一种基于干细胞源外泌体的组合物及其在制备治疗心肌梗死的药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种基于干细胞源外泌体的组合物及其在制备治疗心肌梗死的药物中的应用，属于生物医药
技术领域：
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背景技术：
：冠状动脉疾病是最常见的心血管疾病，心肌梗死则是其中发病率和死亡率位居首位的。目前，利用干细胞移植方法治疗心肌梗死被认为是修复受损心肌和促进心肌细胞再生最具潜力的治疗方法，但移植的干细胞在缺血缺氧环境中的存活率、有效性及相关作用机制等仍存在较大争议。干细胞旁分泌效应对心肌细胞的保护作用在近些年来逐渐受到重视。外泌体是干细胞旁分泌效应的典型代表，近年来对于其参与心血管疾病生理及病理过程的机制探索以及将基于外泌体的研究转化于临床心脏疾病的诊治已成为研究前沿中的热点。外泌体是在不同应激反应中所产生的直径在30～100nm之间的具有双层膜结构的囊性小泡，其富含大量与其母体干细胞相关的mirna、mrna及蛋白质。外泌体经细胞释放后入血，传递物质和信号至靶细胞，这种细胞间的通讯方式在许多疾病的发生发展以及损伤修复中发挥重要作用。干细胞来源的外泌体，可以利用携带的干细胞特异的mirna和蛋白分子等，刺激靶细胞向心脏保护和再生方向发生转化。目前研究发现，利用不同干细胞来源的外泌体治疗心肌梗死(myocardialinfarction，mi)后均具备能够改善心脏功能、减少梗死面积、增加新生血管数量等作用效果。外泌体对mi的治疗效果已得到广泛证实，其解决了干细胞在治疗缺血性心脏病中面临的细胞存活率低的重要问题。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，msc)是具有自我更新和多向分化能力的细胞，能够通过旁分泌途径促进细胞修复及血管生成，在再生医学领域中扮演重要角色。许多研究表明，msc外泌体在治疗组织损伤性疾病中发挥重要作用，特别是在心肌梗死治疗中表现突出。lai等人(laietal，stemcellresearch，2010)和arslan等人(arslanetal，stemcellresearch，2013)的研究发现，在小鼠心肌梗死模型中，msc外泌体可以将心肌梗死面积降低约40-50％。然而，如何进一步提高其治疗效果仍有待进一步研究。技术实现要素：为解决上述技术问题，提高msc外泌体在治疗心肌梗死中的作用，本发明的目的在于提供三叶因子3(trefoilfactor3，tff3)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)联合msc外泌体组成的组合物及其在制备治疗心肌梗死的药物中的应用。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于干细胞源外泌体的组合物，包括间充质干细胞外泌体、三叶因子3和超氧化物歧化酶，三者的质量比为20∶10-100∶2000-10000。优选地，三者的质量比为20∶10或30或100∶2000或10000。在上述组合物中，优选地，所述三叶因子3为人重组三叶因子3。在上述组合物中，优选地，所述超氧化物歧化酶为人重组超氧化物歧化酶。在上述组合物中，优选地，所述间充质干细胞外泌体、三叶因子3和超氧化物歧化酶的质量比为20∶10∶10000。在上述组合物中，优选地，该组合物还包括溶剂。在上述组合物中，优选地，所述溶剂为pbs缓冲液和/或0.9％的生理盐水。在上述组合物中，优选地，所述间充质干细胞外泌体和超氧化物歧化酶溶于pbs缓冲液中，其中，间充质干细胞外泌体的浓度优选为10μg/ml，超氧化物歧化酶浓度为1-5mg/ml；所述三叶因子3溶于浓度为0.9％的生理盐水中，其中，三叶因子3的浓度为0.5-5μg/ml。本发明还提供了一种制备上述组合物的方法，其可以通过将各种组分溶解于相应的溶剂中，然后再将其混合制备得到，其中，间充质干细胞外泌体和超氧化物歧化酶混合溶解于溶剂中形成混合制剂，三叶因子3则溶解于另一溶剂中，两部分成分单独存放。