一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法
【专利摘要】一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。每1000mlPBS中包含以下组分：蜂王浆2?8g、茯苓酸2?8g、何首乌苷5?10g、柴胡1?5g、板蓝根2?4g、乳糖5?10g、葡萄糖5?10g、脂质体5?10g和冻干保护剂10?15g。本发明具有以下有益效果：1）本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以降低半成品的批间差异；2）本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以促进猪伪狂犬病毒的繁殖，提高病毒含量，增强疫苗的免疫原性。
【专利说明】
一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干 制品及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)属于疱疼病毒(Herpesviridae)a疱疼病 毒亚科（Alphaher-pesririnae)水痕病毒属（VaricelIo virus)的疱疼病毒亚科I型 (Porcine herpesvirus Typel)，引发猪的严重疾病。猪伪狂犬病在猪传染病中占据了重要 地位，给养猪业造成了极大的威胁，该病不仅对养猪业本身，而且对其它动物养殖的顺利发 展也有着严重的影响。
[0003] 脂质体（liposomes)是一种具有类似于生物膜结构的小囊，因为它的组成结构和 细胞生物膜相似，所以容易与细胞发生吸附、融合、脂交换、内吞，从而被细胞摄取和被细胞 膜融合，最后将药物或生物颗粒送入细胞内部，是一种靶向给药系统中的新剂型。脂质体作 为药物的载体，既能包封脂溶性药物，又能包封水溶性药物，提高生物利用率，具有和脂质 体细胞的亲和性与组织相容性等特点。
[0004] 天然活性成分是指从自然存在的再生资源中提取的具有独特功能和生物活性的 化合物，其中许多有效成分是疾病防治、强身健体的物质基础，已成为医药、食品及饲料的 重要来源。
[0005] 脂质体具有生物膜结构的特性，能将某些增强免疫的天然活性成分包裹其中，不 仅克服了药物不稳定、易被氧化的缺点，还能够大大增强机体的免疫力。应用冷冻干燥技术 制备的冻干脂质体具有特殊的疏松多孔结构，可以使药物易于重新复水而恢复活性，而且 冻干制剂具有含水量低，易长期稳定保存的优势，鉴于此，发明了一种伪狂犬病毒脂质体稀 释液冻干制品。
[0006] 兽用生物制品质量评定最重要的指标之一就是批次间的稳定性，然而在实际生产 过程中难以控制半成品的批次间稳定性，究其原因主要是在接种活体生物时的比例不确 定，也就是说接种量不稳定导致生产出半成品有较大的差异。本发明宗旨在于解决伪狂犬 病毒增殖过程中批次间差异大以及病毒含量过低的难题。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种伪狂犬病毒脂质体稀 释液冻干制品及其制备方法的技术方案。
[0008] 所述的一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000 mlPBS中包含 以下组分:蜂王浆2-8g、茯苓酸2-8g、何首乌苷5-10g、柴胡l-5g、板蓝根2-4g、脂质体5-10g 和冻干保护剂l〇_15g。
[0009] 所述的一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000 mlPBS中包含 以下组分:蜂王浆4-6g、茯苓酸4-6g、何首乌苷6-8g、柴胡2-4g、板蓝根3-4g、脂质体6-8g和 冻干保护剂12-14g。
[0010] 所述的一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的脂质体通过以 下步骤得到:称取大豆卵磷脂和胆固醇，用氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法 去除溶液中氯仿，制备脂质体膜;配制PH值为7.0~8.0的枸缘酸和枸缘酸钾缓冲溶液，将该 缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
[0011] 所述的一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的冻干保护剂为 乳糖和葡萄糖。
[0012] 所述的一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于称取大豆卵磷脂3-4g 和胆固醇2-3g用400-500ml氯仿进行溶解;将100-200ml的枸缘酸和枸缘酸钾缓冲溶液加入 到脂质体膜溶液中。
[0013] 所述的一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于包括以下 步骤:取所述重量的各组分充分混合后，加入到1000ml pH 7磷酸盐缓冲液中水化，再经过 0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中；先放低温冰箱预冻，再放真空冻干机中干燥，即 得到伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品。
[0014] 所述的一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于所述的pH 7的磷酸盐缓冲液通过以下步骤得到：取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g;将以上 各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，经116°C，高压灭菌30分钟即得。
