外周血中分离富集造血干细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属干细胞技术领域，具体涉及一种外周血中分离富集造血干细胞的方法， 具体说也属于生物技术领域，尤其涉及一种非骨髓动员的外周血中分离富集造血干细胞的 方法。
【背景技术】
[0002] 目前，大多数生物学家和医学家认为，干细胞是来自于胚胎、胎儿或成体内具有在 一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己 完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细 胞。
[0003] 造血干细胞（hematopoieticstemcell,HSC)是具有高度自我更新能力和多向 分化潜能的造血前体细胞，也是发现最早、研究最多的一种成体干细胞，是体内各种血细 胞的惟一来源。哺乳动物造血包含原始造血（primitivehematopoiesis)和永久造血 (definitivehematopoiesis)，而永久造血是由多能的HSC维持的。HSC是具有高度自我更 新能力和多向分化潜能的造血前体细胞，可形成血液各系的血细胞，并可重建致死量照射 破坏的造血系统，HSC除可以分化为各系血细胞外，还可以分化为多种非造血组织的细胞， 如神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝脏细胞、血管内皮细胞以及多种组织的上皮细胞等。
[0004] 造血干细胞在细胞大小上类似于小淋巴细胞，细胞密度一般小于1.066g/ml。因 此，至今仍不能单纯从形态学上来识别造血干细胞。而要对HSC进行研究，首先必须能把 它从造血组织中分离出来。最常用的方法就是利用HSC表面的标志蛋白对其进行分离。 目前人的HSC表面标志包括CD34+、CD38-、Lin-、Thy-1+、Sca-1+、HLA-DR+、LFA-1+、 ⑶45RA-、⑶71 -、Rhodu11等。⑶34分子是一种跨膜的唾液黏蛋白，相对分子质量为115KD， 其编码基因位于第1号染色体长臂，基因长约26-28kb，含8个外显子，表达在造血干细胞、 一部分造血祖细胞、小血管内皮细胞及胚胎成纤维细胞表面，通过筛选CD34+细胞至少可 以使HSC得到富集，随着HSC的分化成熟，CD34表达水平逐渐下降，成熟血细胞（Lin+)不 表达⑶34。因而⑶34+为人们普遍认同的造血干细胞及造血祖母细胞的代表性表面标志， 因此本发明及使用富集CD34+细胞进行体外分离HSC。
[0005]目前HSC提取的主要三种来源为骨髓、动员的外周血和脐带血。成年人的HSC主 要存在于骨髓，约占骨髓细胞的〇. 05%，但采用骨髓来源的HSC需要骨髓穿刺会给病人造 成极大的创伤，使其承受极大痛苦，且恢复时间较长；从动员的外周血中提取则需要动员， 目前动员剂按动员机制可分为造血生长因子G-CSF、化疗药物和聚阴离子化合物3类，使用 动员剂都会有相关的毒副作用如造血生长因子近期最常见的副反应为骨痛、发热、疲乏、头 痛、失眠、食欲减退、恶心呕吐、白细胞过多等而且正常供者使用G-CSF是否增加患白血病 和其他恶性肿瘤的危险性，目前尚不清楚；而脐带则属于控制品，获得材料需要一些控制。 因此三种常规来源都有一些局限性。
[0006] 也就是说，此三种方式，骨髓取材会造成创伤，病人需要承受极大痛苦；从动员的 外周血中提取，既需要使用动员剂，会存在相关的副作用；脐带血来源存在一些方面控制。 因此取材方面三种都存在一定缺陷。而且，非动员的外周血中造血干细胞的含量少，因而从 非动员的外周血中提取造血干细胞的数量、纯度不高，不利于后期体外扩增培养。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的提供一种外周血中分离富集造血干细胞的方法，以克服现有技术的 不足。二价DNA疫苗技术来源于普通DNA疫苗，其原理是将针对对虾白斑病毒两个重要膜 蛋白功能区域蛋白基因克隆于同一真核表达载体中，从而实现针对同一个病原的两个不同 抗原蛋白的表达。将这种二价DNA疫苗导入所要免疫的动物体内，免疫效果优于普通DNA 疫苗及两种DNA疫苗的联合免疫，且更加安全、方便、有效。本发明将WSSV的VP28、VP19基 因串联克隆为融合基因，克隆至Pvaxl.O真核表达载体，制备多价基因DNA疫苗，可有效的 提高DNA疫苗的保护效果，为对虾抗WSSV的DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。