在使用时，tff3溶液的给药方式为腹腔注射，含有间充质干细胞外泌体和超氧化物歧化酶的混合制剂的给药方式为病灶局部注射给药。本发明所提供的组合物的制备方法可以包括如下具体步骤：(1)将三叶因子3溶解于浓度为0.9％的生理盐水中，浓度为0.5-5μg/ml，得到tff3溶液；(2)将间充质干细胞外泌体重悬于pbs缓冲液中，浓度为20μg/ml，得到混悬液；(3)将超氧化物歧化酶溶解于pbs缓冲液中，浓度为2-10mg/ml，得到sod溶液；(4)将等体积的混悬液与sod溶液混匀，并将混合物体积定量为混悬液的体积或sod溶液的体积的两倍，即得到所述组合物。本发明还提供了上述组合物在制备治疗心肌梗死的药物中的应用。在上述应用中，优选地，所述心肌梗死包括急性心肌梗死、无痛性心肌梗死、非st段抬高心肌梗死、右室心肌梗死和心房心肌梗死中的至少一种。在上述应用中，优选地，间充质干细胞外泌体的给药量为20μg/kg·d，三叶因子3的给药量为10μg/kg·d，超氧化物歧化酶的给药量为10mg/kg·d。在三叶因子3的给药量为10μg/kg·d时，三叶因子3本身并不具有缓解心肌梗死的作用，也没有表现出对于间充质干细胞外泌体缓解心肌梗死效果的促进作用，而且，超氧化物歧化酶并没有表现出对于间充质干细胞外泌体缓解心肌梗死效果的促进作用，但是，当三叶因子3、超氧化物歧化酶与间充质干细胞外泌体组合在一起，且将三叶因子3的给药量控制为10μg/kg·d、将超氧化物歧化酶的给药量为10mg/kg·d时，能够大大促进间充质干细胞外泌体缓解心肌梗死的效果。在上述应用中，优选地，超氧化物歧化酶的给药方式为腹腔注射，间充质干细胞外泌体和超氧化物歧化酶的给药方式为病灶局部注射给药；更优选地，上述药物可以为注射剂。本发明的有益效果在于：本发明提供的三叶因子3、超氧化物歧化酶联合msc外泌体的组合物可以有效增强msc来源的外泌体在治疗心肌梗死中的作用，进一步降低心肌梗死造成的损伤。附图说明图1为外泌体电镜观察图。图2为外泌体的特异性标志物cd81、cd63免疫印迹图。图3为tff3给药、tff3联合msc外泌体给药、sod联合外泌体给药对心肌梗死的影响柱状图。图4为tff3、sod联合外泌体给药对心机梗死的影响柱状图。图5为tff3、sod联合外泌体给药对cd68阳性细胞数量的影响柱状图。具体实施方式为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更清楚的理解，对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。实施例1人脐带来源的msc外泌体的分离鉴定(1)人脐带来源的间充质干细胞原代分离培养：获取10cm剖腹产新生儿脐带组织，采用磷酸缓冲盐溶液(pbs缓冲液)充分去除血污，其中pbs缓冲液含有5wt％青霉素-链霉素(青霉素终浓度为100u/ml，链霉素终浓度为0.01g/100ml)；将脐带洗净后，均匀剪成长度为3-4cm的小段，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶剪碎为1-3mm3的小块，加入15ml胶原酶a溶液(浓度为1mg/ml)和中性蛋白酶的混合液(浓度为1mg/ml)，其中二者体积比为1∶2，置于37℃、5％co2的培养箱中消化处理2小时；离心收集细胞和残余组织，采用含1wt％的青霉素-链霉素且无ca2+、mg2+的pbs缓冲液(青霉素终浓度100u/ml，链霉素终浓度0.01g/100ml)(购自东方华辉生物医药科技有限公司)洗去残留胶原酶a，于2000rpm离心5分钟，弃上清；加入15ml含0.02％edta的0.25wt％的胰酶溶液，于37℃、5％co2的培养箱中消化10分钟；消化处理之后，采用含1wt％青霉素-链霉素且无ca2+、mg2+的pbs缓冲液洗去残留酶，于2000rpm离心5分钟，弃上清；采用0.1wt％的明胶对培养皿进行包被，于4℃过夜；用无ca2+、mg2+的pbs缓冲液进行洗涤，去除残留明胶；用bps-sfm无血清培养基(购自东方华辉生物医药科技有限公司)重悬组织和细胞，接种于明胶铺被的培养皿中，置于37℃、5％co2的培养箱培养，待大部分组织团块周围细胞生长融合至85％时进行消化传代。