[0015] 本发明涉及的组分均为现有产品，其中茯苓酸购于成都瑞芬思生物科技有限公 司，何首乌苷购于西安汇林生物科技有限公司。
[0016] 本发明具有以下有益效果： 1) 本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以降低半成品的批间差异； 2) 本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以促进猪伪狂犬病毒的繁殖，提高病毒含 量，增强疫苗的免疫原性。
【具体实施方式】
[0017] 为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实 验方法，通常按常规实验方法进行。
[0018]实施例1:脂质体的制备 称取大豆卵磷脂4g和胆固醇3g，用500ml氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压 法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜；取pH值为7.0~8.0的枸缘酸和枸缘酸钾缓冲溶液 200ml，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
[0019] 实施例2:脂质体的制备 称取大豆卵磷脂3g和胆固醇2g，用400ml氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压 法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜；取pH值为7.0~8.0的枸缘酸和枸缘酸钾缓冲溶液 100mL，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
[0020] 实施例3:pH 7磷酸盐缓冲液的制备 取氯化钠8g、氯化钾0.3g、磷酸氢二钠 lg、磷酸二氢钾0.3g、氯化钙0.3g、含6个结晶水 的氯化镁o.lg;将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，经116°C，高压灭菌30分钟即 得。
[0021]实施例4:pH 7磷酸盐缓冲液的制备 取氯化钠 l〇g、氯化钾〇. 5g、磷酸氢二钠1.2g、磷酸二氢钾0.5g、氯化钙0.2g、含6个结晶 水的氯化镁〇.2g;将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，经116°C，高压灭菌30分钟即 得。
[0022]实施例5:-种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品 取蜂王浆4g、茯苓酸4g、何首乌苷5g、柴胡2g、板蓝根2g、脂质体5g(实施例1制得）、冻干 保护剂IOg(乳糖5g和葡萄糖5g); 将上述各组分充分混合后，加入到1000ml pH 7磷酸盐缓冲液(实施例3制得）中水化， 再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中； 先放低温冰箱预冻，再放真空冻干机中干燥，即得到伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制 品。
[0023]实施例6:-种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品 取蜂王浆5g、茯苓酸4g、何首乌苷5g、柴胡2g、板蓝根2g、脂质体5g(实施例1制得）、冻干 保护剂12g(乳糖6g和葡萄糖6g); 将上述各组分充分混合后，加入到1000ml pH 7磷酸盐缓冲液(实施例3制得）中水化， 再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中； 先放低温冰箱预冻，再放真空冻干机中干燥，即得到伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制 品。
[0024]实施例7:-种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品 取蜂王浆7g、茯苓酸6g、何首乌苷6g、柴胡4g、板蓝根4g、脂质体8g(实施例2制得）、冻干 保护剂16g(乳糖8g和葡萄糖8g); 将上述各组分充分混合后，加入到1000ml pH 7磷酸盐缓冲液(实施例4制得）中水化， 再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中； 先放低温冰箱预冻，再放真空冻干机中干燥，即得到伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制 品。
[0025]试验例1本发明的应用 1材料 1.1伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品:按本发明实施例5-7制得 1.2伪狂犬病毒(C株），ST细胞，购自ATCC。
[0026] 1.3家兔2kg左右，购自浙江省农科院，检测伪狂犬抗体、抗原双阴性。
[0027] 2 方法 2.1包封率的测定 分别取空白的冻干脂质体和处理过的脂质体冻干粉，在磷酸盐缓冲液中进行复溶，超 速离心，取上清按一定比例稀释后，测定其吸光度(参考兽药典），平均每个样品测3次，算其 平均值。
[0028] 2.2形态观察和粒径 脂质体稀释液冻干粉在PBS缓冲液复溶后，在透射电镜（X 20000)下观察 2.3细胞培养及接毒 按常规细胞培养方法培养ST细胞;在细胞传代后均分4组，每组3瓶，将本发明实施例5-7制备的脂质体稀释液冻干制品置于PH7磷酸盐缓冲液中进行复溶，分别将20160601、 20160602、20160603 三种不同批次的病毒稀释成 1000 TCIDso/ml、1500 TCID5〇/ml、2000 TCID5qAiI13A组，采用本发明实施例5制备的脂质体稀释液对3种不同批次的PRV进行稀释接 种;B组，采用本发明实施例6制备的脂质体稀释液对3种不同批次PRV进行稀释接种;C组，采 用本发明实施例7制备的脂质体稀释液对3不同批次PRV进行稀释接种;D组，对照组，采用无 血清的细胞培养液对3不同批次PRV进行稀释接种，将以上各组分别置于37°C、5% C02细胞 培养箱中培养72h之后进行收毒。
