一种灵芝多糖脂质立方液晶及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种灵芝多糖脂质立方液晶的制备方法，它是以双蒸水为分散介质，采用前体?注入法制备得到。本发明还公开了制备得到的灵芝多糖脂质立方液晶在制备提高机体免疫力的药物中的应用。与现有技术相比，本发明方法的包封率高，制备所得产品稳定性较好且免疫增强活性强，显著提高了灵芝多糖的免疫增强活性。
【专利说明】
一种灵芝多糖脂质立方液晶及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于中兽药领域，具体涉及一种灵芝多糖脂质立方液晶及其制备方法与应 用。
【背景技术】
[0002] 动物疫病主要靠疫苗来预防，但是很多疫苗存在免疫原性较弱等缺点，需要免疫 增强剂辅助才能产生强大的免疫应答。现有的常用免疫增强剂如油佐剂、铝胶佐剂等常存 在刺激性强、有残留等缺点。由于中药具有绿色安全的特点，从中药中开发免疫增强剂已成 为热点。
[0003] 灵芝多糖是灵芝中具有免疫增强活性的主要成分，灵芝多糖不仅具有提供糖原能 量，构成机体结构物质，而且在体内安全，组织相容性好，具有开发成佐剂的良好基础。灵芝 多糖由很多单体组成，如D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-木糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖等 单体是他的主要组成部分。灵芝多糖具有提高机体体液和免疫细胞免疫的功能同时也可以 激活机体补体系统，诱导抗原特异性CD4+、CD8+记忆性T细胞反应，提高I gG、细胞因子的水 平。但是多糖存在不稳定、容易发生聚集、体内代谢快、生物利用度低、用药量大导致成本较 高，严重的限制了灵芝多糖在疫苗佐剂领域的使用。为了更好地开发利用灵芝多糖的药理 作用，对灵芝多糖新剂型的研究逐渐成为热点。
[0004] 脂质立方液晶纳米粒是一定浓度的两亲性脂质分散在水溶液中自组装成含双连 续水区和脂质区的闭合脂质双层"蜂窝状(海绵状)"结构，该独特的内部双水道结构和巨大 膜表面积(400m 2/g)使其能够包封各种不同极性和剂量的药物，具有多样化的药物包裹性。 如水溶性药物可以包封在水道中，脂溶性药物可以包裹在脂质双分子层膜中。脂质立方液 晶纳米粒具有良好的温度稳定性、内表面积高及类似凝胶的黏度等独特优点，具有很多应 用功能，如保护药物活性、控制药物释放、靶向给药以及阻止药物分子间发生聚集和化学反 应等。同脂质体相比，脂质立方晶体纳米粒不但具有普通脂质体的优越特性，如组织相容 性、靶向性、保护性、双亲性、缓释性等，还具有其自身特殊的优点:①稳定性好，脂质立方液 晶是立体多层结构，类似多囊泡脂质体，可提高包封率和制得具有较高稳定性的制剂。②在 粒子体积等同时，脂质立方液晶纳米粒较脂质体有更大的双分子层面积，故具有对亲脂性 和两亲性药物相对更高的载药量。③脂质立方液晶纳米粒可以无限稀释，稀释稳定性好，而 脂质体稀释后，药物渗漏会显著增加。因此脂质立方液晶纳米粒在稳定性、载药性能等方面 有较大的优势。④相对于其他种类的佐剂，脂质立方液晶在较低的浓度即可明显的产生佐 剂效应，并且脂质立方液晶对体液免疫与细胞免疫均有明显的增强作用。
[0005] 本发明首次利用前体-注入法制备灵芝多糖脂质立方液晶混悬液，并对其制备工 艺进行优化比较，并将其和动物灭活PCV-2病毒一起应用免疫，建立了灵芝多糖脂质立方液 晶的制备方法，优化了制备条件，发现灵芝多糖脂质立方液晶能显著提高灵芝多糖的免疫 增强作用，提高其生物利用度。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种灵芝多糖脂质立方液晶，以解决现有技术存 在的灵芝多糖不稳定、容易发生聚集、体内代谢快、生物利用度低和用药量大等问题。
[0007] 本发明还要解决的技术问题是提供上述灵芝多糖脂质立方液晶的制备方法。