(2)msc外泌体的分离和纯化：选择增殖能力强、状态好的第3-5代人脐带间充质干细胞，无血清培养48h后，收集培养上清液30ml；于2,000×g离心30min，取上清液，弃去细胞碎片等沉淀；经0.45μm无菌滤膜过滤到20ml离心管中，于4℃、1,000×g离心60min，得到含外泌体的浓缩液；将浓缩液移至加有200μl质量浓度为300g/l蔗糖的超速离心管中，于4℃、100,000×g离心60min，收集底部沉淀；将所得沉淀采用pbs重悬，再次100,000×g离心60min，收集底部沉淀，即为msc外泌体；将所得外泌体用pbs重悬，采用0.22μm滤膜过滤除菌，并于-80℃储存。(3)msc外泌体的鉴定：①外泌体的形态学观察：将实施例1中所得到的外泌体溶液充分混匀，经脱水、干燥、粘样、导电处理，在扫描电镜下观察微粒形态，并拍摄电镜照片。结果如图1所示，所获得的msc外泌体直径约为50-100nm，符合外泌体特征。②外泌体标志物检查：采用蛋白免疫印迹法检测外泌体的特异表达蛋白cd81、cd63。采用ripa裂解液(购自碧云天生物技术有限公司)对msc和msc外泌体进行蛋白裂解30min，采用匀浆器(型号ikat10)进行蛋白匀浆(15s×3次)；静置30min后，将上述匀浆液于4℃、12,000g离心15分钟；采用bca试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)进行蛋白定量，将总蛋白浓度调至同一水平；加入5×上样缓冲液(16％甘油、20％-巯基乙醇、2％十二烷基磺酸钠、0.05％溴酚蓝)，煮沸5min。将上述溶液上样，于浓80v电压经缩胶电泳约30min，于120v电压经分离胶电泳约60min；经电转移(250ma，2h)将蛋白质转移到pvdf膜(购自millipore)，采用封闭液(含5％bsa的tbst溶液)于室温封闭1h；将上述pvdf膜分别与兔抗人cd81抗体、cd63抗体(购自abcam)于4℃孵育过夜后，采用tbst洗膜3次，每次10分钟；之后与辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗兔igg二抗于室温孵育1h后，采用tbst洗膜3次，每次10分钟；加入ecl化学发光底物(购自abcam)，采用化学发光凝胶成像系统(bio-rad)进行检测并拍照。实验结果如图2所示。msc外泌体组cd81和cd63显著高于msc组(p＜0.01)，说明msc外泌体高表达外泌体特异性蛋白cd81和cd63。实施例2三叶因子3、超氧化物歧化酶、外泌体的组合物本实施例提供了一种基于外泌体的组合物，其包括三叶因子3、超氧化物歧化酶、外泌体，其中：三叶因子3为人重组三叶因子3(rhtff3)，购自prospec-tany公司；超氧化物歧化酶为人重组超氧化物歧化酶(rhsod)，购自prospec-tany公司；间充质干细胞外泌体(msc-exo)如实施例1所制备。其中，rhtff3的溶剂为0.9％生理盐水；给药方式为腹腔注射，给药一次；给药剂量分别为10μg/kg，30μg/kg，100μg/kg，对应的浓度分别为0.5μg/ml，1.5μg/ml，5μg/ml。其中，rhsod的溶剂为pbs缓冲液；给药方式为心肌梗死模型结扎位点附近的两个位点注射；给药剂量分别为2mg/kg，10mg/kg，对应的浓度分别为1mg/ml，5mg/ml。其中，msc-exo的溶剂为pbs缓冲液；给药方式为心肌梗死模型结扎位点附近的两个位点注射，给药剂量为20μg/kg，浓度为10μg/ml。其中，当rhsod与msc-exo同时给药时，其作为组合使用，具体为：将rhsod溶于pbs缓冲液中，并使其浓度为终浓度的两倍；将msc-exo重悬于pbs缓冲液中，并使其浓度为终浓度的两倍；之后将上述rhsod的pbs溶液与msc-exo的pbs重悬液混匀，并将终体积定量为单一溶液体积的两倍，使rhsod的终浓度为1mg/ml或5mg/ml，msc-exo的终浓度为10μg/ml。