本发明属于生物技术领域，具体涉及一种法氏囊素脂质体的制备方法。
背景技术：
法氏囊(bursaoffabricus，bf)是禽类独有的中枢体液免疫器官，相当于哺乳动物的骨髓。bf中存在许多生物活性物质，尤其是一些具有免疫调节作用的小肽，能促进禽类及哺乳动物淋巴细胞的分化发育及免疫器官的成熟，一般将这一类小分子生物活性肽称为法氏囊素(bursin,bs)。近年来人们对bs的生物学功能及其作用机制进行了广泛的研究。现已证实，bs大多具有免疫调节功能，如囊素三肽，氨基酸组成顺序是lys-his-gly-nh2，其中lys：his：gly：nh2为1：0.9：1：0.8，可诱导哺乳动物和禽类b细胞的分化，还能提高人的daudib细胞中camp、cgmp的浓度，并认为该物质在禽类和哺乳动物均有相似的生物活性。
法氏囊素作为一种最初从禽类法氏囊中提取出的物质并没有种属的限制性，在多种动物及疾病的研究中不仅证明了它具有提高机体增重和饲料转化率等效果，还能增强机体的免疫调节水平，具有良好的免疫学活性。因此，将bs作为免疫增强剂用作各种动物疫苗佐剂、饲料添加剂或辅助治疗剂等将会大大提高疫苗效果，增强动物的免疫力，保证动物的健康生长，促进养殖业的发展，提高经济效益。
在以往的研究过程中，多数直接采用法氏囊粗提物作为研究法氏囊活性肽的材料，由于这种粗提物中含有大量非特异的大分子蛋白质等组织成分，给动物机体注射可能会引起不良反应，甚至发生过敏而死亡，干扰或掩盖了法氏囊素的作用，得不到一个可靠的实验结果。此外，从法氏囊中提取的法氏囊素，如果直接投入使用，存在法氏囊素不稳定，操作不便等缺点。因此要想进一步研究法氏囊素的生物学活性及其应用，需要改进生产工艺，建立一套正确的制备方法，既保证其生物学活性又有一定的浓度和纯度。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可以提高法氏囊素稳定性的法氏囊素脂质体的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种法氏囊素脂质体的制备方法，包括以下步骤：
1)将磷脂与胆固醇按照质量比1∶3-5混合均匀，得到脂质混合物；
2）在惰性气体环境中，将上述脂质混合物溶解于乙醚中，然后加入待包封的法氏囊素水相，得到水-有机溶剂两相体系，并使体系始终处于惰性气体环境中；
3）将上述两相体系置于水浴式超声仪中进行超声反应，直至体系中的混合物变为澄清的单相分散体或有乳光的均匀分散体为止；
4）超声结束后，将体系中的混合物置于旋转蒸发仪中，减压旋转蒸发除去混合物中的残留的乙醚；
5）收集上述旋转蒸发后得到的混合物，离心，收集固相，得到法氏囊素脂质体。
所述步骤1），磷脂与胆固醇的质量比为1∶4。
所述步骤2），法氏囊素水相的浓度为1mg/ml。
所述步骤3），超声功率为100-150w，超声时间为10-60min，超声温度为10℃以下。
所述步骤4），旋转蒸发的转速为150-250r/min。
所述步骤4）的旋转蒸发过程，先维持旋转蒸发瓶内的压强为500~700mmhg，旋转蒸发25-35min除去混合物中的大部分残留乙醚，然后将旋转蒸发瓶内压强降低至400~600mmhg，旋转蒸发15-20min除去混合物中痕量的乙醚。
所述步骤5），离心条件为：2~8℃条件下，20000-25000g离心25-35min。
进一步，所述步骤2），法氏囊素的制备方法如下：
1）取新鲜鸡法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗干净后，按法氏囊与注射用水的重量比为1∶1-3混合均匀，然后采用组织捣碎机依次按照转速16000-17000r/min、18000-19000r/min、21000-22000r/min进行捣碎，捣碎后的法氏囊经胶体磨匀浆后得到匀浆液，并于-20℃以下冻存；
2）取出冻存的匀浆液反复冻融4-6次；
3）将冻融结束的匀浆液于2~8℃以下，6000-8000r/min离心15-25min，取上清液；
4）在上清液中加入终浓度为0.01-0.02%β-丙内酯，于2-8℃下搅拌16-32h进行灭活；
5）将灭活后的溶液于35-39℃水解2-3h；
