高纯度4-羟基环孢素及其提纯制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药领域，尤其涉及利用生物转化法制得4-羟基环孢素发酵液 后再提取制备高纯度4-羟基环孢素的方法。
【背景技术】
[0002] 4-羟基环孢素（简称4-OH环孢素）是新型抗丙肝病毒药物的重要医药中间体， 主要针对丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV)感染引起的病毒性肝炎。据世界卫生组织统计，目前全球HCV的感染率约为 3 %，估计约1. 8亿人感染了 HCV，每年新发丙型肝炎病例约为3. 5万例。丙型肝炎呈全球性 流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至细胞癌（HCC)。一 些数据显示，未来20年内与HCV感染相关的死亡率将持续增长，对患者的健康和生命危害 极大，已成为严重的社会的公共卫生问题。4-OH环孢素是合成新型抗丙肝病毒药物重要的 医药中间体。
[0003] 4-OH环孢素结构式：
[0004]
[0005] 4-OH环孢素发酵产品中的主要杂质是未转化的环孢菌素及其同系物，其去除难度 高，经检索未发现有如何去除这些杂质以得到高纯度的4-OH环孢素的相关文献。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是在于提供一种高纯度4-OH环孢素及其提纯制备方法，以达到低 成本、高效率的提纯4-OH环孢素。
[0007] 本发明是这样实现的：
[0008] 高纯度4-羟基环孢素的提纯制备方法，包括如下步骤：
[0009] (1) 4-羟基环孢素的提取
[0010] 向4-羟基环孢素发酵液中加入有机溶剂，常温下浸提2至4小时，滤出菌体得浸 提液；
[0011] ⑵脱色介质脱色
[0012] 脱色介质装柱，浸提液用脱色柱进行脱色处理，得到脱色液；
[0013] (3)吸附介质富集
[0014] 脱色液用吸附介质进行吸附富集，洗涤剂处理上样后的吸附介质，然后用解析剂 进行解析并收集解析液，解析液浓缩后用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯相浓缩待用；
[0015] (4)高压层析制备
[0016] 将乙酸乙酯浓缩液进行高压层析制备，用乙腈水混合溶剂洗脱，收集4-羟基环孢 素；
[0017] (5)结晶纯化
[0018] 4-羟基环孢素经浓缩，萃取后进行结晶，结晶液放置，直至目测出现晶体析出，抽 滤结晶液，用异丙醚洗涤，最后干燥得无色粉末状4-羟基环孢素精粉。
[0019] 本发明中，步骤（1)中所用有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或多种，所用 有机溶剂用量与发酵液体积比为1:1 _1: 2。
[0020] 本发明中，步骤（2)中所用脱色介质为阴离子交换树脂D290、RX-01T或RX-02T ; 步骤（3)中所用吸附介质为大孔吸附树脂HZ830、HZ801或HZ816。
[0021] 本发明中，步骤（3)中所用洗涤剂依次为45%甲醇一碱（lg/L NaOH)、45%甲醇； 所用解析剂为80% -85%甲醇。
[0022] 本发明中，步骤（4)中所用填料为120A ΙΟμπι C18。
[0023] 本发明中，步骤（4)中所用流动相配比为乙腈：水=50~70 :50~30。
[0024] 本发明中，步骤（4)中所用流动相配比为乙腈：水=65:35。
[0025] 本发明中，步骤（5)中所用结晶剂为丙酮：异丙醚=0~10:100~90。
[0026] 本发明中，步骤（5)中所用结晶剂为丙酮：异丙醚=5:95。
[0027] 本发明中，步骤（5)中4-羟基环孢素的真空干燥温度为40-65Γ。
[0028] 本发明的4-羟基环孢素 XRD图如图2所示。
[0029] 本发明采用离子交换树脂脱色，大孔吸附树脂富集，高压层析纯化的方法，各阶段 选择特定工艺并互相配合取得了良好的技术效果。本发明采用阴离子树脂脱色技术，有效 去除了浸提液中的色素，为之后的纯化工作降低了难度；采用大孔吸附树脂层析技术，对 4-OH环孢素起到了明显的浓缩富集作用，4-OH环孢素的浓度经富集可提高近25倍。采用高 压层析技术，大大缩短了工艺周期，现有的常压硅胶层析方法周期长，约为3-5天左右，载 样量为0. 5%，溶剂使用量约为20倍柱体积，且所使用洗脱剂为混合有机溶剂，不易回收和 重复利用；高压层析方法周期短，约为1-2小时左右，载样量为1 %，溶剂使用量约为10倍 柱体积，所使用溶剂为乙腈、水，易于回收，降低了使用洗脱剂成本，大大节省了生产周期。 使用单一有机溶剂及水作为流动相，较常压硅胶层析使用混合有机溶剂易于溶媒的回收， 节约了成本。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明的4-OH环孢素的提纯工艺路线图。
