从外周血中产生肿瘤反应性t细胞富集群的方法
【专利说明】从外周血中产生肿瘤反应性T细胞富集群的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求2013年3月1日提交的美国临时专利申请第61/771,251号的权 益，将其通过引用的方式整体并入本文。 阳00引发明背景
[0004] 使用肿瘤反应性T细胞的过继性细胞疗法（ACT)在一些癌症患者中产生了积极的 临床反应。然而，在将ACT成功地用于癌症或其它疾病的治疗中仍然存在一些障碍。例如， 从外周血中分离到的T细胞可能表现不出足够的肿瘤特异的反应性。因此，需要从外周血 中获得肿瘤反应性T细胞群的改进方法。 阳00引发明概述
[0006] 本发明的实施方案提供了获得富集肿瘤反应性T细胞的细胞群的方法，所述方法 包括：(a)从外周血样本中获得外周血单个核细胞（PBMCs)的混合群；化）从混合群中特异 地选择还表达PD-1和/或TIM-3的CD8+T细胞；和（C)将化）中选择的细胞与未被选择的 细胞分离，W获得富集肿瘤反应性T细胞的细胞群。
[0007] 本发明另一实施方案提供了向哺乳动物施用富集肿瘤反应性T细胞的细胞群的 方法，所述方法包括：(a)从外周血样本中获得PBMCs的混合群；化）从混合群中特异地选 择还表达PD-1和/或TIM-3的CD8+T细胞；（C)将化）中选择的细胞与未被选择的细胞分 离，W获得富集肿瘤反应性T细胞的细胞群；和（d)向哺乳动物施用所述富集肿瘤反应性T 细胞的细胞群。
[0008] 本发明另一实施方案提供了获得包含富集肿瘤反应性T细胞的细胞群的药物组 合物的方法，所述方法包括：(a)从外周血样本中获得PBMCs的混合群；化）从混合群中特 异地选择还表达PD-1和/或TIM-3的CD8+T细胞；（C)将化）中选择的细胞与未被选择的 细胞分离，W获得富集肿瘤反应性T细胞的细胞群；和（d)将所述富集肿瘤反应性T细胞的 细胞群与药学上可接受的载体组合，W获得包含富集肿瘤反应性T细胞的细胞群的药物组 合物。
[0009] 本发明另外的实施方案提供了相关的细胞群W及治疗或预防癌症的方法。
[0010] 附图中几个视图的简要描述 W11]图1A-1B是显示与自体肿瘤细胞系共培养的细胞的干扰素（IFN)-丫的分泌（pg/ml)(黑色柱）W及表达4-1BB的CD8+细胞的百分比（灰色柱）的图，所述细胞从黑素瘤患 者1913(A)或黑素瘤患者3713度）的外周血中分离，并通过巧光激活细胞分选术（FAC巧基 于CD8、PD-1或TIM-3的表达或者PD-1或TIM-3的不表达进行分选，且在体外进行了扩增。 阳01引图1C是显示与自体肿瘤共培养的细胞的IFN-丫的分泌（pg/mU(黑色柱）化及 表达4-1BB的CD8+细胞（的百分比（灰色柱）的图，所述细胞从黑素瘤患者3289的外周 血中分离，并通过FACS基于CD8、PD-l、LAG-3或TIM-3的表达或者PD-1或TIM-3的不表达 进行了分选。
[0013]图2A-2C是显示效应细胞对目标自体肿瘤细胞系TC1913(A)、同种异体（Alio.)肿瘤细胞系TC3289度）或匹配HLA-A0201的肿瘤细胞系TC2448(C)特异性溶解的百分比的 图，所述效应细胞从患者1913的外周血中分离得到，并基于下述表达进行分选：CD8+(空屯、 圆）、PD-r(黑色圆）、PD-1 (灰色圆）、TIM-3+(黑色菱形）或TIM-3 (灰色菱形），且将其 在体外进行了扩增。
[0014]图2D-2F是显示效应细胞对目标自体肿瘤细胞系TC3289值）、同种异体肿瘤细胞 系TC1913巧）或同种异体肿瘤细胞系TC624(巧特异性溶解的百分比的图，所述效应细胞从 患者3289的外周血中分离得到值-F)，并基于下述表达进行分选：CD8+(空屯、圆）、PD-r(黑 色圆）、PD-1 (灰色圆）、TIM-3+(黑色菱形）或TIM-3 (灰色菱形）。显示了体外扩增之后 祀细胞的溶解。 阳〇1引发明详述