[0008] 为了克服现有技术中的不足，本发明提供了一种外周血中分离富集造血干细胞的 方法的处理方案，具体如下：
[0009] -种外周血中分离富集造血干细胞的方法，步骤如下：
[0010] 步骤1:自体血浆的制备阶段，具体如下：
[0011] (1-1)抽取病人80ml血液，至抗凝管中；
[0012] (1-2)将抗凝血1800r/m离心lOmin，血液分层，吸上层澄清液体即自体血衆，于 56°C水浴灭活30min后，2500r/m离心10min，去除沉淀，放置于2-8°C条件下保存1-7天；
[0013] 步骤2:羟乙基淀粉（HES)去红细胞阶段，具体如下：
[0014] 将离心吸取血浆后剩余的下层血细胞部分，与羟乙基淀粉溶液按1:5的体积比例 完全混匀，使得羟乙基淀粉质量百分比的终浓度为：1.2%，然后60Xg离心lOmin，取上清 液备用；
[0015] 步骤3 :单个核细胞的制备，具体如下：
[0016] (3-1)将步骤2中备用的上清，用含胎牛血清、不含Ca2+和Mg2+离子、ρΗ7· 2的磷 酸盐缓冲液（DPBs)按1:2的体积比例稀释并混匀备用；
[0017] (3-2)吸取20mlFicoll液，加入50ml离心管底部，并使得管壁上不要残留Ficoll 液；
[0018] (3-3)将（3-1)中稀释好的上清液缓慢铺平于Ficoll液面上，Ficoll液于上清 液的体积比例为1:1. 25,平衡后800Xg离心20min;(3-4)吸取白细胞层，用磷酸盐缓冲液 (DPBs)稀释悬浮1600r/m离心5min后去上清；
[0019] (3-5)用磷酸盐缓冲液（DPBs)悬浮离心后的细胞沉淀1600r/m离心5min洗涤一 次；
[0020] (3-6)用含质量百分比为5%的胎牛血清的RPMI1640培养基洗涤一次，方式同步 骤（3-5)，去上清收集细胞并计数；
[0021] 步骤4 :单个核细胞（MNC)体外富集培养阶段，具体如下：
[0022] (4-1)配置造血干细胞培养体系，由此而得造血干细胞培养基：
[0023](4-2)用造血干细胞培养基调整细胞浓度为5X106/ml，接种于75cm2的细胞培养 瓶中置于37°C、5%C02培养箱孵育120min;
[0024] (4-3)收集培养瓶中的非贴壁的细胞悬液，转移至另一 75cm2的培养瓶中置于 37°C、5%C02培养箱培养，即可去除贴壁的细胞。
[0025] (4-4)采取1/2换液法，每3天用PBS清洗一次细胞并更换一次培养基；
[0026] (4-5)富集培养7天后，计数并检测⑶34+阳性率；
[0027] 步骤5:⑶34+造血干细胞的获得阶段，具体如下：
[0028] (5-1)培养7天后，对步骤4中的单个核细胞计数，并1400r/m离心5min收集单个 核细胞；
[0029] (5-2)用不含Ca2+和Mg2+离子、ρΗ7· 2的磷酸盐缓冲液（DPBs)清洗一遍，1400r/ m离心5min，弃上清；
[0030] (5-3)计算细胞浓度，按每1X10s个细胞用300μLBuffer液的比例重悬细胞，不 足1X10s个细胞按1X108个计算；
[0031] (5-4) (5-3)中体系每1X10s个细胞加入100μLFCR阻断剂抑制非特异性或FC 受体介导的结合⑶34震荡15s混匀；
[0032] (5-5) (5-4)中体系加入100μL抗CD34磁珠，震荡15s混匀，并置于4°C冰箱孵育 30min；
[0033] (5-6) (5-5)中体系加入5mLBuffer液吹打混匀，并300Xg离心llmin后弃上清， 用500μLBuffer液重悬单个核细胞；
[0034] (5-7)选择MS+吸附柱置于磁场中，将（5-6)中重悬的单个细胞Buffer液通过磁 场中的吸附柱，未与