[0031] 图2为4-OH环孢素精粉的XRD图。
[0032] 图3为4-OH环孢素精粉的DSC图。
[0033] 图4为4-OH环孢素精粉的TGA图。
[0034] 图5为4-OH环孢素精粉的拉曼光谱图。
[0035] 图6为4-OH环孢素精粉的红外光谱图。
[0036] 图7为实施例1制得的4-OH环孢素精粉的的高压液相色谱图。
[0037] 图8为实施例2制得的4-OH环孢素精粉的的高压液相色谱图。
[0038] 图9为实施例3制得的4-OH环孢素精粉的的高压液相色谱图。
【具体实施方式】
[0039] 本发明所使用高压液相设备为江苏汉邦科技有限公司产品，检测器：NU3000 SERIALS UN/VIS DETECTOR,输液栗：NP7000 SERIALS PUMB，柱：DAC-HB 动态轴向压缩柱。
[0040] 下面结合图1，对本发明进行进一步说明：
[0041] 本发明第⑴步进行4-OH环孢素的提取：
[0042] 向4-OH环孢素发酵液中加入有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或多种，优 选为甲醇，常温下浸提2至4小时，滤出菌体得浸提液。
[0043] 本发明第（2)步利用脱色介质脱色：
[0044] 脱色介质装柱，浸提液用脱色柱进行脱色处理，得到脱色液。
[0045] 对不同型号树脂进行了 4-OH环孢素动态脱色实验，确定了 D290、RX-01T和RX-02T 脱色效果较好，且对4-OH环孢素无吸附，其中优选RX-02T树脂。
[0046] 本发明第（3)步利用吸附介质富集：
[0047] 脱色液用吸附介质进行吸附富集，洗涤剂处理上样后的吸附介质，然后用解析剂 进行解析并收集解析液，解析液浓缩后用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯相浓缩待用。
[0048] 对不同型号树脂进行了 4-OH环孢素静态吸附-解吸实验，确定了 HZ830、HZ801和 HZ816的吸附和解吸效果较好，其中优选HZ816树脂。
[0049] 上样后的树脂洗涤剂依次为45%甲醇一碱（lg/L NaOH)、45%甲醇，经实验验证使 用45 %甲醇一碱（1 g/L NaOH)(向洗涤剂45 %甲醇中按1 g/L加入NaOH使得每升45 %甲醇 中含有lg NaOH)作洗涤剂，可以更有效的去除吸附在树脂上的杂质，乙酸乙酯相浓缩后的 粗品含量更高，有效降低了后期纯化步骤的压力。
[0050] 洗涤后的树脂洗脱剂为80% -85%甲醇，优选85%甲醇，洗脱体积约为1. 5~2倍 柱体积。
[0051] 本发明第⑷步高压层析制备：
[0052] 将乙酸乙酯浓缩液进行高压层析制备，用乙腈水混合溶剂洗脱，收集合格的4-OH 环孢素。
[0053] 高压层析选用C18填料，粒径10 μπι，孔径120A，所用流动相配比为乙腈：水= 50~70 :50~30,优选乙腈：水=65:35,当柱床体积为300ml时，上样液为20ml，4-0Η环 孢素上样浓度为4 X 105-5 X ΙΟ5 μ g/ml，优选5 X ΙΟ5 μ g/ml，洗脱流速为50-90ml/min，优选 80ml/min，用HPLC检测流出液，收集合格产品。
[0054] 本发明第（5)步结晶纯化：
[0055] 合格部分经浓缩，萃取后进行结晶，结晶液放置，直至目测出现晶体析出，抽滤结 晶液，用异丙醚洗涤，最后干燥得无色粉末状4-OH环孢素精粉。
[0056] 洗脱液在50°C -60°C条件下减压浓缩至干，加入少量结晶剂，结晶剂配比为丙酮： 异丙醚=0~10:100~90,优选丙酮：异丙醚=5:95,置于室温条件下结晶，用异丙醚洗涤 后40°C -60°C条件下干燥至恒重。
[0057] 实施例1
[0058] 1)取4-OH环孢素发酵液30L，含4-OH环孢素10. 2g，加入30L异丙醇浸泡5小时， 板框过滤，收集浸提液58L，效价为173 μ g/ml。
[0059] 2)将收集到的浸提液，用1L D290树脂作为脱色介质进行脱色，流速为2BV/h，收 集脱色液，脱色液明显较上柱前浅。
[0060] 3)将收集到的脱色液，使用1L HZ816柱进行吸附，上样流速为lBV/h，吸附完毕后 检测下柱液效价为lμg/ml，废