环孢素a滴眼液及其制备方法

环孢素a滴眼液及其制备方法
【专利摘要】本发明属于高分子化学、生物医用材料与药学技术领域，具体公开了一种环孢素A滴眼液及其制备方法。每1000 mL滴眼液由下述物质制备而成：环孢素A 30~630mg、高分子接枝共聚物1~10g，余量为注射用水；其中，所述高分子接枝共聚物为壳聚糖?g?环糊精。首先，称取高分子接枝共聚物壳聚糖?g?环糊精，向其中加入溶解当量的注射用水，搅拌溶解至透明的溶液；然后，将环孢素A的乙醇溶液加入到上述溶液中，0~4℃搅拌至体系完全变为澄清；再次，0~4℃减压除去乙醇，洗涤；最后，再加注射用水定容，灭菌，即得。本发明滴眼液具有以下优势：降低药物的刺激性、延长药物在眼表的滞留时间、提高药物的角膜透过性、增加药物的治疗效果。
【专利说明】
环孢素A滴眼液及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于高分子化学、生物医用材料与药学技术领域，具体涉及一种环孢素 A滴 眼液及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 由于众多优点，滴眼液点眼一直是眼用药物给药的首选方法。然而，眼睛特殊的生 理结构形成了泪膜屏障和角膜屏障等，严重地限制了药物的透过性。增强滴眼液的角膜穿 透性一直是眼科药物研究开发中极具有挑战性和亟待解决的问题。提高疏水性药物的溶解 度、提高药物眼表滞留时间、增加缓释性能、改善药物的透过机制等成为解决眼表给药存在 问题的关键，常规的药物剂型已经无法突破存在的瓶颈作用。因此，开发新型的眼表给药系 统变得刻不容缓。
[0003] 环孢素 A(Cyclosprin A, CsA)是一种强效免疫抑制剂，广泛用于防治器官移植排 斥反应以及多种自身免疫性疾病的防治，并在抑制角膜移植排斥反应和治疗许多包括干眼 和自身免疫性葡萄膜炎在内的免疫性眼科疾病中发挥重要作用。眼药水局部点眼是治疗角 膜移植排斥反应、干眼综合征和春季角结膜炎等眼前节疾病的主要给药方式。然而，CsA结 构独特，是一个环状的十一肽化合物，存在四个分子间氢键，分子量较大（1203 Da)。因而， CsA的生物药剂学性质较差，水中溶解度低(25°C的溶解度是6.6 mg/L)，生物学屏障的透过 性差。在大多数研究中，CSA-般通过溶解在植物油(蓖麻油)或添加表面活性剂(Cremophor EL或Tween 80)，才能实现应用。目前，只有一个商业可用的眼用CsA制剂Restasis? (0.5 mg/mL CsA; Allergan Inc, Irvine, CA, USA)，这是一种水包油型滴眼液，用蓖麻油和 Tween 80混合物实现增溶。然而，这些溶媒造成的眼部耐受性差(包括瘙痒，发红，视觉模糊 和眼睛疼痛等症状），从而使得药物的生物相对利用度较低。为了提高CsA的眼部应用性和 提高耐受性，许多研究者尝试各种药物剂型来改善这种状况，包括胶体载药体系(胶束、乳 剂、脂质体、纳米颗粒）以及水溶性潜药策略等。然而，几乎所有的传输系统都不能实现完全 满意，因而，环孢素 A在眼科应用仍然是眼科研究中的一个挑战，还有很大的提升空间。 [0004]壳聚糖(chitosan，CS)是一种高分子氨基多糖，分子链上丰富的羟基和氨基使其 易发生化学反应而具备多种功能。壳聚糖具有良好的生物相容性和可生物降解等特点，在 生物医学领域和药学领域有着极广泛的应用前景。同时，CS还具有广谱抗菌活性和消炎等 作用。壳聚糖及其衍生物是新型的药物制剂原料，可作为缓控释制剂载体、靶向制剂载体和 滴眼剂增稠剂等。近年来，壳聚糖还被广泛用于生物大分子药物给药体系中。环糊精是 (cyclodextrin，CD)是一种环状低聚糖，最常用的三种环糊精分别是含有6、7、8个葡萄糖基 的α、β、γ-CDXD因其特殊的分子结构，具有对有机和无机小分子的超分子识别作用，以及 其无毒和可生物降解等性能，目前广泛应用在药物制剂中。环糊精及其衍生物具有以下方 面的应用:增加药物的水溶性、提高药物的稳定性、提高药物的生物利用度、促进药物吸收、 减轻药物对机体的刺激和副作用等。CS和CD都是FDA批准的药物材料。