实施例3三叶因子3、超氧化物歧化酶联合msc外泌体在制备治疗心肌梗死的药物中的应用(1)小鼠心肌梗死模型建立：动物为c57bl/6小鼠，8-12周龄。异氟烷进行诱导麻醉后，将小鼠固定在加热毯上，纵行切开颈部皮肤、肌肉，暴露气管，进行气管插管，调整呼吸机频率为100次/分，潮气量为20ml。于小鼠第四肋间横行切开皮肤、肌肉，暴露肋骨，剪开肋间肌，撑开器暴露心脏。撕开心包膜，使用手术线于左心耳下放2-3mm结扎冠状动脉，见心脏颜色变白，表明小鼠心肌梗死模型建立成功。按照上述方法结扎后，msc-exo或sod与msc-exo组合物的给药方式为在结扎位点附近的左下、右下两个位点注射；之后关胸，消毒切口。(2)tff3对小鼠心肌梗死模型的作用于心肌梗死手术后，关胸，消毒切口，将小鼠随机分为a1、a2、a3、a4共4组，每组6只；立即腹腔注射rhtff3溶液。具体分组及给药剂量请见表1。表1tff3对小鼠心肌梗死模型的作用分组tff3剂量缺血面积标准差a1049％5％a210μg/kg47％5％a330μg/kg37％7％a4100μg/kg36％8％采用四唑氮蓝(ttc)染色方法，观察治疗效果。于手术后第7天无痛处死小鼠，取左心室组织横向切成约1mm切片，于37℃将切片在1％ttc-pbs中孵育30min，采用4％的甲醛-pbs固定15min，并拍照分析心肌梗死面积。实验结果如表1和图3(tff3)所示。a2组与a1组没有显著差异，表明10μg/kg剂量tff3给药不足以缓解心肌梗死程度；a3、a4组与a1组相比，心肌缺血面积显著降低，表明30μg/kg、100μg/kg剂量tff3均能在一定程度上缓解心肌梗死程度。表明tff3有缓解心肌梗死的作用，但是在10μg/kg的剂量下并没有该作用。(3)tff3联合msc-exo对小鼠心肌梗死模型的作用于心肌梗死手术结扎后，将小鼠随机分为b1、b2、b3、b4、b5共5组，每组6只；每组动物在结扎位点附近的左下、右下两个位点注射20μg/kg体重的msc-exo，之后关胸，消毒切口；立即腹腔注射rhtff3溶液。具体分组及给药剂量请见表2。表2tff3联合msc-exo对小鼠心肌梗死模型的作用分组tff3剂量msc-exo剂量缺血面积标准差b10051％6％b2020μg/kg30％7％b310μg/kg20μg/kg27％8％b430μg/kg20μg/kg25％7％b5100μg/kg20μg/kg26％9％采用四唑氮蓝(ttc)染色方法，观察治疗效果，方法与上述相同。实验结果如表2和图3(tff3+exo)所示。与b1组相比，b2组动物的心肌缺血面积显著降低(p＜0.05)，表明20μg/kg剂量的外泌体可以有效缓解心肌梗死程度；与b1组相比，b3(p＜0.05)、b4(p＜0.01)、b5(p＜0.05)组动物心肌缺血面积显著降低，表明10μg/kg、30μg/kg、100μg/kg剂量的tff3与20μg/kg剂量的外泌体联合使用，均可以有效缓解心肌梗死程度，其中30μg/kg剂量tff3与20μg/kg剂量的外泌体联合使用效果有一定的提升；然而，b3、b4、b5组动物与b2组没有显著差异，表明10μg/kg、30μg/kg、100μg/kg剂量的tff3与20μg/kg剂量的外泌体联合使用，与20μg/kg剂量的外泌体单独使用的效果无差异，未产生显著的促进作用。表明tff3联合msc-exo对心机梗死的缓解作用效果与msc-exo单独使用效果相似，tff3对msc-exo的相关作用效果并没有表现出显著的促进作用。(4)sod联合msc-exo对小鼠心肌梗死模型的作用于心肌梗死手术结扎后，将小鼠随机分为c1、c2、c3、c4共4组，每组6只；每组动物在结扎位点附近的左下、右下两个位点注射sod与msc-exo的组合物，之后关胸，消毒切口。具体分组及给药剂量请见表3。表3sod联合msc-exo对小鼠心肌梗死模型的作用分组sod剂量msc-exo剂量缺血面积标准差c10050％6％c2020μg/kg31％7％c32mg/kg20μg/kg28％7％c410mg/kg20μg/kg29％9％采用四唑氮蓝(ttc)染色方法，观察治疗效果，方法与上述相同。实验结果如表3和图3(sod+exo)所示。