs4yl，5U/ y 1 的 Taq DNA 聚合酶 0? 5 y 1，10 y m/L 的 wsp-F 2. 0 y 1，10 y m/L 的 wsp-R 2. 0 y 1，10 y m/ L 的 Ars_F 2. 0 y 1，10 y m/L 的 Ars-R 2. 0 y 1，10 y m/L 的 Reg_F2. 0 y 1，10 y m/L 的 Reg-R 2. 0 y 1，DNA 模板 1 y 1，25mM/L 的 MgCl23 y 1，去离子水补至 50 y 1。
[0022] 根据上述蚜虫共生菌多重PCR检测的方法，PCR扩增反应的反应条件为：
[0023] a :94°C 预变性 4min;
[0024] b:94°C 变性 30s，
[0025] c:55°C退火 30s，
[0026] d :72°C延伸 30s，b-d 循环 35 个反应；
[0027] e :72°C 延伸 10min。
[0028] 上述引物组（其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1-6)在检测蚜虫样品共生菌感染情况 中的应用。
[0029] 本发明的积极有益效果：
[0030] (1)本发明建立了一种具有高灵敏度，能快速鉴定蚜虫样品中三种常见共生菌感 染情况的多重PCR检测方法，检测结果和单对引物扩增结果一致，证明本发明方法的可行 性。
[0031] (2)本发明所建立的检测方法能够在一个PCR反应中同时鉴定蚜虫样品中三种蚜 虫共生菌的感染情况，大大降低了工作量，提升了工作效率，节省了一定程度的检测费用。
[0032] (3)本发明具有快速、准确、灵敏度高的特点，可以为以蚜虫和共生菌为模式开展 的蚜虫种群遗传结构分析、真核和原核生物互作，以及利用共生菌为生物工程菌对蚜虫进 行遗传改造等工作中，筛选可靠的实验材料节省人力物力。
【附图说明】
[0033]图1为本发明实施例3中引物浓度梯度筛选和扩增灵敏度分析的琼