[0029] 2.4 TCID5O测定 将传代消化后的细胞稀释成IO5~IO6个/m L之后，转入96孔培养板中，按0. 2 m L /孔;将收获的四组病毒液分别作连续的10倍稀释，按0.2 mL /孔接种，置37°C、5% CO2 中培养，每天观察细胞病变并记录，按Reed-Muench法计算TCID50。
[0030] 2.5免疫原性测定 收获2.3提到的培养72h 20160401批次四组病毒液经检验合格，分别进行灭活、乳化后 制作成疫苗成品用来测定疫苗的免疫原性。将家兔分为4组，每组10只，第I组采用经本发明 实施例5制备的脂质体稀释液处理过的PRV灭活乳化后制成的疫苗进行免疫;第Π 组采用经 本发明实施例6制备的脂质体稀释液处理过的PRV灭活乳化后制成的疫苗免疫;第m组为采 用经本发明实施例7制备的脂质体稀释液处理过的PRV灭活乳化后制成的疫苗免疫；第IV 组，疫苗对照组，未经脂质体处理灭活后制成的疫苗免疫;各组均按Iml/只进行免疫，后肢 根腹部皮下注射。14d后再以同等剂量加强免疫一次。在二免一周后采血，在21d、28d、42d、 56d、70d分离血清，采用乳胶凝集试验法检测血清中的抗体效价。
[0031 ] 3 结果 3.1包封率结果 按照公式:包封率（％ )=系统中包封的药量(Al)/系统中包封与未包封的总药量(A2) X 100%，结果见表1。
[0032] 表1包封率测定结果
3.2形态观察和粒径测定 脂质体稀释液冻干制品为多室脂质体，粒度规则，为圆形，粒径基本一致，结果见表2。 [0033] 表2形态观察和粒径测定结果
3.3 TCID5q测定结果 表3 TCID5q测定结果
4结论 综上所述，本发明伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品具有良好的包封率，且粒度规则， 粒径基本一致;能够很好的保证半成品接种量的稳定性，降低伪狂病毒灭活疫苗半成品间 的批次差异;提高疫苗的血清抗体效价，增强疫苗的免疫原性。
【主权项】
1. 一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每lOOOrnlPBS中包含以下组分： 蜂王浆2-8g、茯苓酸2-8g、何首乌苷5-10g、柴胡l-5g、板蓝根2-4g、脂质体5-10g和冻干保护 剂l〇_15g。2. 如权利要求1所述的一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每 lOOOrnlPBS中包含以下组分:蜂王浆4-6g、茯苓酸4-6g、何首乌苷6-8g、柴胡2-4g、板蓝根3-4g、脂质体6-8g和冻干保护剂12-14g。3. 如权利要求1或2所述的一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的 脂质体通过以下步骤得到:称取大豆卵磷脂和胆固醇，用氯仿进行溶解，并使其混合均匀， 并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜;配制pH值为7.0~8.0的枸缘酸和枸缘酸钾 缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。4. 如权利要求1或2所述的一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的 冻干保护剂为乳糖和葡萄糖。5. 如权利要求3所述的一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于称取大豆 卵磷脂3_4g和胆固醇2-3g用400-500ml氯仿进行溶解;将100-200ml的枸缘酸和枸缘酸钾缓 冲溶液加入到脂质体膜溶液中。6. 如权利要求1-5中任一权利要求所述的一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品的制 备方法，其特征在于包括以下步骤:取所述重量的各组分充分混合后，加入到l〇〇〇ml pH 7 磷酸盐缓冲液中水化，再经过〇 . 22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中；先放低温冰箱预 冻，再放真空冻干机中干燥，即得到伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品。7. 如权利要求6所述的一种伪狂犬病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在 于所述的pH 7的磷酸盐缓冲液通过以下步骤得到：取氯化钠 6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸 氢二钠 1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0. Οδ-Ο.2g; 将以上各成分混合后，溶于 1000ml 双蒸水中 ，经 116°C，高压灭菌 30 分钟即得。
【文档编号】A61K9/127GK106074403SQ201610603818
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月28日 公开号201610603818.1, CN 106074403 A, CN 106074403A, CN 201610603818, CN-A-106074403, CN106074403 A, CN106074403A, CN201610603818, CN201610603818.1
【发明人】沈建军, 张秀文, 李阳
【申请人】浙江美保龙生物技术有限公司