与c1组相比，c2组动物的心肌缺血面积显著降低(p＜0.05)，表明20μg/kg剂量的外泌体可以有效缓解心肌梗死程度；与c1组相比，c3、c4组动物心肌缺血面积显著降低(p＜0.05)，表明2mg/kg、10mg/kg剂量的sod与20μg/kg剂量的外泌体联合使用，均可以有效缓解心肌梗死程度；然而，c3、c4组动物与c2组没有显著差异，表明2mg/kg、10mg/kg剂量的sod与20μg/kg剂量的外泌体联合使用，与20μg/kg剂量的外泌体单独使用的效果无差异，未产生显著的促进作用。表明sod联合msc-exo对心机梗死的缓解作用效果与msc-exo单独使用效果相似，sod对msc-exo的相关作用效果并没有表现出显著的促进作用。(5)tff3、sod联合msc-exo对小鼠心肌梗死模型的作用于心肌梗死手术结扎后，将小鼠随机分为d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7、d8共8组，每组6只；每组动物在结扎位点附近的左下、右下两个位点注射sod与msc-exo的组合物，之后关胸，消毒切口；立即腹腔注射rhtff3溶液。具体分组及给药剂量请见表4。表4tff3、sod联合msc-exo对小鼠心肌梗死模型的作用采用四唑氮蓝(ttc)染色方法，观察治疗效果，方法与上述相同。实验结果如表4和图4所示。与d1组相比，d2组动物的心肌缺血面积显著降低(p＜0.05)，表明20μg/kg剂量的外泌体可以有效缓解心肌梗死程度；与d1组相比，d3、d4(p＜0.001)、d5(p＜0.01)、d6、d7、d8组动物心肌缺血面积显著降低(d3、d6-8组p＜0.05)，表明tff3、sod不同剂量与外泌体联合使用，均可以有效缓解心肌梗死程度；但d3、d5-8组的作用与msc-exo单独使用效果类似。尤其令人惊喜的是，d4组心肌缺血面积降低尤其明显，且与d1组相比亦显著降低，表明10μg/kgtff3、10mg/kgsod联合20μg/kgmsc外泌体的应用产生了对心肌梗死尤其显著的缓解效果，该效果优于外泌体单独给药，优于tff3与外泌体联合应用，且优于sod与外泌体联合应用。表明tff3、sod联合msc-exo可以对心机梗死产生尤其有效的缓解效果。实施例4tff3、sod联合msc-exo对msc-exo作用下过的促进机制研究表明，msc外泌体可以降低心肌梗死动物心脏的炎症水平，其可以用cd68阳性细胞的数量来表示，即外泌体作用效果越强，则cd68阳性细胞数量越低，心脏炎症水平越低(arslanetal.，stemcellresearch2013)。本实施例中，将实施例3中实验(5)的小鼠处死后，采用免疫荧光法检测小鼠心脏中cd68阳性细胞数量的改变。将小鼠心脏采用20％蔗糖溶液脱水4h，随后采用oct包埋并置于-80℃冰冻；将上述冰冻组织切成5μm切片，随后采用兔抗小鼠抗cd68抗体(abcam)于4℃孵育过夜；随后采用荧光标记的抗兔igg(abcam)于37℃孵育1h，于电镜下观察小鼠心脏cd68阳性细胞并分析。实验结果如图5所示。与d1组相比，d2组动物的cd68+细胞倍数显著降低(p＜0.05)，表明20μg/kg剂量的外泌体可以有效降低心脏炎症；与d1组相比，d3、d4(p＜0.01)、d5、d6、d7、d8组动物cd68+细胞倍数显著降低(d3、d5-8组p＜0.05)，表明tff3、sod不同剂量与外泌体联合使用，均可以有效缓解心脏炎症，但d3、d5-8组的作用与msc-exo单独使用效果类似。尤其令人惊喜的是，d4组cd68+细胞倍数降低尤其明显，且与d1组相比亦显著降低(p＜0.05)，表明10μg/kgtff3、10mg/kgsod联合20μg/kgmsc外泌体的应用对外泌体的作用产生了尤其显著促进作用。表明tff3、sod联合msc-exo可以对心机梗死产生尤其有效的缓解效果。以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，在本发明的构想范围内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12