一种富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属细胞生物学领域，具体涉及一种富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 干细胞(StemCelIs，SC)是一类具有自我复制能力（self-renewing)的多潜能细 胞，是原始且未特化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组 织器官和人体的潜在功能。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂 成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括 胎盘、脐带、脐带血与骨髓等。
[0003] 婴儿出生后遗留在胎盘和脐带中的血是干细胞的重要来源。脐带血中的造血干细 胞可以用来治疗多种血液系统疾病和免疫系统疾病，包括血液系统恶性肿瘤(如:急性白血 病、慢性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓异常增殖综合症和淋巴瘤等）、血红蛋白病(如:海洋性 贫血）、骨髓造血功能衰竭（如：再生障碍性贫血）、先天性代谢性疾病、先天性免疫缺陷疾 患、自身免疫性疾患、某些实体肿瘤(如：小细胞肺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌和进行性肌营 养不良等）。自1988年脐血干细胞就用来治疗根达综合症、亨达综合症、和拉综合症和急性 淋巴细胞性白血病等许多儿童疾病。截至2011年，脐带血不仅已能有效地治疗几十种难治 性疾病和多种不治之症，而且它所能治疗的疾病种类还在不断地增加。自体储存的脐带血 一旦需要使用时，不需配型，细胞活性强，无免疫排斥的危险，移植成活率高，治愈率高，医 疗费用低。
[0004] 在人脐血中有一类具有干细胞特征的细胞群体，被称为人间充质干细胞(MSCs)。 人间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，在不同诱导条件下可分化为三胚层细 胞，如骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和神经细胞等。此外，还表达IL6、G-CSF和SCF等 多种造血细胞生长所需要的因子，能够维持长期培养的造血祖细胞增殖，显示MSC具有支持 造血和促进造血恢复的作用。同时研究表明MSC具有免疫调节作用，在体外能够抑制T淋巴 细胞增殖，体内动物实验发现MSCs移植可以抑制异体免疫反应，减轻移植相关的排斥反应， 并延长异体移植物的存活时间。最近的临床试验发现MSCs联合造血干细胞移植可以减轻 GVHD并降低移植失败率。MSC的多向分化能力和免疫调节能力决定了其在细胞治疗、组织工 程等领域具有广阔的应用前景。
[0005] 目前常规脐血单核细胞(富含造血干细胞)多用动物血清加白蛋白冻存，如鸡、猪、 牛等，其中胎牛血清因获取量大、污染轻而被广泛应用。但近年随着人畜共患病发病率的增 加，以异种血清培养的组织向临床应用的安全性受到质疑，因此自体血清培养越来越受到 重视。
[0006] 中国发明专利【申请号】201510159307.0公开了一种脐血单个核细胞冻存液、应用、 制备方法。本发明提供的一种脐血单个核细胞冻存液，包括二甲基亚砜(DMS0)联合勃脉力A (复方电解质注射液）、羟乙基淀粉(HES)，该方案相比传统配方，可避免动物源性病原体的 污染，同时避免采用细胞培养基作为冻存液组成成分，并保证了良好的细胞冻存效果，冻存 2个月后，用本发明冻存液冻存的CBMC复苏后细胞活率平均值为94.73%，显著(P<0.05)高 于用传统冻存液（10%DMS0+90%FBS)的冻存效果。细胞复苏后可直接进行临床移植，在细 胞治疗临床应用方面颇具实用价值。
[0007] 中国发明专利【申请号】02103676.4公开了脐血造血干细胞的制作方法，按如下步 序进行：（1)采集脐血，将出生的胎儿的脐血采到脐血采集袋内；（2)加入红细胞沉淀剂；（3) 离心分离1，将脐血采集袋中脐血中的红细胞分离；（4)移出红细胞，将红细胞输送到红细胞 收集袋内；（5)离心分离2,将白细胞包括造血干细胞与血浆再一次分离；（6)移出血浆，将被 分离的血浆输入到血浆收集袋内，脐血收集袋内剩余的脐血为含富集白细胞的脐血；（7)加 入冷冻剂，将脐血收集袋中的富集白细胞脐血中加入冷冻剂；（8)包装；（9)降温；（10)入库 保存。用本发明方法制作的造血干细胞可长期存放，以便于随时取用，大大地方便了治疗， 及时解除病人痛苦，适用于制作在脐血库中长期存放的造血干细胞。
[0008] 但目前公开的各类间充质干细胞制备方法虽均能获得脐血单核细胞（富含造血干 细胞），但都不符合临床应用的标准，本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程 进行临床级、统一、系统监控，以实现脐血单核细胞(富含造血干细胞)的临床标准产品。