[0016] 已经发现选择还表达程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1 ;CD279)和/或T细胞免疫球蛋 白W及粘蛋白结构域3(TIM-3)生物标志物的CD8+细胞富集存在于外周血中的肿瘤反应性 T细胞。与不表达PD-1和/或TIM-3的CD8+细胞相比，选择的还表达运些标志物的CD8 +细 胞有利地富集更多数量的肿瘤反应性T细胞。
[0017] 在运方面，本发明的实施方案提供了获得富集肿瘤反应性T细胞的细胞群的方 法，所述方法包括：(a)从外周血样本中获得外周血单个核细胞（(PBMCs)的混合群；化）从 混合群中特异地选择还表达PD-1和/或TIM-3的CD8+T细胞；和（C)将化）中选择的细胞 与未被选择的细胞分离W获得富集肿瘤反应性T细胞的细胞群。本发明方法有利地使缩短 体外培养时间W及在不必进行自体肿瘤识别筛选的情况下选择肿瘤反应性T细胞成为可 能。
[0018] 方法可W包括通过本领域已知的任何合适的方法，从外周血样本中获得PBMCs的 混合群。获得PBMCs混合群的合适的方法可包括，但不限于抽血和/或白细胞分离术。从 肿瘤样本中获得的PBMCs混合群可包含T细胞，包括肿瘤反应性T细胞。
[0019] 可从任何哺乳动物中获得外周血。除非另有说明，本文使用的术语"哺乳动物"指 任何哺乳动物，其包括，但不限于：兔形目的哺乳动物，如兔；食肉目的哺乳动物，包括猫科 动物（猫）和犬科动物（狗）；偶蹄目的哺乳动物，包括牛科动物（（牛）和猪科动物（（猪）； 或者奇蹄目的哺乳动物，包括马科动物（（马）。哺乳动物优选非人类的灵长类，例如灵长 目、猿（Ceboids)目或猴（Simoids)目（猴），或者优选类人猿亚目（人和类人猿）。在一 些实施方案中，哺乳动物可W是晒齿目的哺乳动物，如小鼠和仓鼠。优选地，哺乳动物为非 人类的灵长类或者人类。特别优选的哺乳动物是人。
[0020] 方法可W包括从混合群中特异地选择还表达PD-1和/或TIM-3的CD8+T细胞。 在优选实施方案中，该方法包括选择还表达CD3的细胞。该方法可W包括W任何合适的方 式特异地选择细胞。优选地，用流式细胞术来选择。可使用本领域已知的任何合适的方法 来实施流式细胞术。流式细胞术可W使用任何合适的抗体和染色剂。例如，可分别使用抗 CD3、抗CD8、抗TIM-3、或抗PD-1的抗体来特异地选择CD3、CD8、TIM-3或PD-1。优选地，选 择抗体，W使其特异地识别被选择的特定生物标志物并与之结合。可将一种或多种抗体与 珠（例如磁珠）或者巧光染料结合。优选地，流式细胞术为巧光激活细胞分选术（FACS)。
[0021] 在本发明的实施方案中，特异地选择可W包括特异地选择对于表达TIM-3和PD-1 之一或者TIM-3和PD-1两者为阳性的CD8+T细胞。在运方面，特异地选择可W包括特异地 选择表达TIM-3或PD-1的单阳性T细胞或者同时共表达TIM-3和PD-1的双阳性T细胞。 在本发明的实施方案中，方法包括从混合群中特异地选择表达TIM-3的CD8+T细胞。在本 发明的另一个实施方案中，方法包括从混合群中特异地选择表达PD-1的CD8+T细胞。本发 明另一个实施方案包括从混合群中特异地选择为（i)TIM-37PD-r、（ii)TIM-3 /PD-r，或 (iii)TIM-37PD-l的CD8叮细胞。在本发明另一个实施方案中，本文描述的任何方法还可W包括选择还表达CD3+的细胞。
[0022] 在本发明的实施方案中，特异地选择可包括特异地选择表达本文所述的任何标志 物的CD8+细胞的组合。在运方面，本发明方法可产生富集肿瘤反应性细胞的细胞群，所述 细胞群包含表达本文所述的生物标志物中的任何两种的细胞的混合物。在本发明的实施方 案中，特异地选择包括特异地选择PD-r细胞和TIM-3 +细胞的组合。在本发明另一实施方 案中，本文所述的任何方法还可W包括选择还表达CD8+和/或CD3 +的细胞。
[0023] 本发明方法可W包括将选择的细胞与未被选择的细胞分离，W获得富集肿瘤反应 性T细胞的细胞群。在运方面，可将选择的细胞与未被选择的细胞物理分离。可通过任何 合适的方法将选择的细胞与未被选择的细胞分离