专利名称：检测叶螨体内共生菌的多重pcr检测方法
技术领域：
本研究开发了一种能同时检测叶螨体内共生菌『o/k cWa和Cara fm'MOT的多重PCR方法，属 于生物技术领域，可用于检测叶螨体内这两种共生菌。
二背景技术：
PTo/6ac/^和CaW/"/wm是两类呈母性遗传的共生菌，它们能通过不同的方法调控寄主的生殖。 ffe/6acWa，属于ct亚门，能够引起寄主的以下四种生殖异常行为胞质不亲和，孤雌生殖，雌性 化，杀雄。CaW/m'"附属于Bacteroidetes细菌类群，能引起寄主的三种生殖异常行为胞质不亲和， 孤雌生殖，雌性化。
随着研究的深入，发现在少数昆虫和螨的生殖系统内，同时含有两类寄生菌C"W;m'Mw和 『0/Z>wWa。叶螨中，也已发现了双重感染现象。对于未知感染状况的叶螨，为了研究共生菌 CaW"/i/m和恥/tecWa对生殖和发育的共同调控作用，以及寄生菌之间的相互作用，检测叶螨体 内共生菌『o/6acWa和CaW/"/"w的感染情况是进行研究的前提和重要手段。目前对于这两种共 生菌，主要用基于PCR的分子方法分别进行检测，即通过两次PCR来完成对共生菌『o仿acWa 和CaWm't/m的检测。当面临大量的样本需要检测时，分别检测恥/6acWa和CaW/"/鹏，耗时、 耗材、又耗力。多重PCR (Multiplex PCR)方法则克服了常规PCR只能检测一个模板的缺点。 多重PCR是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对 多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。用多重PCR同时扩增多个 目的片段，具有节省时间、降低成本、提高效率、节省珍贵的实验样本等优势。
作者已研究多重PCR (Multiplex PCR)方法同时检测叶螨体内的共生菌『o仿ac/n'a和 Ow^fm'M/w的过程，并证实了该检测方法具有特异性、灵敏性和可实用性。
三
发明内容
技术问题 本发明的目的是通过分别设计新的恥/6ac/^和0 W"/Mm的特异性引物，使 这两对引物在一个PCR反应中能正常作用，分别扩增两段不同大小的目的片段。即将原本需要两 次常规的PCR扩增才能完成对两种共生菌的检测，縮减到一次多重PCR检测同时完成。
技术方案 同时检测叶螨体内两种共生菌沃尔巴克氏体(肠/6ac/n'a 'e"to)和
OwJZ"/Mm的多重PCR检测方法，共分为三步
1) 提取叶螨总DNA
挑单头雌成螨放入25^1 STE缓冲液中进行碾磨，加入2nl 10mg/ml蛋白酶K， 37'C孵育30min 后，95'C初始变性5min并使蛋白酶K失活，作为DNA模板用于PCR扩增，STE缓冲液配制 励mMNaCl， 10mM Tris-HCl， lmMEDTA， pH 8.0;
2) 多重PCR扩增基于沃尔巴克氏体(WWZ)acWa 的wsp基因序列和Carc//w'w/w的16S rDNA基因序
列分别设计特异性引物WSP/F236&R446, CLO/F735&R1013: WSP/F236 5'-GACAGTTTAACAGCATTTTCAGGA-3' WSP/R446 5'-GTTTGATTTCTGGAGTTACATCAT-3' CLO/F73 5 5'-CTCGCAAGGGTGAAACTCAAAGG-3'
CLO/R1013 5'-CCGCTTACACGGGCAGTCTACTT隱3' 以提取的叶螨总DNA作为DNA模板，多重PCR反应体系及扩增条件如下
反应体系
ddH20 14都L
10xBuffer 2.5^L
Mg2Cl 25mM 1.5pL
dNTP 2.5mM 2pL
Primers WSP/F236&R楊 10, 0.5nLx2
Primers CLO/F735&R1013 10一 0.5fiLx2
Taq DNA聚合酶 5U/nm 0.2^L
DNA模板 2.0nL
总体积 25 nL 扩增条件
预变性94°C, 2min;
35个循环变性94'C, 30s，退火55°C， 45s,延伸72°C， 45s; 延伸72°C， 5min; 3)琼脂糖凝胶电泳检测
取PCR反应产物5^1，在质量体积比2.0%的琼脂糖凝胶上100 V电压电泳检测，最后在Gel Doc EQ凝胶成像系统下观察，如果能扩增出211bp目的片段表示该叶螨感染了共生菌恥化ac/n》；如 果能扩增出279bp目的片段表示该叶螨感染了共生菌CaW/"/"m。
有益效果 本发明提供的多重PCR检测技术具有如下优点