[0005]因此，如能将环孢素 A、壳聚糖和环糊精应用到滴眼液中无疑具有显著的临床意 义。

【发明内容】

[0006] 为克服现有环孢素 A制剂存在的问题，本发明的目的在于提供一种无刺激性、载药 量高、延长药物在眼表的滞留时间、角膜透过性好的环孢素 A滴眼液及其制备方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下： 一种环孢素 A滴眼液，其特别之处在于，每1000 mL滴眼液由下述物质制备而成：30~ 630mg、高分子接枝共聚物1~10g，余量为注射用水;其中，所述高分子接枝共聚物为壳聚糖-g-环糊精(简称CS-g-O))。
[0008] 壳聚糖-g-环糊精中，环糊精为α-环糊精、β-环糊精或γ -环糊精。
[0009] 壳聚糖-g-环糊精中，环糊精的接枝率为15~85%。
[0010] 所述滴眼液的制备方法:首先，称取高分子接枝共聚物壳聚糖-g-环糊精，向其中 加入溶解当量的注射用水，搅拌溶解至透明的溶液;然后，将环孢素 A的乙醇溶液加入到上 述溶液中，〇~4°C搅拌至体系完全变为澄清;再次，0~4°C减压除去乙醇，洗涤;最后，再加注 射用水定容至l〇〇〇mL，灭菌，即得滴眼液。
[0011] 壳聚糖-g-环糊精(CS-g-⑶)可按现有技术制备，包括以下步骤： 51. 合成CD-C00H(单羧基功能化的环糊精）：通过氯乙酸钠(CICHAOONa)定量功能化 环糊精(⑶)的羟基，随后以盐酸(HC1)进行酸化； 52. 合成CS-g-CD:将单羧基功能化的环糊精通过酰胺化反应，精确控制投料比，接枝 到壳聚糖聚合物链上，得到不同接枝率的CS-g-CD。
[0012] 具体地，步骤为： S1.合成⑶-C00H:首先，⑶和NaOH放入烧瓶中，用蒸馏水溶解后，加入计算量的氯乙酸 钠，50°C下反应5h;然后用盐酸将体系pH调节至7，加入过量有机溶剂，将沉淀物过滤，干燥 后既得CD-C00H; S2 .合成CS-g-CD:将⑶-C00H和NHS用蒸馏水溶解，并放置在配有磁力搅拌棒的烧瓶 中，烧瓶置于4°C水浴中，加入EDC，4°C下反应2h;缓慢加入壳聚糖水溶液，4°C下反应lh，室 温下反应24h;过滤，透析，冻干得到CS-g-⑶。
[0013] 目前环孢素 A常用剂型，为了提高其生物药剂学性能和溶解度，使用植物油（蓖麻 油)或添加表面活性剂来进行增溶，但是这些溶媒易造成严重的刺激反应和较差的眼部耐 受性，而本发明中，环孢素 A的药物剂型为澄清的水溶液。
[0014] 本发明实现了环孢素 A的有效负载，极大地提高了环孢素 A的表观溶解度。该新型 滴眼液，可有效降低药物的刺激性，延长药物在眼部的滞留时间，增加眼部应用后的耐受 性；同时在该新型滴眼液体系中，药物分子以分子形式存在于体系中，非常有利于发挥药物 本身的作用，从而增加新型滴眼液的治疗效果;动物试验也证明，该新型滴眼液在眼部应用 时能提高药物的角膜透过性，发挥治疗作用。
【附图说明】
[0015] 图 1:CS，CD以及CS-g-CD的1H NMR 谱图。
[0016] 图2: CS，CD以及CS-g-CD的红外谱图。
[0017] 图3:局部滴眼后药物在兔眼角膜(a)和房水(b)中的药物浓度，其中E-0.5h、E-lh 分别代表实验组滴眼0.5h、lh，C-0.5h、C-lh分别代表对照组滴眼0.5h、lh。
[0018] 图4:C57BL/6鼠点眼后的角膜透过行为双光子显微镜检测图。
【具体实施方式】
[0019] 在下面具体实施例的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本 发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，因此本发明不受下面公开的具体 实施例的限制。
[0020] 实施例1-接枝共聚物的合成 高分子接枝共聚物，其分子式为:cs-g-⑶。