6）将水解后的溶液用0.22-0.45μm滤膜进行切向流微滤，收集微滤透过液并采用1-5kd滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液；
7）调节超滤透过液的渗透压使之成为等渗溶液；
8）将上述等渗溶液用0.1-0.22μm除菌过滤器除菌，收集的液体即为法氏囊素。
本发明采用以上技术方案，将法氏囊素包封于脂质混合物中，得到法氏囊素脂质体，用于机体不仅增强了法氏囊素的稳定性，使其在机体中维持时间更长，而且容易与细胞发生吸附、融合、脂交换而被细胞内吞，直接进入细胞内，提高了治疗指数及生物利用度，且当法氏囊素脂质体与灭活疫苗联合使用时，灭活疫苗更容易溶解于法氏囊素脂质体中，操作更加方便。
本发明法氏囊素制备过程，步骤1）按法氏囊与注射用水的重量比为1∶1-3进行匀浆，使环境处于低渗状态，细胞更容易破裂，更彻底释放法氏囊素，增加了法氏囊的利用率。步骤4），冻融结束得到的法氏囊上清液采用β-丙内酯进行病毒灭活，保证提取液安全无毒。步骤6），运用超滤系统进行1-5kd超滤，不仅能够去除大量非特异的大分子蛋白，而且截留更多有活性的小分子多肽。
具体实施方式
一种法氏囊素脂质体的制备方法，包括以下步骤：
1、提取法氏囊素
1.1取新鲜鸡法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗干净后，按法氏囊与注射用水的重量比为1∶1-3混合均匀，然后采用组织捣碎机依次按照转速16000-17000r/min、18000-19000r/min、21000-22000r/min进行捣碎，捣碎后的法氏囊经胶体磨匀浆后得到匀浆液，并于-20℃以下冻存；
1.2取出冻存的匀浆液反复冻融4-6次；
1.3将冻融结束的匀浆液于2~8℃条件下，6000-8000r/min离心15-25min，取上清液；
1.4在上清液中加入终浓度为0.01-0.02%β-丙内酯，于2-8℃下搅拌16-32h进行灭活；
1.5将灭活后的溶液于35-39℃水解2-3h；
1.6将水解后的溶液用0.22-0.45μm滤膜进行切向流微滤，收集微滤透过液并采用1-5kd滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液；
1.7调节超滤透过液的渗透压使之成为等渗溶液；
1.8将上述等渗溶液用0.1-0.22μm除菌过滤器除菌，收集的液体即为法氏囊素。
2、制备法氏囊素脂质体
2.1将磷脂与胆固醇按照质量比1∶3-5混合均匀，得到脂质混合物（若该步骤选用液态形式的磷脂、胆固醇，应先将磷脂、胆固醇采用旋转蒸发的形式去除溶剂）；
2.2）在惰性气体环境中，将上述脂质混合物溶解于乙醚中，然后加入待包封的浓度1mg/ml法氏囊素水相，得到水-有机溶剂两相体系，并使体系始终处于惰性气体环境中；
2.3）将上述两相体系置于水浴式超声仪中进行超声反应，直至体系中的混合物变为澄清的单相分散体或有乳光的均匀分散体为止(当液体从乳白色变成乳光状，即对着日光能透过样品看清窗框，即可)；
其中，超声功率为100-150w，超声时间为10-60min，超声温度为10℃以下；
2.4）超声结束后，将体系中的混合物置于旋转蒸发仪中，减压旋转蒸发除去混合物中的残留的乙醚。具体的，先维持旋转蒸发瓶内的压强为500~700mmhg，旋转蒸发25-35min除去混合物中的大部分残留乙醚，然后将旋转蒸发瓶内压强降低至400~600mmhg，旋转蒸发15-20min除去混合物中痕量的乙醚；旋转蒸发的转速控制为150-250r/min，在有机溶剂乙醚的蒸发过程中，必须完全避免起泡或沸腾；
2.5）收集上述旋转蒸发后得到的混合物，于10℃以下，20000-25000g离心25-35min，收集固相，得到法氏囊素脂质体。
实施例1
一种法氏囊素脂质体的制备方法，包括以下步骤：
1、提取法氏囊素
1.1取新鲜鸡法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗干净后，按法氏囊与注射用水的重量比为1∶3混合均匀，然后采用组织捣碎机依次按照转速16800r/min、18800r/min、21500r/min进行捣碎，捣碎后的法氏囊经胶体磨匀浆后得到匀浆液，并于-20℃以下冻存；
1.2取出冻存的匀浆液反复冻融6次；