1、 多重PCR (Multiplex PCR)方法改变了通过一次PCR扩增只能检测一种共生菌的缺点。与常 规的PCR分子检测相比，多重PCR检测，即在一个反应体系中，同时扩增共生菌和 CaW"!'"w的特异性目的片段，通过一次琼脂糖凝胶电泳，能检测叶螨中两种共生菌的感染状态，
具有节省时间、降低成本、提高效率、节省珍贵的实验样本等优点。
2、 多重PCR检测具有特异性和较好的灵敏性(图l，图2)。
3、 用多重PCR技术检测叶螨自然种群中Ow^'m'MW和『o仿acWa的感染情况，得到的结果与常 规PCR分子检测结果相一致。
四
图1 用多重PCR检测朱砂叶螨体内QzW/"/mw和『oftac/z/a的特异性 M: Marker (DL 2000); 1， 2:朱砂叶螨『o/6acWa-Cara7"fww双重感染雌成螨；3, 4:朱砂叶螨 单感染Ow^'"/m附雌成螨；5， 6:朱砂叶螨单感染『o/Z>acWa雌成螨；7， 8:朱砂叶螨不感染雌 成螨；9， 10:清水对照(不加DNA模板)
图2多重PCR的敏感性测试 M: Marker (DL 2000); A图.1-6显示将单头『0/6acWa-G3re^"&w双重感染朱砂叶螨DNA稀释 1， 2， 5， 10， 25， 50倍后作为模板进行多重PCR检测的结果，7为阴性对照；B图.1-7显示将 单头单感染『o仿ac/ /a及单头单感染CaWZ"/ww朱砂叶螨的DNA和灭菌水按比例混合(分别为 50:0:0， 25:1:24， 10:2:38， 5:5:40， 2:10:38， 1:25:24， 0:50:0)后作为模板进行多重PCR检测的结 果
图3用多重PCR技术检测叶螨自然种群中CaW/w'柳和恥/6acWa的感染情况 M: Marker(DL2000); 1， 2:阴性对照；3， 4:阳性对照；5-24:叶螨自然种群；A图.朱砂叶 螨(江苏地理种群)；B图.朱砂叶螨(云南地理种群)；C图.朱砂叶螨(山西地理种群)；D图.山 楂叶螨(内蒙古地理种群) 五具体实施例方式
1、适用于多重PCR (Multiplex PCR)特异性引物设计
共生菌ffo/tocfeap—'e油'5，简称『o/Z>ac/ 'a，公知公用，见参考文献(Hertig M. The rickettsia, 恥/6ac/z/a /Jij^Zewris (gen.et sp.n.) and associated inclusions of the mosquite Cw/ex pz]p/ews. i^nafs/Zo/ogy, 1936,28:453-486)，中文属名为沃尔巴克氏体，暂无中文种名。
共生菌CariiZwz'w附，艮卩Cawcfcfafttf Cardinium hertigii， 公失口公用，见参考文献(Zchori-Fein E, Perlman S J， Kelly S E, Katzir N, Hunter M S. Characterization of a '5acfera/ofetes' symbiont in 五"rars/a wasps (Hymenopera: Aphelinidae): proposal of 'CaWc a,ws Cara /w/柳Z/eW妙，，/"f. / S，. ￡vo/. TW/ctoWo/., 2004, 54: 961-968.)， 2004年首次命名，暂无中文属名。
『0/toc/n'a的外表皮蛋白基因w^基因常作为一种遗传标记，用于『o仿ac^'a的检测。而至今仅有 一种遗传标记用于检测CaWw'鹏，16S rDNA。在基因库中搜索已有的恥仂flcM 的vi^基因序列以及 CaWim'mw的16S rDNA，并用BioEdit软件分别进行序列比对，结果显示了较高的同源性(>80%， >97%)。根据以上序列比对结果，基于『o/Zwc/n'a的vwp基因序列(序列号AB096222， NCBI GenBank) 和CaW"&m的16S rDNA基因序列(序列号DQ369965， NCBI GenBank)分别设计特异性引物 WSP/F236&R446， CLO/F735&R1013,以扩增不同大小的目的片段，分别为2Ilbp和279bp，从而能 通过琼脂糖凝胶电泳区分出两种共生菌。多重PCR (MultiplexPCR)检测的具体步骤如下
1)提取叶螨总DNA
挑单头雌成螨放入25^1 STE缓冲液中进行碾磨，加入2^1 10mg/ml蛋白酶K， 37'C孵育30min 后，95'C初始变性5min并使蛋白酶K失活，作为DNA模板用于PCR扩增，STE缓冲液配制 兩mMNaCl， 10mMTris-HCl， lmMEDTA， pH 8.0;2)多重PCR扩增
以提取的叶螨总DNA作为DNA模板，多重PCR反应体系及扩增条件如下: 反应体系
ddH2014.8mX