[0021] 合成路线为：
合成步骤： 51. 合成⑶-C00H:首先，将9.73 g α-⑶和7.2 g氢氧化钠放入烧瓶中，用30 mL蒸馏 水溶解;加入1.165 g氯乙酸钠，50°C下反应5h;然后用盐酸将体系pH调节至7，加入过量的 甲醇沉淀，将沉淀物物过滤，真空干燥仪40 °C干燥过夜，既得白色粉末状⑶-C00H，产率：> 96% ； 52. 合成CS-g-CD:将10 mmol CD-C00H和11 mmol NHS用50mL的蒸馏水溶解，并放置在 配有磁力搅拌棒的烧瓶中，烧瓶置于4°C水浴中，加入11 mmol EDC，4°C下反应2h;缓慢加入 计算量的壳聚糖水溶液(CS含-NH2的量是12~33 mmol)，4°C下反应lh，室温下继续反应24h; 过滤出去不溶物，透析袋透析48h，冷冻干燥得到CS-g-⑶，产率:> 80 %。
[0022] S1-S2中，CS，CD以及CS-g-CD的1H NMR谱图见图1;CS，CD和CS-g-CD的红外谱图见 图2。
[0023] 图1中：出现在2.7~2.9 ppm的尖峰是壳聚糖CS的特征峰；出现在4.9~5.0 ppm的尖 峰是环糊精⑶的特征峰;通过⑶、CS二者特征峰面积之比，可以计算出：当CS含-NH2的量是 12mmol时，CD的接枝率为79%;CS含-NH2的量是13mmol时，CD的接枝率为70%;CS含-NH2的量 是16mmol时，CD的接枝率为50%;CS含-NH 2的量是33mmol时，⑶的接枝率为27%;⑶的接枝 率可以实现从27%到79%的有效控制。1 H NMR结果表明，成功地合成了接枝共聚物CS-g-CD。
[0024] 图2中：CS和⑶的特征吸收峰分别在2930 cnf1和1740 cnf1，显然，这两个特征峰存 在于最终的接枝共聚物CS-g-CD中。红外光谱谱图结果表明，成功地合成了接枝共聚物CS-g-CD 〇
[0025] 实施例2- 0.06 wt%环孢素 A滴眼液的制备 首先，称取实施例1 CD接枝率50%的接枝共聚物CS-g-CD 2克，向其中加入500mL注射用 水，搅拌溶解至透明的溶液;然后，将环孢素 A的无水乙醇溶液(4 mg/mL)50 mL加入到上述 溶液中（1:10，￥八），低温下(4°〇搅拌至体系完全变为澄清，过滤除去不溶物(031^0用量 少，环孢素 A不完全与之发生络合，此处过滤作用主要除去没有发生络合的环孢素 A);再次， 低温下(4°C)减压除去无水乙醇，超滤管(截留分子量3.5k)洗涤3次;最后，再加注射用水定 容250 mL，灭菌，即得滴眼液，高效液相色谱法测得该滴眼液浓度为0.06wt%，储存温度为低 温下(4°C)。
[0026] 现有文献报道环孢素 A在水中的溶解度是6.6 mg/L，本发明可以提高到630 mg/L， 采用本发明所述的方案可将环孢素 A在水中的溶解度提高95倍。
[0027] 对照例一0.06 wt%环孢素 A的β-环糊精络合物滴眼液的制备 将20 g水溶性β-环糊精加入到100 mL注射用水中，搅拌溶解后，加入60 mg环孢素 Α(水 溶性β-环糊精用量大，可使环孢素 A完全与之发生络合)加入到上述溶液中，搅拌溶解，0.45 微米无菌滤头过滤，即得。
[0028]性能测试： 1、药代动力学研究 采用新西兰白兔进行角膜上皮完整情况下的眼部药动学及组织分布实验，随机等分为 2组:对照组和实验组。采用突击剂量给药方式，每次滴眼50μ1，一共给五次，每次时间间隔 为5分钟。其中，对照组滴对照例的0.06 wt%环孢素 Α的β-环糊精络合物滴眼液，实验组滴实 施例2的0.06 wt%环孢素 Α滴眼液(简称本发明滴眼液）。滴眼后，在不同时间麻醉处死动物 后，采用高效液相色谱-质谱联用技术测定角膜和房水中的药物浓度。不同时间兔眼角膜和 房水中的药物浓度见图3。