1.3将冻融结束的匀浆液于2℃，6000r/min离心25min，取上清液；
1.4在上清液中加入终浓度为0.01%β-丙内酯，于5℃下搅拌27h进行灭活；
1.5将灭活后的溶液于37℃水解2h；
1.6将水解后的溶液用0.45μm滤膜进行切向流微滤，收集微滤透过液并采用5kd滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液；
1.7调节超滤透过液的渗透压使之成为等渗溶液；
1.8将上述等渗溶液用0.22μm除菌过滤器除菌，收集的液体即为法氏囊素。
2、制备法氏囊素脂质体
2.1将磷脂与胆固醇按照质量比1∶4混合均匀，得到脂质混合物；
2.2）在惰性气体环境中，将上述脂质混合物溶解于乙醚中，然后加入待包封的浓度1mg/ml法氏囊素水相，得到水-有机溶剂两相体系，并使体系始终处于惰性气体环境中；
2.3）将上述两相体系置于水浴式超声仪中进行超声反应，直至体系中的混合物变为澄清的单相分散体或有乳光的均匀分散体为止(当液体从乳白色变成乳光状，即对着日光能透过样品看清窗框，即可)；
其中，超声功率为125w，超声时间为30min，超声温度为10℃以下；
2.4）超声结束后，将体系中的混合物置于旋转蒸发仪中，减压旋转蒸发除去混合物中的残留的乙醚，具体的，先维持旋转蒸发瓶内的压强为600mmhg，旋转蒸发30min除去混合物中的大部分残留乙醚，然后将旋转蒸发瓶内压强降低至500mmhg，旋转蒸发15min除去混合物中痕量的乙醚；旋转蒸发的转速控制为250r/min，在有机溶剂乙醚的蒸发过程中，必须完全避免起泡或沸腾；
2.5）收集上述旋转蒸发后得到的混合物，于10℃以下，22500g离心30min，收集固相，得到法氏囊素脂质体。
实施例2
一种法氏囊素脂质体的制备方法，包括以下步骤：
1、提取法氏囊素
1.1取新鲜鸡法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗干净后，按法氏囊与注射用水的重量比为1∶2混合均匀，然后采用组织捣碎机依次按照转速16000r/min、18000r/min、21000r/min进行捣碎，捣碎后的法氏囊经胶体磨匀浆后得到匀浆液，并于-20℃以下冻存；
1.2取出冻存的匀浆液反复冻融5次；
1.3将冻融结束的匀浆液于4℃，8000r/min离心15min，取上清液；
1.4在上清液中加入终浓度为0.02%β-丙内酯，于2℃下搅拌30h进行灭活；
1.5将灭活后的溶液于35℃水解3h；
1.6将水解后的溶液用0.22μm滤膜进行切向流微滤，收集微滤透过液并采用1kd滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液；
1.7调节超滤透过液的渗透压使之成为等渗溶液；
1.8将上述等渗溶液用0.1μm除菌过滤器除菌，收集的液体即为法氏囊素。
2、制备法氏囊素脂质体
2.1将磷脂与胆固醇按照质量比1∶3混合均匀，得到脂质混合物；
2.2）在惰性气体环境中，将上述脂质混合物溶解于乙醚中，然后加入待包封的浓度1mg/ml法氏囊素水相，得到水-有机溶剂两相体系，并使体系始终处于惰性气体环境中；
.2.3）将上述两相体系置于水浴式超声仪中进行超声反应，直至体系中的混合物变为澄清的单相分散体或有乳光的均匀分散体为止(当液体从乳白色变成乳光状，即对着日光能透过样品看清窗框，即可)；
其中，超声功率为100w，超声时间为60min，超声温度为10℃以下；
2.4）超声结束后，将体系中的混合物置于旋转蒸发仪中，减压旋转蒸发除去混合物中的残留的乙醚，具体的，先维持旋转蒸发瓶内的压强为500mmhg，旋转蒸发35min除去混合物中的大部分残留乙醚，然后将旋转蒸发瓶内压强降低至400mmhg，旋转蒸发20min除去混合物中痕量的乙醚；旋转蒸发的转速控制为200r/min，在有机溶剂乙醚的蒸发过程中，必须完全避免起泡或沸腾；
2.5）收集上述旋转蒸发后得到的混合物，于10℃以下，20000g离心35min，收集固相，得到法氏囊素脂质体。
实施例3
一种法氏囊素脂质体的制备方法，包括以下步骤：
1、提取法氏囊素