[0008] 本发明最后要解决的技术问题是提供上述灵芝多糖脂质立方液晶的应用。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0010] -种灵芝多糖脂质立方液晶的制备方法，它包括如下步骤：
[0011] (1)取植烷三醇和丙二醇溶于乙醇中备用；
[0012] (2)取ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0三嵌段共聚物和灵芝多糖溶于水中备用；
[0013] (3)将步骤（1)中所得的混合体系滴加至步骤(2)中所得的混合体系中并搅拌，旋 转蒸发除去乙醇后，经超声处理得到灵芝多糖脂质立方液晶混悬液(Cub-PS)。
[0014] 步骤(1)中，所述的乙醇为无水乙醇。
[0015] 步骤(1)中，植烷三醇和丙二醇的质量比为1~2:1;优选质量比为4:3。
[0016] 步骤（1)中，植烷三醇和乙醇的固液比为30~100mg: lmL，优选50mg: lmL。
[0017] 步骤(2)中，所述的ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0三嵌段共聚物优选F127。
[0018]步骤(2)中，所述的水优选双蒸水。
[0019] 步骤(2)中，ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0三嵌段共聚物和灵芝多糖的质量比为1~2:1~2;优选用 量比为1:1。
[0020] 步骤(2)中，ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0三嵌段共聚物和水的质量比为1:50~200。
[0021] 步骤(3)中，步骤(1)所得的混合体系和步骤(2)所得的混合体系的体积比为1:4~ 10。
[0022] 其中，所述的滴加，所述的滴加，滴加流速为1~2mL/min。
[0023] 步骤(3)中，搅拌方法为室温下300~800r/min搅拌lh;其中，滴加开始时就开始搅 拌。
[0024]步骤(3)中，旋转蒸发的温度为40~70°C。
[0025] 步骤(3)中，超声处理的方法为:使用细胞超声粉碎仪，在300W功率下超声20~30 次，每次3~5min，两次超声间隔2~5s。
[0026] 上述任意一项制备得到的灵芝多糖脂质立方液晶也在本发明的保护范围之内。
[0027] 上述的灵芝多糖脂质立方液晶在制备提高机体免疫力的药物中的应用。
[0028]上述的灵芝多糖脂质立方液晶能够显著提高猪圆环病毒(PCV-2灭活病毒）的特异 性抗体水平、不同亚型抗体的含量和细胞因子含量，且能够促进抗原转运到附近淋巴结，同 时提高淋巴结中成熟树突状细胞的比例，促进记忆细胞的分化，具有较好的免疫增强功能。 [0029] 有益效果：
[0030] 与现有技术相比，本发明具有如下优势：
[0031] 1、灵芝多糖脂质立方液晶的制备国内外未见报道，本发明提供了一种灵芝多糖脂 质立方液晶的制备方法及其优化的条件，填补了国内外研究的空白；且本发明方法操作简 单，易于推广。
[0032] 2、灵芝多糖脂质立方液晶的免疫增强活性未见报道。通过本发明的实施，证明灵 芝多糖通过制备成灵芝多糖脂质立方液晶后能够显著提高其免疫增强活性，表现为提高小 鼠血清PCV-2特异性IgG抗体效价、不同亚型抗体水平和细胞因子含量，同时发现灵芝多糖 脂质立方液晶能够促进抗原转运到附近淋巴结，同时提高淋巴结中成熟树突状细胞的比 例，与灵芝多糖相比，能够诱导机体记忆细胞的分化，从而长时间增强动物免疫功能。因此， 灵芝多糖脂质立方液晶可以作为研制新型免疫增强剂的材料，为研制新型免疫增强剂提供 了材料和示范。
[0033] 3、本发明方法制备得到的灵芝多糖脂质立方液晶，利用马尔文粒度分析仪对灵芝 多糖脂质立方液晶的粒径、多分散系数(PDI)及表面电势进行了分析，并通过冷冻扫描电镜 和小角度X射线散射试验(SAXS)对灵芝多糖脂质立方液晶的内部结构进行了研究，发现灵 芝多糖脂质立方液晶呈均一的纳米分散体系。