10xBuffer2.5(xL
Mg2Cl 25mM1.5^
dNTP 2.5mM
Primers WSP/F236&R446
Primers CLO/F735&R1013lOjiM
Taq DNA聚合酶 5U/pm
DNA模板
总体积25pL
扩增条件
预变性94°C， 2min;
变性94°C, 30s,退火55°C， 45s，延伸72°C， 45s; 35个循环； 延伸72°C， 5min; 3)琼脂糖凝胶电泳检测
取PCR反应产物5nl，在质量体积比2.0%的琼脂糖凝胶上100 V电压电泳检测，最后在Gel Doc EQ凝胶成像系统下观察。如果能扩增出211bp目的片段表示该叶螨感染了共生菌恥/Z^W化如 果能扩增出279bp目的片段表示该叶螨感染了共生菌0 ^"/"附。
2、 多重PCR (MultiplexPCR)检测的特异性
从朱砂叶螨中，取^b/6<3cWa-Can^>H'Mm双重感染，只感染『o/6<3cWa，只感染Ozra^m'j/附以 及不感染雌成螨各两头，分别提取DNA (均用常规的PCR方法检测确保其感染状态)，用于多重 PCR检测。结果显示在图l中。结果显示，只有在DNA模板中存在相应的共生菌时才会扩增出 相应的PCR产物，而且没有出现大于100bp的非特异性片段。由于两对特异性引物扩增的产物大 小不同，通过琼脂糖凝胶电泳检测时，更容易区别共生菌特异性DNA片段。检测不感染叶螨以 及空白对照中均没有出现特异性及非特异性片段。这些结果显示了多重PCR检测时引物以及反应 体系的特异性。多重PCR检测时，新设计的引物作用理想，而且能产生适宜的产物量。
用多重PCR检测双重感染的朱砂叶螨，扩增出的两个特异性片段经过纯化，分别进行测序。 共生菌的特异性扩增片段大小为211bp，共生菌Ca S /"/ 的特异性扩增片段大小为 279bp。用BioEdit软件分别将这两段序列与己知的『o仿acWa的wsp基因序列，CaW"/鹏的16S rDNA基因序列进行比对，均显示较高的同源性。
3、 多重PCR (Multiplex PCR)检测的灵敏性
从朱砂叶螨中，提取单头肠/6ac/^-CaWm'鹏双重感染的羽化5天的雌成螨总DNA，用常规的PCR检测方法分别扩增『o/Zwc/ 》和CaW/"/,的目的片段，确保其感染状态。用灭菌水对 该DNA进行稀释，稀释倍数依次为2， 5， 10， 25， 50倍。用多重PCR对原DNA模板以及稀释 后的DNA模板进行检测，并设空白对照。电泳图结果(图2A)显示，稀释50倍后，多重PCR 仍能成功地检测出CaW/m'ww和『otoac/ /a这两种共生菌。
从朱砂叶螨中，分别提取单头只感染ffo/6ac/w'a和只感染CaW/"/MW的羽化5天的雌成螨总 DNA。用常规的PCR检测方法分别扩增『o/toc/ Vz和CaW/w、w的目的片段，确保其感染状态。 将单头只感染『o仿acA/a雌成螨DNA，单头只感染CaW/w/"m雌成螨DNA与灭菌水按以下比例 混合50:0:0; 25:1:24; 10:2:38; 5:5:40; 2:10:38; 1:25:24; 0:0:50，然后进行多重PCR检测。电 泳图结果(图2B)显示，在一种菌量较少而另一种较多时，多重PCR同样能检测出菌量较少的 那种菌，进一步说明了多重PCR检测具有较好的灵敏性。 4、用多重PCR技术检测叶螨自然种群中Cflr必/f/"/n和附，/6acA/a的感染情况
将多重PCR应用于叶螨自然种群的检测，共检测了7个种的11个地理种群，各地理种群检 测40头雌成螨(表l)。其中有三个地理种群同时感染共生菌『o仍ac/z/a和Ow^力!'ww，五个地 理种群只感染共生菌fFo/toc/n》。这些检测结果与用常规PCR分子检测得到的结果相一致。
表1用多重PCR检测的叶螨自然种群采集记录及检测结果
叶螨物种采集地点寄主采集时间感染共生菌
山西省棉花2008年7月
朱砂叶螨云南省菜豆2008年7月
7fe,ra";yc/iws "'""ato"'w"s (Boisduval)河北省棉花2008年7月
江苏省菜豆2008年7月
二斑叶螨辽宁省苹果2008年8月
refrwiyctos Mrti.cae Koch山东省苹果2008年7月
神泽叶螨 7Wra"yc/zws Aawza而/ Kishida江苏省菜豆2004年6月/
截形叶螨 7^row_yc/^ ,rwwc她s Ehara新疆自治区棉花2004年6月
土耳其斯坦叶螨
7Wra/^/iws fw/^5/aw' (Ugarov et新疆自治区菜豆2008年8月/
Nikolski)
山楂叶螨 reZrawyc/^ v/e朋e肌.s Zacher内蒙古自治区苹果2008年8月