【发明内容】
[0009] 针对现有技术缺陷，本发明提供一种富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制 备方法，本发明制备方法在脐带采集前对产妇进行筛选，以符合条件的健康足月产妇志愿 者作为采集目标，之后进行分离直接进行冷冻保存，对分离过程及冷冻过程的的中间品进 行一系列质量检测，冷冻后细胞复苏洗涤待用，活率无明显降低。
[0010] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0011] 本发明提供了一种富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，包括如下 步骤：
[0012] 步骤A，取适量分娩获得的脐带血，置于脐血保存袋中冷藏保存；
[0013]步骤B，脐血分离:将脐血通过两步离心法去掉绝大多数红细胞，分离出我们要的 单核细胞层，用高温灭菌过的超纯水裂解两次，去除分离出的红细胞，以及保留分离出的血 浆;采用高温消毒灭菌的超纯水去除红细胞，可以避免回输时红细胞引起的负面作用。
[0014]步骤C，脐血有核冻存:收集细胞并计数和活率，按3X10%1/管进行冷冻保存;并 将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取5X106细胞做细胞表面标志检测；
[0015] 步骤D，脐血单核细胞成分鉴定:脐血单个核细胞⑶34/CD45抗原表达及HSC-CFU培 养；
[0016]步骤E，临床用脐血单核细胞使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞会全部破碎，用生理 盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶 液混匀待用;并留样进行内毒素和细菌检测。该冻存细胞复苏后红细胞会全部破碎，可以避 免回输时红细胞引起的负面作用。
[0017]优选地，步骤A中，所述分离获得的脐带通过筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带 获得，所述筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史。所述病毒如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒 等。
[0018] 优选地，步骤A中，所述脐血保存袋只有标准量的血液抗凝剂，不含有血清培养基， 不含抗生素。可维持脐血活性长达24小时，避免了临床应用时的抗生素过敏问题。
[0019] 优选地，步骤A中，所述脐带置于脐血保存袋中4°C冷藏保存，并在24小时内进行分 离处理。
[0020] 优选地，步骤B中，所述两步离心法采用医用级别淋巴分离液。所述分离液成分明 确，符合临床级别。
[0021]优选地，步骤C中，所述冷冻处理采用的细胞冷冻保护液由90%血浆和10%的二甲 基亚砜(体积百分比）配制而成，保护细胞活性。所述血浆为自体血浆。我们采用脐血本身血 浆作为冻存防护剂，可以避免其他动物源蛋白的影响，更符合临床标准。
[0022] 优选地，步骤C中，所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测;所述支原 体检测包括用PCR法进行支原体检测。
[0023] 本发明完全没有使用外援蛋白质进行细胞处理。以及冷冻保护也用自体血浆，避 免不明动物源蛋白进入人体引起的潜在风险。
[0024] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0025] 1、全过程全面质量监控，从脐带采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及 终产品的质量全部受控。
[0026] 2、无其他动物血清蛋白质等，不使用抗生素，避免异源蛋白及抗生素可能引起的 疾病或过敏风险。
[0027] 3、剔除所有红细胞避免了回输时红细胞引起的负面作用。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0029] 实施例1
[0030] 本实施例提供一种临床用脐血单核细胞(富含造血干细胞)的制备方法，具体包括 如下步骤：
[0031] 步骤一、脐血筛选与保存:筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带(样本1)，置于脐血 保存袋中4°C冷藏，并于24小时内进行分离处理；
[0032] 步骤二、脐血分离:将脐血通过两步离心法去掉绝大多数红细胞，分离出我们要的 单核细胞层，用高温灭菌过的超纯水裂解两次，去除分离出的红细