1.1取新鲜鸡法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗干净后，按法氏囊与注射用水的重量比为1∶1混合均匀，然后采用组织捣碎机依次按照转速17000r/min、19000r/min、22000r/min进行捣碎，捣碎后的法氏囊经胶体磨匀浆后得到匀浆液，并于-20℃以下冻存；
1.2取出冻存的匀浆液反复冻融4次；
1.3将冻融结束的匀浆液于6℃，7000r/min离心15-25min，取上清液；
1.4在上清液中加入终浓度为0.015%的β-丙内酯，于8℃下搅拌24h进行灭活；
1.5将灭活后的溶液于39℃水解2h；
1.6将水解后的溶液用0.22μm滤膜进行切向流微滤，收集微滤透过液并采用3kd滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液；
1.7调节超滤透过液的渗透压使之成为等渗溶液；
1.8将上述等渗溶液用0.1μm除菌过滤器除菌，收集的液体即为法氏囊素。
2、制备法氏囊素脂质体
2.1将磷脂与胆固醇按照质量比1∶5混合均匀，得到脂质混合物；
2.2）在惰性气体环境中，将上述脂质混合物溶解于乙醚中，然后加入待包封的浓度1mg/ml法氏囊素水相，得到水-有机溶剂两相体系，并使体系始终处于惰性气体环境中；
.2.3）将上述两相体系置于水浴式超声仪中进行超声反应，直至体系中的混合物变为澄清的单相分散体或有乳光的均匀分散体为止(当液体从乳白色变成乳光状，即对着日光能透过样品看清窗框，即可)；
其中，超声功率为150w，超声时间为10min，超声温度为10℃以下；
2.4）超声结束后，将体系中的混合物置于旋转蒸发仪中，减压旋转蒸发除去混合物中的残留的乙醚，具体的，先维持旋转蒸发瓶内的压强为700mmhg，旋转蒸发25min除去混合物中的大部分残留乙醚，然后将旋转蒸发瓶内压强降低至600mmhg，旋转蒸发15min除去混合物中痕量的乙醚；旋转蒸发的转速控制为180r/min，在有机溶剂乙醚的蒸发过程中，必须完全避免起泡或沸腾；
2.5）收集上述旋转蒸发后得到的混合物，于10℃以下，25000g离心25min，收集固相，得到法氏囊素脂质体。
实施例4
一种法氏囊素脂质体的制备方法，包括以下步骤：
1、提取法氏囊素
1.1取新鲜鸡法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗干净后，按法氏囊与注射用水的重量比为1∶3混合均匀，然后采用组织捣碎机依次按照转速16800r/min、18800r/min、21500r/min进行捣碎，捣碎后的法氏囊经胶体磨匀浆后得到匀浆液，并于-20℃以下冻存；
1.2取出冻存的匀浆液反复冻融6次；
1.3将冻融结束的匀浆液于8℃，6000r/min离心20min，取上清液；
1.4在上清液中加入终浓度为0.01-0.02%β-丙内酯，于6℃下搅拌24h进行灭活；
1.5将灭活后的溶液于37℃水解2.5h；
1.6将水解后的溶液用0.45μm滤膜进行切向流微滤，收集微滤透过液并采用5kd滤膜进行切向流超滤，收集超滤透过液；
1.7调节超滤透过液的渗透压使之成为等渗溶液；
1.8将上述等渗溶液用0.22μm除菌过滤器除菌，收集的液体即为法氏囊素。
2、制备法氏囊素脂质体
2.1将磷脂与胆固醇按照质量比1∶4混合均匀，得到脂质混合物；
2.2）在惰性气体环境中，将上述脂质混合物溶解于乙醚中，然后加入待包封的浓度1mg/ml法氏囊素水相，得到水-有机溶剂两相体系，并使体系始终处于惰性气体环境中；
.2.3）将上述两相体系置于水浴式超声仪中进行超声反应，直至体系中的混合物变为澄清的单相分散体或有乳光的均匀分散体为止(当液体从乳白色变成乳光状，即对着日光能透过样品看清窗框，即可)；
其中，超声功率为120w，超声时间为25min，超声温度为10℃以下；
2.4）超声结束后，将体系中的混合物置于旋转蒸发仪中，减压旋转蒸发除去混合物中的残留的乙醚，具体的，先维持旋转蒸发瓶内的压强为650mmhg，旋转蒸发30min除去混合物中的大部分残留乙醚，然后将旋转蒸发瓶内压强降低至500mmhg，旋转蒸发15min除去混合物中痕量的乙醚；旋转蒸发的转速控制为150r/min，在有机溶剂乙醚的蒸发过程中，必须完全避免起泡或沸腾；
2.5）收集上述旋转蒸发后得到的混合物，于10℃以下，25000g离心30min，收集固相，得到法氏囊素脂质体。