[0029]由图3可知：本发明滴眼液的0.5h时间点的角膜和房水药物浓度与对照组差异不 显著;本发明滴眼液的lh时间点的角膜平均浓度是对照组对应时间点的1.5倍，而本发明滴 眼液的lh时间点的房水平均浓度是对照组对应时间点的3.3倍，本发明滴眼液lh时间点的 角膜和房水药物浓度均显著高于对照组。结果表明本发明滴眼液具有很好的角膜透性。 [0030] 2、动物角膜内药物代谢和透过过程研究 发明人以C57BL/6小鼠为研究对象，采用荧光双标记的方法，进行了动物角膜内药物代 谢和透过过程研究。
[0031] 双荧光标记滴眼液的制备：将0.05mg香豆素6(C6)和0.05mg Cy5-PEG活性酯（可 与cs-g-⑶发生络合)加入到10 mg实施例1⑶接枝率79%的cs-g-⑶的2mL水溶液中，室温下 反应过夜;过滤除去不溶物，再通过超滤离心过滤装置(截留分子量：1，〇〇〇 Da)重复洗涤 浓缩3次以除去游离的Cy5-PEG活性酯，得双荧光标记的聚合物溶液体系;该溶液和生理盐 水以1:9的体积比混合，即制成双荧光标记的滴眼液。
[0032]实验过程:通过腹膜内注射戊巴比妥钠(85毫克/公斤体重）（Sigma-AldriCh公司， 美国）将C57BL/6小鼠麻醉。利用塑料眼杯罩在小鼠的眼睛上，利用凡士林进行密封。接着将 双荧光标记滴眼液滴入眼杯，静置半小时，然后用0.9%的食盐水漂洗三次角膜，将小鼠放置 在一个塑料板上，用胶带将头部和四肢固定，眼杯用0.9%食盐水溶液浸泡然后进行体内双 光子3D成像。使用蔡司LSM 780 NL0荧光成像系统。
[0033] C57BL/6鼠点眼后的角膜透过行为双光子显微镜检测图见图4,由结果可以看出， 滴眼液作用后，聚合物载体(Cy5-PEG活性酯，红色标记部分）主要滞留在角膜上皮层，而荧 光药物(C6，绿色标记部分)随时时间延长逐渐向角膜深层基质扩散。这表明：本发明滴眼液 可以增加药物的角膜透过性。
[0034] 3、滴眼液载药量、渗透压和粘度测定 滴眼液中药物的载药量被定义为药物在滴眼液中的重量百分比。将实施例2的0.06 wt%环孢素 A滴眼液(简称本发明滴眼液）用甲醇稀释制备样品，用HPLC检测样品的浓度。 其中HPLC所用的色谱柱型号为Waters 2695公司，配有X-BridgeTM C18 column (3.5 μ m, 3.0 mm X 150 mm, Waters, USA) and UV/vis 检测器，流动相为甲醇和水（V:V = 65:35)，流速为0.6 mL/ min，柱温为40 °C，注射样品量为20yL，检测波长为225 nm。根据 事先做好的环孢素 A标准曲线来计算。
[0035] 采用渗透压测定仪(Gonotec, Osmometer 030)测量滴眼液的渗透压。
[0036] 采用粘度测定仪(Brookfield，DV-H+Pro)测定滴眼液的粘度。
[0037] 结果表明：本发明环孢素 A的载药量为0.06 wt%;渗透压为305 mOsmol/Kg;粘度为 36.5 cP〇
【主权项】
1. 环孢素 A滴眼液，其特征在于，每lOOOmL滴眼液由下述物质制备而成：环孢素 A 30~ 630mg、高分子接枝共聚物1~10g，余量为注射用水;其中，所述高分子接枝共聚物为壳聚糖-g_环糊精。2. 如权利要求1所述的滴眼液，其特征在于:壳聚糖-g_环糊精中，环糊精为α-环糊精、 环糊精或γ-环糊精。3. 如权利要求1所述的滴眼液，其特征在于:壳聚糖-g_环糊精中，环糊精的接枝率为15 ~85%〇4. 一种制备如权利要求1-3之任一所述滴眼液的方法，其特征在于:首先，称取高分子 接枝共聚物壳聚糖-g_环糊精，向其中加入溶解当量的注射用水，搅拌溶解至透明的溶液； 然后，将环孢素 A的乙醇溶液加入到上述溶液中，0~4 °C搅拌至体系完全变为澄清;再次，0~4 °C减压除去乙醇，洗涤;最后，再加注射用水定容，灭菌，即得滴眼液。
【文档编号】A61K47/48GK105997863SQ201610576789
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月21日
【发明人】栗占荣, 李景果, 张俊杰, 周天洋, 何继军, 夏慧芸, 王丽娅
【申请人】河南省眼科研究所