柑橘全爪螨 Pawo，/zws (McGregor)江苏沙梨2008年8月/
{主上述叶螨物种均属于公知公用，见于中国经济昆虫志第二十三册螨目叶螨总科(北京:科学 出版社，1981)。序列表
<110> 南京农业大学
<120>检测叶螨体内共生菌的多重PCR检测方法
<130>说明书
<140> 00
<141> 2009-07-01
<160> 4
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> WSP/F236
<222> (1)..(24) <223>
<400> 1
gacagtttaa cagcattttc agga 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> WSP/R446
<222> (1)..(24) <223>
<400> 2
gtttgatttc tggagttaca teat 24
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<220〉
<221> CLO/F735<222>(1)..(23)
<223>
<400>
ctcgcaaggg tgaaactcaa agg<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>CLO/R1013
<222>(1)..(23)
<223>
<400>4
ccgcttacac gggcagtcta ctt
权利要求
1、对叶螨体内两种共生菌沃尔巴克氏体(Wolbachia pipientis)和Cardinium进行同时检测的方法，其特征在于1)提取叶螨总DNA挑单头雌成螨放入25μl STE缓冲液中进行碾磨，加入2μl10mg/ml蛋白酶K，37℃孵育30min后，95℃初始变性5min并使蛋白酶K失活，作为DNA模板用于PCR扩增，STE缓冲液配制100mM NaCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0；2)多重PCR扩增基于沃尔巴克氏体(Wolbachia pipientis)的wsp基因序列和Cardinium的16S rDNA基因序列分别设计特异性引物WSP/F236&R446，CLO/F735&R1013WSP/F2365′-GACAGTTTAACAGCATTTTCAGGA-3′WSP/R4465′-GTTTGATTTCTGGAGTTACATCAT-3′CLO/F7355′-CTCGCAAGGGTGAAACTCAAAGG-3′CLO/R1013 5′-CCGCTTACACGGGCAGTCTACTT-3′以提取的叶螨总DNA作为DNA模板，多重PCR反应体系及扩增条件如下反应体系ddH2O 14.8μL10×Buffer2.5μLMg2Cl 25mM1.5μLDNTP 2.5mM2μLPrimers WSP/F236&R446 10μM 0.5μL×2Primers CLO/F735&R1013 10μM 0.5μL×2Taq DNA聚合酶5U/μm 0.2μLDNA模板 2.0μL总体积25μL扩增条件预变性94℃，2min；35个循环变性94℃，30s，退火55℃，45s，延伸72℃，45s；延伸72℃，5min；3)琼脂糖凝胶电泳检测取PCR反应产物5μl，在质量体积比2.0％的琼脂糖凝胶上100V电压电泳检测，最后在GelDocEQ凝胶成像系统下观察，如果能扩增出211bp目的片段表示该叶螨感染了共生菌Wolbachia；如果能扩增出279bp目的片段表示该叶螨感染了共生菌Cardinium。
全文摘要
本发明同时检测叶螨体内两种共生菌Wolbachia和Cardinium的多重PCR方法，属于农业生物技术范畴。多重PCR是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。本发明根据Wolbachia wsp基因序列和Cardinium 16S rDNA基因序列设计了两对新的特异性引物，可扩增出两段不同大小的目的片段，分别为211bp和279bp。本发明所述多重PCR检测方法具有高度特异性、敏感性、可行性和有效性，即节约检测成本，又节省模板。用多重PCR检测技术同时检测共生菌Wolbachia和Cardinium可广泛用于叶螨中这两种共生菌的检测。
文档编号C12Q1/68GK101603081SQ20091003201
公开日2009年12月16日 申请日期2009年7月7日 优先权日2009年7月7日 公开号200910032015.发明者洪晓月, 谢蓉蓉, 陈小琳 申请人:南京农业大学 被以下专利引用 (1),