[0034] 4、本发明采用前体-注入法将灵芝多糖制备成灵芝多糖脂质立方液晶，所得立方 液晶包封率高（平均包封率为89.5 ± 3.51 % )，不仅可以解决灵芝多糖成分易氧化、不易制 剂等问题，而且便于药物的吸收，可以使药物缓慢地的释放，有效地延长药效，能显著提高 动物免疫功能，对抵抗疫病有重要意义。同时，本发明作为一种新型中兽药，没有副作用。
【附图说明】
[0035] 图1为实施例1中灵芝多糖脂质立方液晶的冷冻扫描电镜图；
[0036]图2A为实施例1中灵芝多糖脂质立方液晶的粒径图；
[0037]图2B为实施例1中灵芝多糖脂质立方液晶的SAXS分析图；
[0038]图3A为实施例2中不同剂量的灵芝多糖脂质立方液晶对血清抗体水平的影响示意 图；
[0039]图3B为实施例2中各对照组对血清抗体水平的影响示意图；
[0040]图3C为实施例2中各对照组的IgGl和IgG2a抗体水平示意图；
[00411图3D为为实施例2中各对照组的IgG2b和IgG3抗体水平示意图；
[0042]图4A为实施例2中各对照组中血清中细胞因子IL-4的变化示意图；
[0043]图4B为实施例2中各对照组中血清中细胞因子IL-12p70的变化示意图；
[0044]图4C为实施例2中各对照组中血清中细胞因子IFN- γ的变化示意图；
[0045] 图4D为实施例2中各对照组中血清中细胞因子TNF-α的变化示意图；
[0046] 图4E为实施例2中各对照组中血清中细胞因子IL-17的变化示意图；
[0047]图5A为实施例2中首免24h之后，各对照组淋巴结中成熟树突状细胞的比例示意 图；
[0048]图5B为实施例2中首免48h之后，各对照组淋巴结中成熟树突状细胞的比例示意 图；
[0049] 图6为实施例2中各对照组对小鼠淋巴结中抗原转运的影响示意图；
[0050] 图7为实施例2中各对照组对小鼠淋巴结中记忆细胞的影响示意图。
【具体实施方式】
[0051] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0052]实施例1灵芝多糖脂质立方液晶的制备
[0053] (1)方法的筛选
[0054]方法l"Buk"相自发乳化法：
[0055] 称取0 . lg植烷三醇、0.0 lg F127，丙二醇0.075g置于20ml西林瓶中，加入10mL氯 仿，超声使其充分溶解。置于50mL旋蒸瓶中，45 °C减压蒸发除去有机溶剂，当圆底烧瓶中溶 液无明显减少时时，导入10uL含10mg灵芝多糖的水溶液，超声使其充分混匀，之后将其分散 至5mL双蒸水中，搅拌5~lOmin，即的灵芝多糖脂质立方液晶混悬液，置于4°C保存。
[0056]方法2前体-注入法：
[0057] 称取脂质材料植烷三醇O.lg与丙二醇0.075g，于20ml西林瓶中，再加入无水乙醇 1.5ml，超声处理20min，使其充分溶解，作为A相;称取F127 10mg和灵芝多糖10mg于100ml烧 杯中，加入20ml双蒸水，于水浴60 °C上加热使溶解，作为B相。将A相缓慢滴加至B相中，以 500r/min室温下搅拌lh，旋转蒸发以充分除去乙醇，再于细胞超声粉碎仪上300W冰浴超声 处理5min，超声30次（问隔5s)，即得大小均一的灵芝多糖脂质立方液晶混悬液(Cub-PS)。
[0058] 上述两种方法制备得到的Cub-PS的包封率见表1。
[0059] 表1两种不同方法制备Cub-PS包封率
[0060]
[0061]根据表1的结果分析，利用前体-注入法制备的灵芝多糖立方液晶表现出了更高的 包封率，因此后续实验选用前体-注入法来制备灵芝多糖脂质立方液晶。
[0062] (2)分散介质的选择
[0063]制备脂质立方液晶的过程中，分散介质的种类对脂质立方液晶的成型、包封率和 稳定性有明显的影响。故本文比较分析了蒸馏水、双蒸水和磷酸盐缓冲液(PBS)三种分散介 质对灵芝多糖脂质立方液晶的包封率和稳定性的影响作用。
[0064]表2不同分散介质的处方组成
[0065]
[0066] 将按照上述处方制备的灵芝多糖脂质立方液晶放置于4°C保存，每天观察样品的 团聚情况，结果见表3。
[0067] 表3不同分散介质对芝多糖脂质立方液晶的影响
[0068]
[0069] 由表3的实验结果可以分析得出选用双蒸水作为分散介质能够获得更好的包封 率，并且稳定性显著高于PBS和去离子水组。
[0070] (3)粒径电位检测及冷冻扫描电镜观察
[0071] 用双蒸水将Cub-PS(灵芝多糖脂质立方液晶）稀释到一定浓度，于冷冻台制备样 品，透射电镜下观察Cub-PS(脂质立方液晶）的形态并拍摄照片（图1)。利用马尔文粒度分析 仪测定Cub-PS的粒径分布及表面电位(图2)。
[0072]
[0073] 注:Cub:空白脂质立方液晶Cub-PS:灵芝多糖脂质立方液晶
[0074] 由扫描电镜图片可知，灵芝多糖立方液晶纳米粒在水中分散较好，且粒径大小差 异较小，外观呈立方状态;从粒径大小分析可知立方液晶包封灵芝多糖之后粒径出现了稍 微的增大（图2A)，同时SAXS显示各散射峰对应的散射矢量的比为: : Vi (图2B)，表明 其为Pn3m晶型结构，Cub与Cub-PS的表面电位分别为-14.33 ± 0.75和-16.13 ±0.42。电镜及 粒径、电势分析表明灵芝多糖脂质立方液晶立方液晶具有优良的物理化学性质。实施例2灵 芝多糖脂质立方液晶免疫增强活性比较
[0075] 以实施例1中制备得到的灵芝多糖脂质立方液晶（Cub-PS)为研究对象，以灵芝多 糖(PS)和空白脂质立方液晶（Cub)作为对照，ISA206佐剂作为阳性对照，测定了它们对猪圆 环病毒(PCV-2)灭活病毒免疫后机体IgG抗体水平、抗体亚型、淋巴结树突状细胞的活化、淋 巴结中PCV-2抗原及细胞因子IFN-γ、了陬-€[、几-12?70、11^-4和11^-17含量的影响。
[0076] (1)动物分组及处理
[0077] 60只6-8周龄的Blab/c小鼠随机均分为5组，分别为灵芝多糖脂质立方液晶组 (Cub-PS-Ag)、灵芝多糖组（PS-Ag)、灵芝多糖脂质立方液晶组（Cub-Ag)、阳性对照组 (ISA206)和PBS对照组(PBS)。皮下免疫小鼠2次，每次免疫间隔1周。分别于首免后7、14、21 天检测机体IgG抗体水平、抗体亚型、淋巴结树突状细胞的活化、淋巴结中PCV-2抗原及血清 中细胞因子IFN-γ、了陬-€[、几-12口70、几-4和几-17含量变化。
[0078] (2)灵芝多糖脂质立方液晶对抗体水平及抗体亚型水平的影响
[0079] 通过对比3中不同剂量的灵芝多糖脂质立方液晶（Cub-PSdXCub-PSdXCub-pS)，发现低剂量组 (Cub-PS) 产生了最高的抗体水平 （图 3A)， 因此，后续试验对低剂量的灵 芝多糖脂质立方液晶组进行了着重的免疫分析。首免后第7天，各组之间的抗体水平并没有 明显的差异;然而在首免后第14、21天，(]1113-?3-48组的抗体水平显著高于?3-48组和(]1113-八区 组(P〈0·05)(图3B);另外，在首免后第21天Cub-PS-Ag组的IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3是所有 组中最高的，且显著高于其他各组(P〈〇. 05)(图3C和D)。
[0080] 注:*ρ<0· 05表示Cub-PS-Ag组与PS-Ag组对比，#ρ<0· 05表示Cub-PS-Ag组与Cub-Ag组对比。
[0081 ] (3)灵芝多糖脂质立方液晶对血清中细胞因子的影响
[0082] 首免后第7天至21天，Cub-PS-Ag组的IL-4浓度是最高的，显著高于PS-Ag组和Cub- Ag组(P〈0.05)(图4A);首免后第7天至21天，Cub-PS-Ag组IFN- γ的浓度是最高的，且显著高 于卩3-六8组和(：1*48组(？〈0.05)，同时在第14、21天，(：1113-?348组正1丫的浓度已经高于阳 性对照组（图4C);首免后第7天至21天，Cub-PS-Ag组TNF-α和IL-17的浓度均显著高于PS-Ag 组和Cub-Ag组。
[0083] 注:*ρ<〇·05表示Cub-PS-Ag组与PS-Ag组对比，#ρ<0·05表示Cub-PS-Ag组与Cub-Ag 组对比。
[0084] (3)灵芝多糖脂质立方液晶对小鼠淋巴结中成熟树突状细胞比例的影响
[0085] 作为最主要初级免疫反应场所的淋巴结在疫苗免疫过程中发挥着及其重要的作 用。抗原在注射进动物机体后，其迀移至淋巴结的效率与诱导机体产生有效的免疫反应息 息相关。有效的疫苗递载系统类佐剂能够明显的提高抗原递呈细胞摄取抗原、运载抗原至 淋巴结及递呈抗原到T淋巴细胞。首免后的24h、48h，PS-Ag组和Cub-Ag组显著地促进了小鼠 淋巴结中成熟树突状细胞的比例，Cub-PS-Ag组淋巴结中成熟树突状细胞的比例显著高于 PS-Ag组和Cub-Ag组（图5 )，表明了PS-Ag组和Cub-Ag组能有有效的促进成熟树突状细胞的 归巢从而更加有效的将抗原递呈给淋巴细胞，进一步引起强烈的免疫反应。
[0086] 首免后的第七天，Cub-PS-Ag组小鼠淋巴结中的抗原明显的多于PS-Ag组和Cub-Ag 组，表明Cub-PS-Ag组能够产生一个持续的抗原释放，从而不断刺激机体的免疫系统，从而 增强机体的免疫应答。
[0087]图6表明首免后的第7天，Cub-PS-Ag组小鼠淋巴结中分化的中心记忆细胞和效应 记忆细胞的比例均显著高于PS-Ag组和Cub-Ag组，表明了Cub-PS-Ag组在引起长效的免疫应 答方面比PS-Ag组和Cub-Ag组具有更大的潜力。
[0088]根据上述动物试验结果可以得出灵芝多糖脂质立方液晶可以提高小鼠机体IgG抗 体水平、不同亚型抗体含量、淋巴结树突状细胞的活化、淋巴结中PCV-2抗原及细胞因子 IFN-γ、TNF-a、IL-4和IL-17含量，从而提高机体免疫功能，说明本发明涉及的灵芝多糖脂 质立方液晶可用于提高动物机体免疫功能以达到抵抗疾病的目的。
【主权项】
1. 一种灵芝多糖脂质立方液晶的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤： (1) 取植烷三醇和丙二醇溶于乙醇中备用； (2) 取PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物和灵芝多糖溶于水中备用； (3) 将步骤（1)所得的混合体系滴加至步骤(2)所得的混合体系中并搅拌，旋转蒸发除 去乙醇后，经超声处理得到灵芝多糖脂质立方液晶混悬液。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，植烷三醇和丙二醇的质量 比为1~2:1，植烷三醇和乙醇的固液比为30~100mg:lmL;其中，所述的乙醇为无水乙醇。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，PEO-PPO-PEO三嵌段共聚 物和灵芝多糖的质量比为1~2:1~2，PE0-PP0-PE0三嵌段共聚物和水的质量比为1:50~ 200 〇4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，步骤（1)所得的混合体系 和步骤(2)所得的混合体系的体积比为1:4~10。5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的滴加，滴加流速为1~2mL/min。6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，搅拌方法为室温下300~ 800r/min 揽摔 lh。7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，超声处理的方法为:使用 细胞超声粉碎仪，在300W功率下超声20~30次，每次3~5min，两次超声间隔2~5s。8. 权利要求1~7中任意一项制备得到的灵芝多糖脂质立方液晶。9. 权利要求8中所述的灵芝多糖脂质立方液晶在制备提高机体免疫力的药物中的应 用。
【文档编号】A61P37/04GK105997865SQ201610328083
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】王德云, 刘振广, 伯若楠, 胡元亮, 刘家国, 武毅
【申请人】南京农业大学